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方法論記事

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

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DOI:

10.3791/52347

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2014年12月27日

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1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge

この記事について

サマリー

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。

要約

白血球の亜型およびマクロファージの祖先として、単球は生物の多くの重要なプロセスに関与しており、生物医学のさまざまな分野の主題としてよくあります。以下に述べる方法は、不均一な骨髄からマウス単球を単離するための簡単で効果的な方法です。

Balb/cマウスの大腿骨と脛骨からの骨髄は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でフラッシングすることによって採取されます。細胞懸濁液にはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加し、接着による単球の分化を避けるために超低接着面で培養します。単球の特性および分化は、様々な間隔で特徴付けられる。表現型解析には、CD11b、CD115、F4/80などのマーカーを用いた蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が使用されます。培養終了時には、懸濁液は45%±12%の単球からなる。接着性マクロファージを除去することで、純度を最大86±6%まで高めることができます。単離後、単球はさまざまな方法で利用することができ、in vivo送達の最も効果的で一般的な方法の1つは、静脈内尾静脈注射です。

この単離と応用の技術は、特に炎症や免疫学の分野でマウスモデル研究にとって重要です。単球は、マウス疾患モデルでも治療に使用できます。

概要

単球の単離は、多くのin vitroおよびin vivo研究にとって重要かつ重要です。これらの細胞は、末梢動脈疾患、冠状動脈性心疾患、またはその他の虚血性疾患などの疾患の標的となります。これは、側副血管の成長が局所的な炎症によって強く引き起こされるためです。炎症反応には、内皮の活性化と白血球(主に単球)の局所的な動員が含まれ、その後、マクロファージに成熟し、複数の成長因子を分泌して細動脈の機能的な側副動脈へのリモデリングを誘導することにより、動脈形成性の高い環境を作り出します1-3。また、単球は樹状細胞に成熟し、免疫学的研究4,5やがん研究6,7に頻繁に使用されます。

末梢血からの単球単離のアプローチで問題となるのは、ほとんどの分析で十分な量の単球を生産するために必要なドナー動物の数が多いことです。以前のプロトコルでは、単球を単離する際のMACS9による密度勾配遠心分離や細胞枯渇などの方法が説明されています。しかし、これらの技術は単球の特性と機能性を変化させる可能性があり、解釈が困難になる可能性があります10,11。さらに、これらの方法は難しく、実験の再現性を低下させる可能性があります。

このプロトコルの目的は、骨髄由来の単球を大量に生成するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提供することです。このプロトコルによって得られる11 x 106 ± 3 x 106細胞の高い細胞収量により、骨髄由来単球の単離中に必要なマウスの数を大幅に減らすことができる。この手順は、最小限の時間で完了でき、上記のような高価で複雑な手法を使用せずに完了できます。ここでは、ドナーマウスの天然骨髄懸濁液から単球を抽出し、超低付着プレート上で懸濁液を培養し、溶液に20 ng/ml M-CFSを添加します。インキュベーションの5日目に、細胞を採取し、機能的および表現型の特性を確認するために特徴付けます。

動脈形成の分野での実験では、これらの骨髄由来の単球をマウスに静脈内移植することは、全身的な薬物送達の効果的な方法であり、一般的な末梢動脈疾患モデルで大腿動脈結紮と組み合わせることができます。

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プロトコル

この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。

1細胞の単離

1.1大腿骨と脛骨の調製を

  1. 閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。
  2. エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。
    1. 鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。
    2. 鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。
    3. 前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。
  3. 洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。
    注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために無菌でなければならない。

骨髄の1.2収穫

  1. 大腿骨と脛骨のシャフトへのアクセスを得るために細かいハサミで各骨の近位端および遠位端をカットします。これらの骨は非常に簡単に壊れているため、このステップには注意してください。
  2. 温かい培地で骨をフラッシュする（M199 + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。無菌の28-G針、1ミリリットルの注射器、10〜15 mlの培地あたりの間に使用しますすすぎのための骨。
  3. 細かい鉗子で骨を持ち、それが半透明に変わるまで一つ一つをすすぐ。注意深く細胞ストレスを最小にするために、シリンジプランジャの端部に圧力を加える。
  4. 70μmのナイロンウェブを通じて骨髄を濾過し、ろ液を集める。骨髄の最大量を抽出するために、遠位端と近位端から繰り返しすすぐ。
  5. PBSでふるいをすすぎ、ろ液を集める。慎重に穏やかに撹拌し、ピペッティングにより破片や携帯コングロマリットを取り除く。

1.3栽培

  1. RTで10分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。上清を捨て、約25ミリリットルの培地で細胞を懸濁します。一回繰り返します。
  2. 第2洗浄工程の後に培地6mlの中に細胞を再懸濁する。パンブルーの50μlの細胞溶液50μlを混ぜる。光学顕微鏡下で計数チャンバー内の細胞を数える。数cを計算するこの式を使用して、溶液中のエル：
    figure-protocol-1
  3. プレートの底に永久的な付着を防止するために、6ウェルの超低取付面板上に細胞を播種する。ウェルあたり最大6 mlの1mlあたり10 6細胞の濃度を使用してください。
  4. 細胞分化を促進するために20ng / mlのM-CSFとの懸濁液を補う。
  5. 培養物を37℃で5日間、細胞を、5％の二酸化炭素とを毎日観察する。

