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方法論記事

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

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DOI:

10.3791/52353

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2015年3月4日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

この記事について

サマリー

ここでは、器官型スライス培養技術を用いて海馬の出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。この方法では、成人の神経新生のin vitro操作を可能にし、培養海馬への薬理学的薬剤の直接適用することができます。

要約

ここでは、器官型スライス培養技術を用いて齧歯類の脳内の海馬出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。開発海馬歯状回への薬理学的薬剤の直接適用を可能にしながらこの方法では、海馬の特徴的地形形態を維持します。さらに、スライス培養は、最大4週間維持することができ、したがって、一つは新生児顆粒ニューロンの成熟過程を研究することを可能にする。そのような海馬の深い解剖学的位置だけでなく、血液脳関門に関連する不確実性などの複雑な変数を除外してスライス培養は、海馬スライスの効率的な薬理学的操作を可能にします。これらの理由から、我々は、出生後の神経新生の研究のために特異的器官切片培養を最適化しようとした。

概要

>jove_content<哺乳類の海馬における成体ニューロン新生は、脳の生来の適応性と可塑性の顕著な例を表しています。歯状顆粒細胞(DGC)は、哺乳類の脳で現在十分に特徴付けられている2つの神経原性領域の1つである海馬歯状回内の神経前駆細胞の再生可能なプールから生成され、学習と記憶に特に重要であると考えられています。海馬は大脳辺縁系の一部であり、哺乳類の脳内に深い位置にあるため、正確な薬理学的操作の難しい標的となっています。さらに、てんかん、統合失調症、アルツハイマー病などの疾患には、異常なニューロン新生が関与していることが示唆されており、新生児ニューロンの成熟と生存におけるさまざまな薬理学的物質の影響を理解することへの関心が高まっています。出生後と成人のニューロン新生の区別は曖昧であり、以前の研究では、出生後初期と成人期におけるin vivoニューロンの発達の多くの特徴が類似していることが示されています25。ここでは、出生後のニューロン新生に焦点を当て、成体ニューロン新生への可能な応用を提案します。

Organotypic slice culturesは、哺乳類の海馬のさまざまな生理学的特性を研究するための効率的なin vitro方法を提供します。げっ歯類の脳から調製されたスライス培養物の価値は、3つの主要な品質に要約できます:1)プロトコルは簡単で、すぐに利用できる材料が必要です。2)スライス培養は、海馬の深部解剖学的位置や血液脳関門1を回避するなどの複雑な変数を排除する薬理学的研究を可能にします。3)海馬と三シナプス回路の十分に特徴付けられた構造は保存されています2。以前の研究者は、器官型海馬培養を使用して、シナプスの発達と生理学3,4、神経膠形成5-7、虚血性脳損傷8,9、神経保護と神経修復10-12、てんかん13-15 を研究してきました。また、スライス培養は、緑色蛍光タンパク質(GFP)やその他のバイタルマーカーによる細胞の標識と併せて細胞発生をモニタリングできる有用なモデルシステムを提供することもできます。

Slice培養物は、以前に出生後の海馬の神経新生を研究するためにも使用されてきましたが、これらの研究の大部分における重要な要素の一つは、約2週間後のin vitroでの成体動物からの組織摘出から生じる、十分に特徴付けられた変性です20,21。このため、スライス培養物は、典型的には、出生後早期(P5−P10)マウスまたはラット仔マウスから調製され、これは、培養のための出生後早期脳組織の生存率の改善を利用した22。先行研究は、出生後初期と成体の海馬がシナプス生理学および特定のニューロンサブタイプの発現に関して異なることを示しているが23,24、新生児の歯状顆粒細胞が成熟中に進行する振り付けされた発生プログラムには相当な保存がある25。さらに、最近の研究では、培養中の新生児DGCの生理学的特性は、急性海馬切片調製物16の未熟ニューロンと非常に類似していることが示唆されています。

