ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

サマリー

ここでは、高解像度のナノスケール表面電位マップを生成するためのツールとしてのケルビンプローブ力顕微鏡の使用を説明するプロトコルを提示します。このツールは、微生物の基質表面への結合能力に対する表面電位の役割を評価するために適用されました。

要約

表面電位は、表面を基板への微生物の付着力に支配的な役割を果たしている物理的特性を一般に見落とされる。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は、ナノスケールでの表面間の接触電位差を測定する原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMとKPFMの組み合わせは表面電位と、細菌細胞などの生体試料の地形図の同時生成を可能にする。ここでは、例えば、ステンレス鋼、金などの医学的に関連する表面への微生物付着に対する表面電位の影響を調べるためにKPFMを採用する。表面電位マップは、異なる材料の基板上での微生物膜の表面電位の違いを明らかにした。ステップ高さのグラフは、基板表面と微生物との間の境界領域での表面電位の差を示すために生成された。細胞膜の表面電位の変化は、変化に関連している細胞代謝と運動性で、S。したがって、KPFMは、様々な基材表面への接着の際に微生物の膜表面電位の変化を調べるために利用することができる強力なツールを表す。本研究では、KPFMを使用してステンレス鋼、金個々のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100細胞の表面電位を特徴付けるための手順を示す。

概要

バイオフィルム除去に反抗的であり、疾病伝播および抗菌剤耐性の増加率につながる可能性として機器の表面や皮膚創傷で生産バイオフィルムは、医療業界のための問題を提起する。添付ファイルは、バイオフィルム形成の最初のステップであり、その可逆^1-3による最も重要なステップです。基板表面特性は微生物付着上で重要な役割を果たしている。このような表面硬度、気孔率、粗さ、および疎水性のような要因には、微生物付着をもたらすことが示されている。しかしながら、微生物付着の基板表面電位（SP）の役割を調べる研究はほとんど^4,5行われている。負に帯電した表面は、雲母、シリコン、金⁶のバチルス·チューリンゲンシスの胞子の付着を防止する。細胞膜電位の変化は、細胞接着および運動性の^5,7の変化を示すものである。これは、電気的にホーンが観察されているogeneous表面がより容易に微生物の付着^5を促進する。ナノスケールでの細菌の表面電位を特徴付けることは、様々な表面への細菌の付着の動態を理解するための新規な方法を提供することができ、それにより抗生物付着戦略の開発を助けることができる。そのような電気泳動光散乱、ゼータ電位、及び等電点の決定のような細菌の電気動力学を特徴付けるために使用される他の方法とは異なり、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は全体ではなく培養物^8-11の個々の細胞の検査を可能にする。高精度かつ高精度に、細胞 - 細胞または生物膜の電気的特性を比較したい場合に有益である。

KPFMは、原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMは、走査トンネル顕微鏡^（STM）12の直接の結果として開発された。 STMを使用した最初の公表の画像は1982年¹²ゲルト·ビーニッヒとハインリッヒRorhrerにより行った。彼らの発明は、空気中の導電性表面上に鋭い導電性チップをスキャンするラスターによって原子構造を解決することができました。すぐに乾燥した画像DNA、タンパク質のサンプル、ウイルス¹²にSTMを使用しようと生物を励起高解像度の画像を達成することの意味。 STMはまた、特殊なプローブチップ^13を用いて、液体中で行うことができる。これは、リンジーら 、金電極¹³上に、10ミリモルのHClO ₄中で水に画像DNA分子にSTMおよびAFMを使用することにより示された。 KPFMリガンド²⁶とのDNAおよびタンパク質分析²⁵および生体分子相互作用の表面電位を決定する際に実証されている。