細胞の1.4収穫

注：これらの手順は、氷上で行われるべきである。それに応じて1.4.1または1.4.2のどちらかに進みます。

  1. この時点で、彼らは、超低取付面板であっても、培養プレートに付着する分化したマクロファージを含む、全体の培養を収穫する。
    1. 穏やかなピペッティングにより全体の文化を収穫し、4℃、PBの溶液で脱着S、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA。わからない場合には、顕微鏡下で確認する - プレートが接着細胞を残りの明確になるまで繰り返します。
  2. 別の方法として、主に単球が含まれている懸濁液中の細胞と上清を収穫することにより、接着性マクロファージを捨てる。
    1. EDTA非含有PBS溶液と0.5％BSAと非接着細胞を回収。穏やかに付着したマクロファージを追い出し避けるためにあまりにも多くの力を加えないでください。

1.5 FACS-解析（オプション）

注：これは、MACSを用いてCD117 +ステムおよび前駆細胞の細胞懸濁液を枯渇させることが可能である。この手順については、製造元のプロトコルを使用してください。

  1. どちらかが1.4.1または1.4.2の手順に従って、細胞を採取する。
  2. 4℃で10分間250×gで細胞を遠心して、もう一度この手順を繰り返します。
  3. FACS bの300μlの中に再懸濁し、少なくとも250,000細胞プローブあたりuffer。
  4. 96ウェルプレート（ウェルあたり30μL）の上に細胞溶液を転送します。
  5. 4℃で5分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。
  6. 上清を除去し、各ウェル（使用メーカー希釈）に対する抗体の25μlを添加する。
  7. 抗体と細胞（1.5.1-1.5.6ステップ後の細胞表現型のために製造業者のプロトコルを以下のように染色。単球/マクロファージの同定のために一般に使用されるマーカーは、CD11bの、F4 / 80（ 図3）、CD115（図2）、およびGR-を含む1。
    注：セル·ソリューションのさらなる説明については、CD4、CD8a、のCD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G、およびCD192のようなマーカーの使用が推奨されます。細胞の特徴は、以前に12を説明した。
  8. 4℃で20分間、プローブをインキュベートする。
  9. 遠心機で4℃で5分間250×gでプローブし、FACS緩衝液200μlに再懸濁とは目を繰り返しますステップの2倍である。
  10. FACSチューブにプローブを転送し、FACS分析12を行う。
  11. 細胞分化を分析するために、0日目、3及び5にFACS分析12を実行する。

2.尾静脈注射

2.1準備

  1. 約10分間37℃で加熱板上で動物を暖める。過熱の兆候を認識するために温めながら、動物を観察します。
  2. NaClを150μlの中で、ステップ1.1〜1.4で孤立し、単球を再懸濁し、30Gの針を1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードします。軽くすべての球が注入されるように、注射器をロードする前に解決策をボルテックス。常に熱媒介アタッチメントと単球の活性化を避けるために、氷上で細胞を処理します。

2.2保全処分

  1. 静脈内注射のためのマウスを選択する際にケージ内の他のマウスを乱すことは避けてください。
  2. 制止にマウスを置きます。あまりにも多くのPRを避けるessureと後肢に注意してください。 （ 図4）
    注：または、動物のストレスのないハンドリングを保証するために全身麻酔を使用しています。
  3. マウスが制止を閉じる前に、呼吸のためのスペースがあることを確認してください。

2.3インジェクション

  1. 消毒剤と、注射部位を消毒する。マウスの尾にスプレーし、少なくとも1分間放置。
  2. 静脈の視認性のために、注射部位の上に外側尾側に緩やかな圧力を加えることにより、尾の静脈血の流れを止める。
  3. 注射の前に、尾を90度回します。 （ 図5）
  4. 45度の角度で注入する。動物に害を避けるために、ゆっくりと何グラムあたり5μL以上の注入ません。
  5. 失敗した注射のサインですブリスターがある場合は、すぐに中止し、より近位に注射を繰り返します。
  6. 穏やかなページを適用することにより、射出側の出血を止める約1分間の案内圧力スイッチ。
  7. 手順の最後に、リトラクターを開き、そのケージにマウスを置く。
  8. 動物が注射によって害されませんでしたし、胸骨の横臥が維持されることを保証するために20分間、マウスを観察します。マウスが十分な意識を取り戻すまで、観測の時間を延長します。それは完全に回復した後にのみ、他の動物の会社にマウスを返します。

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結果

マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存しなければならない。

MPS-系の細胞を同定するために使用される最も重要なマーカーは、M-CSF受容体として機能し、特に単球前駆細胞、単球およびマクロファージ上に発現されるCD115である。したがって、独特のMPS-サブセットを識別するために使用されないかもしれないが、確実に、単球/マクロファージ分化に打ち込ま細胞の絶対量を推定することができる。異なる中のCD115発現をタイムラインについては、図2を参照してくださいentiation。

成熟マーカーF4 / 80は、若年性単球、成熟した単球、およびマクロファージを区別する...

