ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Summary

ここでは、高解像度のナノスケール表面電位マップを生成するためのツールとしてのケルビンプローブ力顕微鏡の使用を説明するプロトコルを提示します。このツールは、微生物の基質表面への結合能力に対する表面電位の役割を評価するために適用されました。

Abstract

表面電位は、表面を基板への微生物の付着力に支配的な役割を果たしている物理的特性を一般に見落とされる。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は、ナノスケールでの表面間の接触電位差を測定する原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMとKPFMの組み合わせは表面電位と、細菌細胞などの生体試料の地形図の同時生成を可能にする。ここでは、例えば、ステンレス鋼、金などの医学的に関連する表面への微生物付着に対する表面電位の影響を調べるためにKPFMを採用する。表面電位マップは、異なる材料の基板上での微生物膜の表面電位の違いを明らかにした。ステップ高さのグラフは、基板表面と微生物との間の境界領域での表面電位の差を示すために生成された。細胞膜の表面電位の変化は、変化に関連している細胞代謝と運動性で、S。したがって、KPFMは、様々な基材表面への接着の際に微生物の膜表面電位の変化を調べるために利用することができる強力なツールを表す。本研究では、KPFMを使用してステンレス鋼、金個々のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100細胞の表面電位を特徴付けるための手順を示す。

Introduction

バイオフィルム除去に反抗的であり、疾病伝播および抗菌剤耐性の増加率につながる可能性として機器の表面や皮膚創傷で生産バイオフィルムは、医療業界のための問題を提起する。添付ファイルは、バイオフィルム形成の最初のステップであり、その可逆^1-3による最も重要なステップです。基板表面特性は微生物付着上で重要な役割を果たしている。このような表面硬度、気孔率、粗さ、および疎水性のような要因には、微生物付着をもたらすことが示されている。しかしながら、微生物付着の基板表面電位（SP）の役割を調べる研究はほとんど^4,5行われている。負に帯電した表面は、雲母、シリコン、金⁶のバチルス·チューリンゲンシスの胞子の付着を防止する。細胞膜電位の変化は、細胞接着および運動性の^5,7の変化を示すものである。これは、電気的にホーンが観察されているogeneous表面がより容易に微生物の付着^5を促進する。ナノスケールでの細菌の表面電位を特徴付けることは、様々な表面への細菌の付着の動態を理解するための新規な方法を提供することができ、それにより抗生物付着戦略の開発を助けることができる。そのような電気泳動光散乱、ゼータ電位、及び等電点の決定のような細菌の電気動力学を特徴付けるために使用される他の方法とは異なり、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は全体ではなく培養物^8-11の個々の細胞の検査を可能にする。高精度かつ高精....

Protocol

ガラス製品と文化の作製

1. この実験を進める前に、5％の羊の血液寒天（SBA）MRSAを成長させるためのプレートを準備します。 37℃で24時間、SBAプレートをインキュベートする。この時間の後、単一の、十分に単離したコロニーを液体培地中に後続の接種のために使用されるために存在すべきである。 2ヶ月 - ストア1、4℃で、単一のコロニーを有するSBAプレートにストリーク。
   注：羊の血液寒天プレートは20の間を含む既製のパックで来る - メーカーに基づいて25のプレート、そして一般的にVの羊の血液/ wの5％を加えたトリプシン大豆寒天ベースで構成されています。
2. 確認トリプシン大豆ブロス（TSB）500mlを、1％グルコースおよび0.1％のNaClを補った。この後、2ガラス試験管に収集し、クリーン。オートクレーブ可能蓋が試験管用できない場合、キャップとしてアルミ箔を使用しています。 1ミリリットルピペットチップの箱と一緒にオートクレーブTSBおよび試験管。
3. 安全キャビネットの下やバンズ近くバーナーEN、ピペット以前の5ミリリットルをオートクレーブ処理試験管にTSBオートクレーブ。十分な時間がTSBと試験管を室温まで冷却させるために与えられていることを確実にするように注意してください。以前にストリークし、5％のSBAプレートから、6ミリリットルTSBブロス中に単一コロニーを接種する。一つは、MRSAが含まれ、第二の試験管に無菌性を保証するために、陰性対照として使用される。 <....

Results

KPFMを使用してSPを測定する能力は、試料表面とカンチレバーチップの両方がある程度導電性であるという原理に依存している。ステンレススチールとゴールドは、MRSAが取り付けられていたように導電性表面を務めた。 KPFM画像は512×512の解像度を持つ、と5×5ミクロンから10×10μmの範囲のスキャン領域と両面に15 MRSA細胞から採取された。走査は、0.02ライン/秒から0.05ライン/秒の範囲のライン速度で実施した。そのため、行ごとに収集512データポイントとスキャンする512線で、スキャン時間は2.84時間から7.11時間の範囲であった。収集された画像の種類は、 図2に見ることができる。KPFMデュアル周波数を使用して動作し、そのようなものとして、地形の画像が同時に表面の電気的特性に関するデータと一緒に収集される。熱フィルタは、より容易に表面電位の小さな変化（ 図2）を識別するために、SPマップに適用した。 SPマップデータワット分析した後、画像処理ソフトウェアとして平均表面電位および標準偏差を決定する。統計分析は、Rオープンソースの統計的プログラミングを使.......

Discussion

KPFM表面電気的データを得るための新規な技術を用いた。これは、一般化学における電荷分布を調べるための方法として使用されており、ごく最近、マイクロおよびナノスケールでの生物学的システムの研究に適用され始めている。収集したデータから、我々は微生物が容易にさえ静的インキュベーションの3時間後に、ステンレス鋼、金表面を洗浄するために添付するようには見えなかったことがわかった。ポリ-L-リジン機能化表面は、30分後に急速な微生物付着を示した。官能化された表面上の微生物のより長いインキュベーション時間は、試料表面上の細胞過密、悪いトポグラフィ画像につながった。表面機能化は、ステンレス鋼、金表面のためのポジティブSPへの負のSPからのシフトにつながった。以前の研究では、微生物は、典型的には、浸透圧及びイオンバランス^23を維持するために起因する細胞の周りに負に帯電したイオンの封鎖に負のSPを有することが示されている。また、知られているグラム陽性微生物におけるグラム陰性微生物及びタイコ酸中のリン酸基の存在は、さらに負のSP ²⁴の形成をもたらすこと。グラム陽性と陰性の細胞膜の基本的な化学の知識は、正の基板S.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM 原子間力顕微鏡	アジレント・テクノロジー	#N9435S
AFM/STM金属試料ディスク	TED PELLA, INC.	#16219	ステンレス製サンプルディスク
DPE(低ノイズ)導電性SPMプローブ	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	チップあたり4つのPtコーティングカンチレバーがあります。実験にはカンチレバーBを利用しました。
PELCO金コーティングAFM/STM金属試料ディスク	TED PELLA, INC.	#16218-G	金サンプルディスク
PicoView ソフトウェア	Agilent Technologies		#N9797B 5500ILM 原子間力顕微鏡 イメージングソフトウェア
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	培地から細胞(ペレット)を分離するために細胞洗浄ステップで使用される遠心分離機
トリプチカーゼ大豆寒天と5%羊の血液	BD	#221261	既製のプレート
トリプチン大豆ブロス		BD#257107	乾燥粉末として提供されます。コンテナにカムする方法の説明。