KPFMは、導電性AFMカンチレバーチップと、理想的に導電性のサンプル（ 図1、i）を ^14,15との間の接触電位差（CPD）を測定することによって動作する。サンプルは、必ずしも導電性（ すなわち、生物学的なSAMPLである必要はありませんES）。イメージングは、長い非導電性表面が薄いと下地の導電性材料^6,7があるのでマイカ、ガラス、シリコン表面（非導通）に行うことができる。 CPDは、表面電位の電圧に相当し、負の電子電荷で割ったチップ（φ _先端 ）と試料（φ _サンプル ）の間の仕事関数の差は、として記述することができる（ - E）。導電性AFMチップが試料表面に近づけるとフェルミエネルギーの差（ 図1、二、a）の ¹⁵に静電気力（F es _を ） _が生成され、（距離dだけ分離される）。この時点で、チップと試料の真空エネルギー（E _vは ）平衡および整列している。近いサンプル表面に先端をもたらす際に、チップと試料表面が平行平板コンデンサ（ 図1、二、bと電気的に接触し、行為に入るG>）14,15。時点で、チップと試料表面のフェルミエネルギーは、定常状態平衡に達し、整列ようになる（ 図1、二、b）を先端と試料表面が課金されますと、V _CPDが原因E _V 'sとの仕事関数の差に形成することになる。原因形成されたVの_CPDへの電気的接触面積上のF _ESが機能します。この力は、その後に形成されるV _CPD（ 図1、二、c）は同じ大きさを有するチップの外部V _DCを印加して無効化する。これは、DC電圧を電気接点の領域に表面電荷がなくなり、V _CPDのF _エスを排除するために必要なV _DCの量は、saの間の仕事関数の差に等しく適用mple表面と先端^15。これは、チップの仕事関数が既知であり、それは製造業者によって提供されることに留意すべきである。すべてKPFM方法において、AC電圧（V _AC、約100から500 mV）はまた、チップと試料¹⁴との間の振動電気力を生成するために、先端に印加される。 Vの_CPDおよび/ ​​またはF _ESの変化を測定する際に良好な分解能を提供する。この点において、電気振動の周波数または振幅の変化は、V _DCによって補正することができ、表面電位マップを生成することができる。これらのマップの特定の領域からのデータは、特定の地形的特徴についての電気的情報を提供するために分析することができる。

（1）リフトモード、（2）振幅変調（AM）モード、及び（3）周波数変調（FM）モード^14,16：KPFMの3つのモードで動作させることができる。リフトモードは初期INCたKPFMのarnation。リフトモードでは、発振チップが地形画像を得るために、表面上でドラッグした二パス方式に依存している。第二のパスのために先端がサンプル上記所定の距離上げて​​（10から100 nm）をし、同じ領域にわたってスキャンした。これツーパス方法、AM-及びFM-KPFMに比べリフトモードでは、画像取得のために最も長い時間がかかる。表面から離れた先端を上げると、唯一の長距離のF _ESが測定されることを保証する。また、地形や表面電位測定間のクロストークが増加し、横方向分解能と感度を犠牲にして分断される。

AM-KPFM同時にサンプル形状と表面電位（ワンパススキャン^）14を測定するため^のデュアル周波数を使用して、横方向の解像度と感度を改善する。 AMモードでは、カンチレバーが機械的に、一般的に_5％（0 f）は、その第1の共振周波数より、発振し、電気的（トン発振するV _AC hrough）、その第2の共振周波数（f _1）における。によるFの_エス及びVの_CPDの変化に対するfの₁の大きさの変化は、表面電位測定データを提供しながら、地形データの生成fは₀リードの振幅の変化。 f _0はカンチレバーのF _1は、クロストークが^14を最小化する重要な信号の周波数およびエネルギーによって分離されている。 AFMの頭部エレクトロニクスボックス（HEB）は、両方の地形を与え、1回のスキャンで同時に潜在的なデータを表面2つの信号を分離する。 FM-KPFMは生体表面¹⁴の上にさらにAM-KPFMより解像度が向上します。 FM-KPFMは、静電気力勾配のではなく、静電気力（Fの_^ES）15の変化を測定することでAM-KPFMよりも動作が異なります。 AMモードと同様に、FMモードは、デュアル周波数とSINGLを利用地形得ると同時に^14を潜在的なデータを表面化電子パス走査機構。 FMモードでは、カンチレバーが機械的にfは₀で発振され、電気的に低改変周波数で発振（ _{モジュレーション} fは、典型的には1 - 5 kHzの）。静電相互作用すると_、0とf _MODミックスF _0±fの_modの F側のバンドを生成する。これらの側波帯は静電気力の変化に非常に敏感であり、AFMのHEBを通じてfは₀から分離することができる。 FM-KPFM静電気力勾配の変化を測定するので、先端頂部形状とその保守/完全性は、全体的な表面電位分解能^14,15において重要な役割を果たしているAMを使用して潜在的な解像度表面およびFMモードは、横方向に1nmの範囲で^14である^-16。それはKPFM撮影を中（非極性液体中で行うことができ、そしてより最近では、低イオン性（<10mM）を極性液体で行われることが示されていることに留意すべきであるそのようなMilliQ水としてDCバイアスの印加を不要にバイアスフィードバックを必要としないオープンループKPFMモード）しかしながら、KPFMイメージングは極性溶液^17-20の生細胞で行われていない。液体中のSP画像に関 ​​連付けられた追加の課題は、一般的に維持する細胞（ すなわち、リン酸緩衝生理食塩水）のために使用する溶液は、ファラデー反応、バイアス誘起電荷ダイナミクス、イオン拡散/再分配²⁰につながる移動イオンの高濃度を有することである。したがって、この実験のために、測定は、周囲条件下で、ポリ-L-リジン官能化されたステンレス鋼、金表面上で乾燥させ、デッドMRSA細胞から採取した。イメージングは、予め乾燥または表面²⁰上に固定された生物学的サンプルに空気または真空条件下で行うことができる。湿った条件はまた、表面⁶のKPFMイメージングに影響を及ぼすことが示されている。