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プロトコル

注：すべての動物の手順は、トロント大学の比較医学部の動物の健康と福祉のガイドラインに適合。

海馬スライスの調製

  1. 125℃で乾燥したオートクレーブを用いて、以下の機器を滅菌：メスハンドル（＃3）（2）、標準パターン鉗子、大（1）、小切開はさみ（左右に角度を付け）（1）、マイクロスプーン（スプーンとフラットスパチュラ端）（1）、丸みを帯びたマイクロスパチュラ（およびテーパ端部を四捨五入）（2）、ファイン絵筆（1）、火災研磨パスツールピペット（2）は、ガーゼ正方形、2×2インチ（5）。
  2. 場合には、滅菌、無菌の容器に器具を入れ、使用するまで覆われ続ける。すぐに解剖する前に、70％エタノール溶液中で楽器を浸す。
  3. 35°C aでインキュベーター中でプレートをウエル/培養培地1mlを添加し、記憶することによって切開手順を開始する前に、培養インサートを6ウェル培養プレートを準備しND 5％CO 2。

2.無菌層流フード中で解剖ツールを配置

  1. 70％エタノールで層流フードをスプレーし、アルコールから滅菌解剖器具を取り外します。アルコールと解剖脳組織との接触を避けるために、無菌のペトリ皿に載っている間楽器が乾燥することができます。
  2. 2つの大きな滅菌ペトリ皿で​​滅菌氷冷解剖溶液の堆積物5-7ミリリットル。一皿は、寒さと頭（汚い）、冷却とえぐら脳（クリーン）をすすぐための他の1をきれいにします。脳を解剖用シャーレのふたの1で滅菌ろ紙を置きます。
  3. 海馬を解剖するための小さなペトリ皿のふたの一つに小さな、滅菌ろ紙を置きます。 2小さな、滅菌ペトリ皿中の滅菌氷冷解剖溶液の堆積物3-5ミリリットル。一皿は1つが、海馬のセクションの分離中のセクションを保持する、えぐら海馬を開催します解剖顕微鏡下。
  4. 切削ステージに滅菌ろ紙の一部をテーピングし、滅菌カミソリの刃を装着することにより組織チョッパーを準備します。滅菌解剖溶液とろ紙を湿ら。
  5. アルコールできれいなバイオバッグをスプレーし、層流クリーンベンチに入れてください。

