解剖と実装<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイディスク

サマリー

この技術の目標は、研究者があらゆる年齢のショウジョウバエの眼板の解剖、免疫染色、および装着を行うことを可能にすることです。

要約

Drosophila melanogaster eye discは、多くの異なる生物学的プロセスを研究するために使用できる強力なシステムです。 これには、ommatidia¹と呼ばれる約800の個別の眼球ユニットが含まれています。 各オマチジウムには、第3幼虫^{のインスター2}の形態形成溝の通過後に未分化細胞から発生する8つのニューロン光受容体が含まれています。 光受容体の逐次分化に続いて、錐体細胞や色素細胞などの非神経細胞が発達し、機械感覚剛毛細胞³も発生します。 すべてのオマチディアル細胞タイプの構造化された配置、未分化細胞タイプのプログラム細胞死、およびロドプシン発現を含む最終的な分化プロセスは、蛹フェーズ^4〜7を通じて発生します。この技術は、蛹性眼板の操作に焦点を当てており、一般的に解剖される第3のインスター眼椎間板よりも本質的に実行が難しい蛹期の眼板を解剖する方法についての洞察と指導を提供します。 この技術は、さまざまなタンパク質やその他の細胞成分の可視化を可能にするための免疫染色の詳細も提供します。

概要

キイロショウジョウバエ ：発達と細胞生物学の分野が大幅にモデル生物の影響を受けてきた。このモデルの中では、目のディスクの研究はシグナル伝達、細胞生物学やその他の分野に関する知識を大いに貢献してきました。後半に第三の幼虫齢目のディスクが広く研究し、それが発達期間の一連のスナップショットを与えるように、利用するための強力なモデルであるされている、独自のシグナリング分子、およびプロセスとのそれぞれが、形態形成溝は、目のディスクを横切って進むにつれて^8。しかし、更なる発展の蛹の段階に発達過程の理解を拡大する必要性がある。蛹のアイディスク^3-7の研究がなされてきた一方で、私たちの知識は3齢目のディスクに行われている仕事の幅広さに近づかない。これは、蛹のアイディスク解剖で大きな困難に一部起因している。したがって、プレゼンテーション解剖の適切な方法が大幅にこの分野の研究を展開することができます。

簡単に、特に中旬蛹期間を中心に、解剖された蛹のアイディスク開発中の段階がありますが、他の期間は、はるかに困難な解剖べきである。このプロトコルは、普遍的にすべての蛹の発育時間枠のために使用することができる蛹目ディスクを切開するための1つの方法を表している。このプロトコルは、midpupal時点から目ディスクを分析するための簡単かつ迅速に方法を示す別のプロトコル⁹の代替として使用することができる。このプロトコルは、も....

プロトコル

この手順では、2日間の処置である。

1日目（2時間+解剖時間）

1.蛹アイディスク解剖

1. 解剖用の蛹を選択します。
   注：解剖する蛹の年齢は実験的なニーズによって決定されます。しかし、細胞の形態を検査した場合、これはしばしば、ビデオに示す蛹の年齢である25℃、蛹殻形成（APF）の後42時間で行われる。濡れた絵筆で（0時間APF考えられる）白い蛹を収集し、25℃に維持し、新しいフライ食品バイアル中で（収集時間に基づいて）時系列順に並べ。できるだけ近い蛹間の時間差を維持するために、この同じ時系列順に熟成蛹を解剖。
2. シリコーン解剖板上のリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4で、レシピの材料を参照のこと）の低下に蛹を転送する。
3. 鉗子やピアスと蛹のケースの上部を持ち、Lを開く鋭いピンセットで蛹ケースのower部分。新たに形成された穴にケースから蛹を削除します。
4. 蛹でハサミで斜めカット、半ば胸部を作る。破片を除去またはPBSの新しいドロップに蛹ヘッドを移す。ピペット送風管を使用してクリーニングし（詳細は材料および図1を参照）、必要に応じて追加のPBSを加える。脱水症状を避けるために確認してください。
5. しっかりとグリップピンセットで蛹頭部キューティクルの最上部。送風管の先端を使用して、穏やかに蛹のケースから、....