本研究では、FM-KPFMを採用そしてAFMは、ポリ-L-リジン官能化ステンレス鋼、金表面へのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100（MRSA）の取り付けにSPの役割を調べた。 MRSAは、最近、多くのβラクタム系抗生物質及びセファロスポリン²¹にその天然選択された抵抗に多剤耐性（MDR）「スーパーバグ」としての地位を獲得している。 MRSA感染症は、ヒトにおけるより高い毒性レベルを有するバンコマイシンまたはオキサゾリジノンなどの過酷な抗菌剤の使用につながる、今より、厳しい困難、および治療 ​​するのに手強いであるため、長期治療²²として使用することができない。ステンレス鋼は、その医療関連性とゴールドは、比較金属として使用されたなどの皮下注射針、便器、ドアハンドル、シンク、材料として一般的な使用のために選ばれました。 FM-KPFMは、微生物膜SPが基板に付着すると変化するかどうかを調べるために利用された。

プロトコル

ガラス製品と文化の作製

1. この実験を進める前に、5％の羊の血液寒天（SBA）MRSAを成長させるためのプレートを準備します。 37℃で24時間、SBAプレートをインキュベートする。この時間の後、単一の、十分に単離したコロニーを液体培地中に後続の接種のために使用されるために存在すべきである。 2ヶ月 - ストア1、4℃で、単一のコロニーを有するSBAプレートにストリーク。
   注：羊の血液寒天プレートは20の間を含む既製のパックで来る - メーカーに基づいて25のプレート、そして一般的にVの羊の血液/ wの5％を加えたトリプシン大豆寒天ベースで構成されています。
2. 確認トリプシン大豆ブロス（TSB）500mlを、1％グルコースおよび0.1％のNaClを補った。この後、2ガラス試験管に収集し、クリーン。オートクレーブ可能蓋が試験管用できない場合、キャップとしてアルミ箔を使用しています。 1ミリリットルピペットチップの箱と一緒にオートクレーブTSBおよび試験管。
3. 安全キャビネットの下やバンズ近くバーナーEN、ピペット以前の5ミリリットルをオートクレーブ処理試験管にTSBオートクレーブ。十分な時間がTSBと試験管を室温まで冷却させるために与えられていることを確実にするように注意してください。以前にストリークし、5％のSBAプレートから、6ミリリットルTSBブロス中に単一コロニーを接種する。一つは、MRSAが含まれ、第二の試験管に無菌性を保証するために、陰性対照として使用される。
4. 接種されたTSB試験管に取り、37℃、200rpmで24時間の逆数インキュベーターに置き。は増殖を制御試験管に発生していないはずながら、この時間の後、微生物の増殖は、MRSAの試験管には明らかなはずである。
5. 新鮮なTSBの6ミリリットルに24時間の文化やピペットから1ミリリットルを取る。 200rpmで6時間、37℃でインキュベートする。
6. 1.5mlマイクロチューブにピペットで6時間、サブカルチャーの1ミリリットル。 850×gで3分間遠心。上清を除去し、脱イオンH ₂ Oの1ミリリットル中にペレットを再懸濁遠心機は、繰り返し、再懸濁。