3.海馬解剖

  1. 層流クリーンベンチ外の70％エタノールとP7のSprague Dawleyラット子犬をスプレーし、す​​ぐに層流ベンチの内側に大型無菌の外科用ハサミを用いて動物を首を切る。頭がペトリ皿の1中の氷冷解剖ソリューションにドロップしてみましょう。
  2. ペトリ皿に、血を洗い流し、すぐに滅菌ろ紙、腹側を下に頭を転送する。
  3. メスを用いて、下にある頭蓋を露出させるように矢状面内の背側表面に沿って切断する。 Tのラットで柔らかく、容易に貫通可能で、基礎となる骨、皮膚を通してカットではなく、彼の年齢。さておき、この "汚い"メスを設定し、脳組織には使用しないでください。
  4. 小さな切開（側に傾斜し）はさみや鉗子を使用して、ブレグマに頭蓋骨の矢状縫合に沿って頭蓋骨を開き、冠状縫合を矢状縫合によって垂直に交差する頭蓋骨上の解剖学的な点をカット。頭蓋骨の正中線から持ち上げて頭蓋骨フラップを引っ張って鉗子を使用してください。
  5. そっと頭蓋骨から脳を持ち上げるために、脳幹の下に、脳の下側にマイクロスプーンを置きます。脳の基底面に視神経と嗅球を露出するために脳を持ち上げます。完全に頭蓋骨から脳を分離するために、小さなハサミでこれらの構造をカット。取り外し、氷冷解剖溶液を含む他の大きなペトリ皿に無傷の脳を転送する。
  6. マイクロスプーンを使用して、無菌のろ紙を含む小さなペトリ皿の蓋に脳を転送する。無菌のパスツールピペットを用いて、DIS数滴の脳をすすぐ湿った組織を維持するためのソリューションをsecting。
  7. 「クリーン」なメスの刃を使用して、離れて2半球を切った。マイクロスプーンでバック大型シャーレに左半球を転送し、その後の使用のための氷冷解剖溶液に半球PIA側を下に置きます。
  8. 右半球の内側の顔を見るとエッジ円蓋、海馬の内側縁に沿って白質の顕著なバンドを特定する。滅菌メスを使用すると、円蓋の矢状カットを作るが、メス先端のわずか0.5センチ円蓋をカットするのに十分であるので、注意してください。
  9. 2マイクロスパチュラを使用して、脳幹に右手へらを配置し、左側のヘラで上を覆う皮質を持ち上げて右半球からの第1の海馬を削除します。静かに海馬の側脳室および内側の表面が露出する皮質を持ち上げます。白い曲線、采は、表示されるようになるはずです。
  10. CURVAとへらの曲率を合わせます采のトゥーレと優しく采下にへらを押してください。左のヘラをスライドさせ、吻側 - 尾側軸に沿って乗って、次に海馬を削除するには、背側方向にへらを持ち上げる。
  11. 氷のように冷たい解剖溶液と第 2小ペトリ皿に海馬を転送します。左海馬を削除するには左半球で同じ手順を繰り返します。
  12. マイクロスパチュラを使用して、慎重に組織チョッパーステージに海馬を転送する。チョッパーブレードの軸に対して互いに垂直それらを隣接して平行に配置する。組織を置き、海馬の上に解剖ソリューションの数滴を追加するために絵筆を使用してください。
  13. 個々のスライスを削除するには一時停止することなく400μmの切片で組織を切断する（通常、彼らは、ブレードに付着しない）。全海馬が切断された後、穏やかに解離溶液と第 2小ペトリ皿にセクションを転送するために絵筆を使用。
  14. 広告の下で顕微鏡をissecting、慎重にamicro-へらと絵筆を使用して浮動スライスを分離する。
  15. 層流フード内インキュベーターと場所からカルチャーインサートが事前に準備された培養プレートを外します。
  16. ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、カルチャーインサート膜の頂端表面にピペットと転送スライスに4-5スライスを描く。次に、絵筆を持つ位置を調整し、個々のセクションと文化インサートの境界線間にスペースを入れてください。
  17. 無菌のパスツールピペットを用いて、膜の頂端表面から余分な解剖溶液を除去する。
    注：ピペットに組織切片を描画ソリューションの回避を除去しながら。代わりに、ゆっくりと溶液を除去するために滅菌ピペットチップとの定期的なピペット（P200またはP1000）を使用します。
  18. 血清含有培地と35℃のバックインキュベーターに海馬スライスし、5％CO 2で培養プレートを置きます。
    注：実験呼び出す場合複数の動物からの文化を生成するために、徹底的に解剖の間に層流クリーンベンチをきれいに。アルコール溶液に楽器を戻し、すべてのペトリディッシュ、ろ紙及び第二解剖前に無菌のかみそりの刃を交換してください。

4.供給および器官型スライスを維持

  1. 無菌層流クリーンベンチ内の文化を養う。
  2. 培養されたセクションの最初の給餌2日後に解剖を行います。滅菌したガラスピペットを用いて吸引し、古い培地。
  3. ウェルに新鮮な、無菌の、血清含有培地の1ミリリットルを追加するために、滅菌5ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。
  4. 静かにカルチャーインサートを交換し、膜表面の下に形成された可能性のある気泡を除去するように注意してください。
  5. 最初の給餌の後、一日おきに培地を変更します。

新生ニ​​ューロンをラベルにチミジン類似体5.インキュベート組織スライス

  1. 研究するために海馬の歯状回顆粒細胞の成熟と統合は、そのようなブロモデオキシウリジン（BrdU）のまたはChlorodeoxyuridine（CldU）などのチミジン類似体と器官のスライスを、インキュベートする。ここでは、あるため、生理食塩水での高い溶解度のCldUを使用しています。
  2. 3DIVした後、10μg/ mlの最終濃度のために培地を1mlの生理食塩水中の10mg / mlのCldUストック溶液1μlを加える。 BrdUを使用する場合は、分子量の差についての濃度を補正する。培養ウェルにCldUとメディアを追加し、35℃で2時間CldU含有培地で組織をインキュベートする。
  3. 35℃でのインキュベーションの2時間後、CldU含有培地を除去し、（上記に概説）通常の給餌スケジュールを再開するために定期的に送り媒体と交換してください。