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ディスカッション

我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 6の単球収率5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 6±3×10 6単球のより高い収率を得ることができる。

この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を言及することが重要である。すすぎ後の洗浄工程が適切に従わない場合は、細菌および真菌による汚染可能性が高いです。さらに、骨髄は顆粒球、リンパ球および赤血球系細胞を含む不均一な細胞懸濁液、で構成されています。通常、これらの細胞は、増殖因子の欠如のために2日培養の3との間に消える。成長因子駆動型分化した後、マクロファージは、汚染の主な原因である。トンを維持するためにマクロファージへの単球の分化を最小限に抑えるために、低およびマクロファージの彼数は、超低付着性プレートと、上述した洗浄工程の使用が重要である。

これは、排他的に単球に特異的...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft、ドイツ研究財団)SFB 854(Sonderforschungsbereich、共同研究センター)の支援を受けました。

技術サポートを提供してくださったHans-Holger Gärtner氏、Audiovisuelles Medienzentrum、Otto-von-Guericke大学マクデブルク、マクデブルク、ドイツ

に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェル超低アタッチメントプレートCorning Incorporated, NY, USA6ウェル超低アタッチメントプレート, キャップ付き, 無菌
8-12週齢, オス, balb/c マウス Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plateGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stainLife technologies GmbH, Darmstadt, Germany
牛血清アルブミンGE Healthcare, Freiburg, GermanyFraction V, pH 7.0
CanulesB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany28G,30G
CD115eBioscience, San Diego, USA12-1152
CD11beBioscience, San Diego, USA53-0112
細胞培養皿Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germanyキャップ付き, 滅菌
CentrifugeBeckman Coulter GmbH, Krefeld, GermanyAllegra®X-15R遠心分離機
脱毛クリームVeet、マンハイム、ドイツ
消毒剤Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, GermanyKodan Tinktur forte
使い捨てメス No.10 羽毛安全カミソリ Co.Ltd、大阪、日本 
EDTASigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ
エタノール 96% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken、ドイツ
抽出ユニット PipetusHirschmann Laborgeräte GmbH &Co.KG、エバーシュタット、ドイツ
F4 / 80AbD Serotec、Düドイツ sseldorfMCA497APC
FACSバッファ 単一コンポーネントPBS、0.5%BSA、0.1%NaN3
FACSデバイスBecton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国BD FACS Canto II
FACSチューブ    Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® ピペットBecton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serumSigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine ps,Rubis, Stabio, Switzerland
GlovesRösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1eBioscience, San Diego, USA53-5931
ヒーティングプレート Labotect GmbH、Göttingen, ドイツ ホットプレート062
インキュベーターEwald Innovationstechnik GmbH、バート・ネンドルフ、ドイツ、Incu安全
イソフルランBaxter Deutschland GmbH、Unterschleißハイム、ドイツ
光学顕微鏡Carl Zeiss SMT GmbH、オーバーコッヘン、ドイツ軸方向40 >C
マクロファージコロニー刺激因子Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツSRP3110 
機械式加振機IKA、シュタウフェン、ドイツms2 ミニ加振機
Medium 199PAA Laboratories GmbH、Pasching、オーストリア37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前
マイクロ試験管Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ
微生物学的作業台Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, GermanyHera safe
単球洗浄緩衝液 単一成分PBS、0.5%BSA、2 mM EDTA
マウス拘束装置さまざまな
NaClBerlin Chemie AG、ベルリン、ドイツ
NaN3 (ナトリウム酸)シグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ
ノイバウアー計数室Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen、ドイツ
cellsieveBecton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国細胞ストレーナー、70 & マイクロ;mメッシュサイズ
ニシリン/ストレプトマイシンシグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ
リン酸塩緩衝生理食塩水ライフサイエンステクノロジーズGmbH、ダルムシュタット、ドイツpH 7.4、滅菌
ピペットエッペンドルフAG、ハンブルク、ドイツ10µL / 100&マイクロ;L / 200&マイクロ;l / 1,000µl
ピペッティングヘッドEppendorf AG, ハンブルク, ドイツ
血清ピペットGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, GermanyCellstar 5 ml, 10 ml
吸引ユニットIntegra bioscience, Fernwald, GermanyVacusafe comfort
Surgical ScissorsWord Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
SyringeB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany1 ml Omnifix® -F インスリン注射器
キャップ付きチューブGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bathJulabo Labortechnik GmbH, Seelbach, GermanyJulabo SW22
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参考文献

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