2。ステンレススチールとゴールド基板のクリーニングと接種

1. ステンレス鋼、金AFMサンプルディスク（20 mmで、それぞれ10 mmの直径）を取り、脱イオンH ₂ O 5mlで各側を清掃鉗子で利き手でサンプルディスクを保持し、サンプルディスクのそれぞれの側に5ミリリットルをピペットサブドミナント手を使用しています。 1分間の超音波処理によって脱イオンH ₂ Oを20mlの入ったビーカーに両側場所サンプルディスクを洗浄した後。
2. 超音波処理の後ビーカーからサンプルディスクを削除する鉗子を使用しています。彼らはペーパータオルの上に開いたペトリ皿の端に60°の角度で傾くようにディスクを置きます。乾燥ディスクをカバーするためにペトリ皿の蓋を使用してください。ディスクが先に進む前に、完全に乾燥させます。 8時間 - 乾燥時間は4との間を変化させることができる。
3. 乾燥したら、ペトリプレートにサンプルディスクを配置するために鉗子を使用しています。
   1. 必要に応じて、どのような材料でサンプルディスクの表面を機能化（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、銀ナノ粒子など ）。
   2. この実験では、被覆するために基板表面をポリ-L-リジンを使用する。サンプルディスク上に（H ₂ O中）、0.1％ポリ-L-リジンを400μl、およびペトリ皿中で室温で1時間インキュベートさせ-ポリ-L-リジン機能化、ピペット200のために。
   3. 1時間後、サンプルディスクを保持し、脱イオンH ₂ O 1mlで洗浄するために鉗子を使用してステップ2.2で説明したように紙タオル上で乾燥させます。
4. 2X洗浄し、再懸濁した細胞を取り、200プレート - 安全キャビネット内部のサンプルディスク上に400μlのを。サンプルディスクを、ポリ-L-リジンで被覆されている場合は、室温で0.5時間インキュベートする。
5. サンプルディスク上の細胞のインキュベーション後に、脱イオンH ₂ O 1mlで穏やかにサンプルディスクを洗うディスクがイメージングの前に一晩乾燥させます。

3. KPFMイメージング

注：この実験では、アジレント5500シリーズILM-AFMを使用しています。

1. AFMを開始するには、AFMのHEBとMAC IIIコントローラと一緒にコンピュータ·ユニットの電源をオンにします。オープンAFMイメージングソフトウェア（ 例えば、AgilentのPicoView）。最初はACAFMまたはいずれかの正しい指定が断続的接触モードでのイメージングのためのAFMにあるを選択してください。
2. 利き手でのAFMピンセットを使用して、サブドミナントの手で開いているばね式クリップホルダーを保持し、ヘッドピースににKPFMカンチレバーを配置。取扱い及び（少なくとも5500 ILM-AFMで）このユニットとしてAFMにAFMヘッドピースを転送するX、Y、Zのスキャン方向性を制御して脆弱なピエゾ水晶ユニットが含まれている場合は注意してください。
   注：この場合に使用KPFMのカンチレバーは2.7 N / Mの80 kHzと、スプリング定数の平均共振周波数を持つMikromasch導電DPE（低ノイズ）カンチレバーた。これらの共振周波数とばね定数のカンチレバーによる使用の容易さのために選択した。より大きなバネ定数と高い共振周波数を有するカンチレバーは、イメージングのために使用することができる。
3. 慎重にAFMに頭ピースをロードし、（この場合は2本のワイヤで接続される必要がある：レーザー光とステージリフトモータ）適切な配線を接続。
4. カンチレバーの先端にレーザーの位置を合わせます。一部のユニットは簡単に位置合わせが可能になり、カメラの機能が含まれています。カメラ機能は、AFMに存在しない場合、次に説明するように、カンチレバーの先端に位置合わせする。
   1. カンチレバーチップ頭上レーザーを移動するために、前面から背面へのノブを時計回りに回転させます。レーザーは、チップに到達するとそれがブロックされ、表示されなくなります。唯一のノブを数回回す。
   2. レーザスポットが再表示されるまで、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。レーザーは、チップの端になりました。
   3. カンチレバー上にレーザを配置する左から右へのノブを回します。レーザーはカンチレバー上を通過するとして、それは私が消え、再び表示されますnは矢継ぎ早。レーザスポットは、フォトダイオード部は、後で座って曇りガラスカバーの中に表示されるはずです。
   4. 曇りガラス上のスポットが消えるまで、先端に向かってカンチレバーをスポットを下に移動し、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。
   5. それだけでカンチレバー先端に座るように、レーザを位置決めするために、わずかに前面から背面へのノブを時計回りに回します。レーザスポットは、すりガラスに再表示されます。
      注：これは、ダイビングボードカンチレバー用レーザ測位方法である。三角形のカンチレバーの場合は、配向処理がわずかに異なります。
5. レーザーが整列されると、AFMにサンプルを装着する際に、カンチレバーと試料との間の十分なスペースを確保するために、10秒間「開」位置でのステージリフトモータを保持する。
6. KPFMの試料ステージ上の試料を置きます。銅線を使用してサンプルを接地してください。試料ステージにAFMから適切な配線を接続します。 Sを接続しますAFMに田下。ほとんどの場合、ステージは、磁石を用いて所定位置に保持される。
7. AFMソフトウェアでは、曲がカンチレバーと、試料にカンチレバー先端のアプローチを開始。セトリング時間は10ミリ秒以下に設定され、そのアプローチ速度がチップの損傷を回避するために、2.0ミクロン/秒を超えないことを保証する。
8. カンチレバーの先端が試料表面上にあると、撮像窓のサイズと理想的な画像領域を選択。地形画像化が最適化されるようカンチレバー設定点と共にI及びPゲインを最適化する。
   1. 地形イメージングが最適化されると、（;ここでは、FMモードを使用したFMまたはAMモードのいずれか）KPFMモジュールをオンにします。それはKPFMイメージングが5μm×5μmの撮像窓の外側に非常に困難であることに留意すべきである。 （ - 0.05ライン/秒0.02）。また、最適KPFMイメージングのために、低速走査速度の512×512の解像度を使用します。
9. 10％ - FM-KPFM設定（しないACAFM設定）の場合は、5間の駆動パーセントを設定します。カンチレバーfrとを設定する2 kHzの帯域幅5 kHzの - 1の間のequency。 0.3％IとFM-KPFM設定のPゲインを設定します。
   1. 信号帯域幅を変化させ、Iと試料表面との間のPゲイン。 SP画像化を最適化するために、さらに最適な画像を得るために信号帯域幅とIとPゲインを調整する。 0.35％ - 私とPゲインの推奨範囲は0.22からです。
10. プロセス及びSPデータを収集する後の画像処理ソフトウェアを使用して収集されたKPFM画像を分析する。