6.組織固定およびストレージ

  1. 治療を適用し、培養実験（図2B）を起動する前に、組織試料を固定するためのタイムラインを確立する。
    2. <所定の日後の切開で李>は、実験室のドラフト内で次の準備：10〜50ミリリットルのビーカーに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有する。廃棄された培養液のための空のビーカー。小さな鉗子。使い捨てチップとし、千ミリリットルピペット。
  2. インキュベーションチャンバーから培養プレート（S）を取り外し、ヒュームフードに転送。ピンセットで個々のウェルプレートインサートを傾けます。次に、廃棄ビーカーに、培養培地と転送を削除するには、ピペットを使用しています。全ての培地を除去していることを確認するために角度を培養プレートを傾ける。
  3. 一度に1つの培養プレート用媒体を除去完了します。培地が除去されたときに、各培養ウェルに4％PFAを1mlを追加し、パラフィルムでプレートウェルシールする。 24時間4℃の冷蔵庫に必要な、転送プレートと同じ数の培養プレートのために繰り返します。
  4. 24時間後、ヒュームフードに次のように準備します。10-50 PBS中の0.1％アジ化ナトリウムを含むミリリットルビーカー。空の廃棄されたPFA（有害物質を廃棄する際に安全上の注意に従ってください）​​用のビーカー。小さな鉗子。使い捨てチップとし、千ミリリットルピペット。
  5. PFAを追加するための6.4で説明する手順に従いますが、その代わりにアジ化ナトリウムを含むPBSの1ミリリットルを追加します。一度完全にパラフィルムのエッジをラップし、4℃の冷蔵庫に保存することによって、将来の使用のためのシールウェルプレートに移した。

7.免疫組織化学のための組織をセクショニング

  1. ビブラトームを使用して切片組織を実行します。以下の一連の工程は、器官培養物から使用可能な組織切片の収率を最大限に高める。
    注：直ちに海馬解剖とスライスのメッキ以下では、組織は、約400μmの厚さを有している。しかし、インキュベーションチャンバー内の2〜3週間後に、組織切片は、150〜300ミクロンの最後のセクションの厚さで、その結果、平らにし始めます。
  2. ＃11メスB：セクション培養組織に以下の項目を準備クレード、ハンドル、氷冷PBS、マイクロ解剖鉗子、および組織をマウントする段階をカットクリーンビブラトームを含むガラスシャーレ。
  3. それはプラスチック製インサートハウジングから取り外すことができるように、外科用メスで慎重に円形インサート膜の周囲に沿って切断する。培養されたスライスと、メスの間に十分なスペースを入れてください。
  4. PBSを含むペトリ皿に切り離され、インサートメンブレンを転送します。 PBSですすいだ後、ビブラトーム取り付けステージに膜を転送するために鉗子を使用しています。
  5. 次に、培養されたスライスを囲む過剰膜を除去し、クリーンなエッジを作成するために余分な材料を切り取るためにメスを使用しています。このステップでは、膜は平坦であり、容易に切断面に付着することが確実になる。
  6. ビブラトーム切削ステージ上に接着剤の1-2滴を置き、さらには22 G針を使用して層内に広がった。ビブラトームの切断刃に長辺と平行な矩形状に接着剤を広げた。このステップを実行しますすぐに、乾燥からの接着を防止する。
  7. 切削ステージに海馬スライスを含むトリミング膜を転送し、軽く糊上の膜を配置し、気泡がないことを確認するために鉗子を使用してください。
  8. 瞬間接着剤が乾燥したように、バックPBS含むペトリ皿に接着膜でビブラトーム舞台を移す。ビブラトームブレードと組織切片を格納するためのアジ化ナトリウムを含有する48ウェルプレートを準備する。
  9. 貯蔵およびその後の免疫組織化学的染色のためにアジ化ナトリウムを含む48ウェルプレートに器官スライス組織と転送の30μmのセクションを生成するためにビブラトームを使用してください。
  10. 免疫組織化学染色26,29のために、既存のプロトコルを参照してください。