結果

このプロトコルの使用例として、異なる抗体で免疫染色midpupalを示す結果（42時間APF 25°Cで）眼のディスクはホスホチロシン残基に対する抗体を使用することにより、図2に示されている、細胞の膜とすることができる観測された（ 図2A）。これはmidpupal段階の前に発生する最後のパターニングプロセス以下蛹眼の個眼細胞の規則的な配列を同定するために用いることができる。別の代表的な画像は、錐体細胞の核がカット転写因子（ 図2B）に対する抗体を用いて同定されることができ示す。

図1：解剖手順で使用送風管のアセンブリー·ダイアグラム番目の詳細については、材料のセクションを参照してください送.......

ディスカッション

このプロセスはシンプルで簡単に実行できるように見えますが、実際には、このテクニックを習得するには多くの練習が必要です。 私たちは日常的に、生徒は、はるかに扱いやすい 3 齢目の円盤¹² を解剖して取り付ける方法を学ぶことから始めます。 この練習は、腕、手、指の適切な解剖位置を開発するのに^役立ち、 解剖顕微鏡下での鉗子の操作が安定し、簡単で、経験豊富になります。 本質的に、練習期間は鉗子を指と親指の自然な延長にし、解剖に必要な個別かつ微妙な動きを可能にするという目標を達成する必要があります。

PBSを使用してマウントする場合は、少量のPBSがマウントプロセスですぐに蒸発するため、常に追加のPBSを用意してください。 もう 1 つの一般的な問題は、Fix ソリューションでアイ ディスクが折りたたまれ、アイ ディスクがその方向に固定されることです。 これは、アイディスクをフィックス溶液に完全に沈める前に、アイディスクをフィックス溶液の表面にしばらく(通常は次のアイディスク解剖の長さ)浮かべることで回避できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)			80 g NaCl、2g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4、ボリュームを1 μにします。l、pHを7.4に調整し、オートクレーブまたはフィルター滅菌し、オートクレーブ滅菌したddH2< / sub>OでPBSに希釈してから使用してください。
トリトン X-100	プロメガ	H5142	注意:刺激性!手袋を着用してください。
0.3% PBT			1.5 ml の Triton X-100、500 ml 1X PBS。
37%ホルムアルデヒド溶液	フィッシャーサイエンティフィック	F75P1GAL	注意:有毒で、おそらくヒトの発がん性物質!手袋を着用してください。
解決策			を修正(≈PBS中の4%ホルムアルデヒド) 50 μl 37% ホルムアルデヒド、450 μl 1x PBS、使用前に新鮮に作る
正常なヤギ血清	ロックランド抗体&アッセイ	B304	アリコート 1mlの容量で-80 °で保存します。C
ブロック溶液			PBT中の10%NGS。これは4°で作成および保管できます。Cは使用前に数日間。
DAPIストックソリューション	Life Technologies	D3571	核の染色に用。ddH2Oを含む1 mg/ml溶液を調製します。
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting
medium Glycerol	Sigma	G5516	マウント用。ddH2Oで70%希釈液を調製します。
装置
:章動	ミキサーVWR	82007-202	3ウェルガラス皿で組織を揺るがすために使用されます
シルガード182シリコーンエラストマーキット	クレイデン	NC9897184	シリコーン解剖皿を作るために使用されます
シリコーン解剖皿 シリコーン解剖皿			を作るために使用シルガードエラストマーキット(上)を指示に従って穏やかに混合します(気泡を避けるため)。混合物をペトリ皿(任意のサイズ)に注ぎます。シルガードが37°Cで一晩硬化するのを許します。Cインキュベーター。
3ウェルガラス皿	コーニング	7220-85	3ウェルの品種はもう利用できません、これは9ウェル製品です。
72ウェルマイクロウェルミニトレイ	Nunc	438733
シャープ鉗子(デュモン#55)	ファインサイエンスツール	11255-20
バンナス型マイクロハサミ、ストレート、5mmブレード	テッドペラ	1346
100mmホウケイ酸ガラス毛細血管	ワールドプレシジョンインスツルメンツ	1B100-4	ニードルプーラーで引っ張って、PBSの小さな流れが流れることを可能にする細かいポイントチップを作ります。
使い捨てトランスファーピペット、ファインチップ	Samco Scientific	231
チューブの寸法は、内径 (ID) x 外径 (OD) x 壁の厚さ (インチ
PVC チューブ (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	図 2 に示すように、プルドニードルでブロワーチューブを組み立てます。
タイゴンシリコーンチューブ(3/32 x 5/32 x 1/32)	サンゴバンパフォーマンスプラスチック	ABW00004
タイゴンシリコーンチューブ(1/32 x 3/32 x 1/32)	サンゴバンパフォーマンスプラスチック	スABW00001

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