結果

KPFMを使用してSPを測定する能力は、試料表面とカンチレバーチップの両方がある程度導電性であるという原理に依存している。ステンレススチールとゴールドは、MRSAが取り付けられていたように導電性表面を務めた。 KPFM画像は512×512の解像度を持つ、と5×5ミクロンから10×10μmの範囲のスキャン領域と両面に15 MRSA細胞から採取された。走査は、0.02ライン/秒から0.05ライン/秒の範囲のライン速度で実施した。そのため、行ごとに収集512データポイントとスキャンする512線で、スキャン時間は2.84時間から7.11時間の範囲であった。収集された画像の種類は、 図2に見ることができる。KPFMデュアル周波数を使用して動作し、そのようなものとして、地形の画像が同時に表面の電気的特性に関するデータと一緒に収集される。熱フィルタは、より容易に表面電位の小さな変化（ 図2）を識別するために、SPマップに適用した。 SPマップデータワット分析した後、画像処理ソフトウェアとして平均表面電位および標準偏差を決定する。統計分析は、Rオープンソースの統計的プログラミングを使...

ディスカッション

KPFM表面電気的データを得るための新規な技術を用いた。これは、一般化学における電荷分布を調べるための方法として使用されており、ごく最近、マイクロおよびナノスケールでの生物学的システムの研究に適用され始めている。収集したデータから、我々は微生物が容易にさえ静的インキュベーションの3時間後に、ステンレス鋼、金表面を洗浄するために添付するようには見えなかったことがわかった。ポリ-L-リジン機能化表面は、30分後に急速な微生物付着を示した。官能化された表面上の微生物のより長いインキュベーション時間は、試料表面上の細胞過密、悪いトポグラフィ画像につながった。表面機能化は、ステンレス鋼、金表面のためのポジティブSPへの負のSPからのシフトにつながった。以前の研究では、微生物は、典型的には、浸透圧及びイオンバランス^23を維持するために起因する細胞の周りに負に帯電したイオンの封鎖に負のSPを有することが示されている。また、知られているグラム陽性微生物におけるグラム陰性微生物及びタイコ酸中のリン酸基の存在は、さらに負のSP ²⁴の形成をもたらすこと。グラム陽性と陰性の細胞膜の基本的な化学の知識は、正の基板S...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5500ILM 原子間力顕微鏡	アジレント・テクノロジー	#N9435S
AFM/STM金属試料ディスク	TED PELLA, INC.	#16219	ステンレス製サンプルディスク
DPE(低ノイズ)導電性SPMプローブ	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	チップあたり4つのPtコーティングカンチレバーがあります。実験にはカンチレバーBを利用しました。
PELCO金コーティングAFM/STM金属試料ディスク	TED PELLA, INC.	#16218-G	金サンプルディスク
PicoView ソフトウェア	Agilent Technologies		#N9797B 5500ILM 原子間力顕微鏡 イメージングソフトウェア
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	培地から細胞(ペレット)を分離するために細胞洗浄ステップで使用される遠心分離機
トリプチカーゼ大豆寒天と5%羊の血液	BD	#221261	既製のプレート
トリプチン大豆ブロス		BD#257107	乾燥粉末として提供されます。コンテナにカムする方法の説明。