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結果

1）スライスは、インビトロで 10-21日間（DIV）の後に海馬スライスの特徴的な形態学的特徴を維持すること、および2）新生児DGCsを定量することができる：器官培養成体神経発生の研究に適しているかどうかを決定する彼らは二つの主な基準を満たすことが必要一般的に成人の神経発生研究に用いられる標準的な免疫組織化学的技術を使用して。第一の基準については、 図1Aおよび1Bは 、保存海馬の形態を強調表示します。そのような歯状回（DG）などの特徴が、CA1、およびCA3領域は、簡単に識別。

第二の基準に関しては、 図1C（上段パネル）は新生児DGCsが緑色で内因性神経マーカー、ダブルコルチン（DCX）および外因性チミジン類似体、5-クロロ-2'-デオキシウリジン（CldU）での共発現の代表的なサンプルを提供赤。これらのニューロンは、サブGRに位置しています海馬DGのanularゾーン。ニューロンの正しい誕生デートを確保するために、我々はDCXを共発現するCldU ...

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ディスカッション

CldU（またはBrdU）の投与後に、薬理学的薬剤の適用のタイムラインは、特定の発生の窓の間に新生児DGCsを標的とするように選択することができる。例えば、仮想的な薬剤は、GABAが脱分極される発達段階にある未成熟ニューロンの年齢と一致することが提案されている第二週後CldU注射中に適用することができる。このプロトコルを使用して今後の研究では、薬剤と「テーラー「目的の特定の実験的な質問へのアプローチへの暴露のウィンドウを適応させることができます。

そのスライス培養は出生後の神経新生の研究のための有効なモデルであるかを決定するための重要な基準は、海馬の新生ニューロンを染色し、定量する能力である。この仮説を支持する二つの主な調査結果は、顕微鏡分析はCldUと同じニューロンにおける内因性タンパク質マーカーの免疫組織化学的反応性を明らかにしたことだった。内因性の神経細胞のマーカーと組み合わせて使用​​される場合、そのようなBrdUおよびCldUとしてチミジン類似体は、神経発生の研究のための強力なツールである。

腹腔内注射を介してなど...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、カナダ衛生研究所がJMWに119271した研究助成金MOPによって支援されました。著者は、Yao Fang Tan氏の卓越した技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5-クロロ-2'-デオキシウリジン(CldU)MPバイオメディカル105478有害、発がん性
細胞培養インサート、直径30mm、0.4 µm 細孔径サーモサイエンティフィック 140660これらのインサートにヌクロンデルタコーティングを施すことで、組織の接着性が向上し、スライスの品質が向上します。
円錐形遠心分離管(滅菌)Fisher Scientific14-432-22
Dissector scissors(側面に角度付き)Fine Science Tools 14082-09
最小必須媒体 (MEM)Gibco11095; 液体4 °C;C
Eclipse Ni-U蛍光顕微鏡ニコン
接着剤 組織用Krazy接着剤KG585接着剤にさらされた組織はIHCに使用できないため、接着を達成するために接着剤の最小量を使用してください。
ハンクs バランス塩溶液 (HBSS) (500 ml)Gibco14025-0924 °C;C
ホース セラム ヒート インアクティベート (500 ml)Gibco16050-12250 ml アリコートを作り、-20 °C で保管します。C
Kimwipes Kimberly-ClarkeTW 31KYPBX
改良ガラスピペット (パスツールピペットの底を取り外し、ブンゼン炎
ペトリ皿 (100 mm x 15 mm) および (60 mm x 15 mm)フィッシャーブランドのFB0875712とFB0875713A
メスの刃 #11ファイン サイエンス ツール10011-00
メス ハンドル #3ファインサイエンスツール10003-12
セロジカルピペットSorfa Medical Plastic Co.P8050
パターン鉗子ファインサイエンスツール11000-12
滅菌真空フィルターサーモサイエンティフィック565-0020
手術用ハサミファインサイエンスツール14054-13
リンジ駆動フィルターユニットMillipore-MillexSLGP033RS
可動ステージ付き組織チョッパーStoelting 51425
細い先端の絵筆
で端を滑らかに)標準シ

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