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方法論記事

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技

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DOI:

10.3791/52354

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2015年4月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Bio-Physics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 2Department of Pediatrics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 3Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York Buffalo School of Engineering

この記事について

サマリー

動物の屠殺まで、インビボでのエンドツーエンドの吻合およびリアルタイムデジタル評価を用いて、ヒツジの頸動脈への組織工学的船（TEVS）の間の位置に配置するためのステップバイステップのプロトコル。

要約

組織工学的船（TEVS）の開発は、大動物モデルへの能力に日常的にかつ効果的にインプラントTEVS（直径4-5 mm）で進められる。ステップバイステップのTEVの間の位置に配置するためのプロトコルおよびTEVネイティブ頸動脈のリアルタイムデジタル評価は、ここで説明されている。 インビボ監視は、流量プローブ、カテーテル、および超音波結晶（可能な注入によって可能にされる手術時に移植さTEVSネイティブ頚動脈）の動的な直径の変化を記録する。一度移植、研究者は、動脈血流パターン、観血血圧や、脈波伝播速度、振幅増加指数、パルス圧およびコンプライアンスなどのパラメータをもたらす動脈直径を計算することができる。データ収集は、実験期間を通じて分析のために、単一のコンピュータプログラムを使用して達成される。このような貴重なデータがTEVマトリックスリモデリングへの洞察を提供し、そのresemblanネイティブ/偽対照およびin vivoでの全体的なTEV性能にCE。

概要

TEVSの開発のための主な焦点は、自家血管が利用できない場合、自家移植片の交換のための代替を提供するために、ドナー視力罹患率を制限することであった。例えば、年間冠動脈バイパス手術の数は、アメリカで35万超えている、との適切な移植片の理想的な供給源は、左内胸動脈、冠動脈及び伏在静脈1を左前下のまま。血管疾患に苦しむ多くの人々は、自家移植片の交換に適し動脈と静脈を持っていない可能性があるため、TEVSの開発は、このように何十年も1-6のための研究の強烈な分野となっています。小説TEVSのエンジニアリングおよび最適化は、自身がそのような激しい議論の話題となっていないTEVSを移植するために採用外科技術に関する報告、多くの進歩を遂げているが。そうではなく、動物モデルにTEVSの移植に関するプロトコルは大きく残されている研究研究者まで。

以下の原稿は、エンドツーエンドの吻合法を利用してTEVSを移植する方法を示します。この手順は、長手方向の張力およびインビボのモニタリング器具の添加を最適化する、縫合技術の安定化、特定の吻合部の縫合パターンを用いて最適化した。この方法は、以前に使用されてきた多くのバリエーションの一部と対比される。さらに、この手順は、動脈血圧、TEV直径/コンプライアンスなどのパラメータを取得し、外植までアップ手術後TEVを通して流速する方法について説明します。それはリモデリングの過程にある間、このデータ収集はTEVの不可欠な分析を提供します。

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プロトコル

注：このプロトコルは、バッファローのニューヨーク州立大学で動物実験委員会によって承認されています。

1.手術前の準備

  1. 以下の研究のために（40〜60の体重で約1-3歳ドーセットクロス、女性、）羊を使用してください。手術の前に3日から始めて、口の中にシクロスポリンA（200mg /日）、アスピリン（975 mg /日）、及びクマジン（20〜30 mg /日）を管理し、すべての研究の期間継続する。
  2. 羊は手術（通常の飼料= 1.8キロの干し草と0.4キロ粒）の前に12時間絶食させていることを確認します。
  3. 蒸気121℃のオートクレーブで30分間15psiのを使用して、すべての外科用品を殺菌する。
  4. 手術前にパラホルムアルデヒドのデシケーター48時間で次の項目を配置します：4ミリメートルドップラー流量プローブ、1ミリメートルの超音波の結晶、留置動脈カテーテル、延長チューブ、および42「タイゴンチューブを。
    注：のために必要な、関連する医療機器のテーブル手術と殺菌のためには、 表1に記載されています。この段階でタイゴンチューブに計装の事前配置は、手術中に時間を節約するのに役立ちます。
    1. 左及び該当する場合は、右のようにプローブ、カテーテルおよび結晶の両端にラベルを付けます。

2.手術

  1. ジアゼパム（0.5ミリグラム/ kg）およびケタミン（4ミリグラム/ kg）を静脈内（IV）で麻酔するための羊を誘導する。また、テラゾール（4 mg / kgを）IVを使用しています。
    1. 8.5〜10.0ミリメートル、内径カフ付き気管内チューブ7と経口気管内挿管を行います。
    2. 一回換気量の換気装置（7〜10ミリリットル/ kg）または圧力調整式人工呼吸器に再呼吸回路を介して吸入麻酔を投与する（15〜20センチメートルH 2 O）。深い外科麻酔ステージにメディアに到達するために適切な量（3％-4％、当初）でイソフルランまたはセボフルランを管理するための精密な気化器を使用してください。の最小肺胞内濃度羊は1.4％以上、それぞれ1.9％8である。
    3. 運動刺激に応答して、眼瞼反射、目の位置、および心拍数を観察することにより、麻酔深度を評価する。パルス酸素濃度計を用いて血液の酸素飽和度（95％-100％）はカプノグラフィーを使用して、呼気ガス中のCO 2濃度（45〜55 mmHg）で、監視し、自動調整さ加温ブランケットを使用して、手順（38.5から39.5℃）中に体温を維持する。
  2. 標準バリカンの＃40ブレードを使用し、羊の全体首から、そして1橈側皮静脈の上にウールを剃る。 70％のイソプロピルアルコール、7.5％ベータダインスクラブ飽和ガーゼを使用した手術のための両方の部位の皮膚を準備します。皮脂の除去を容易にするために、アルコールガーゼで始まる。ベタジンガーゼとアルコールとの代替を三回ガーゼ。
  3. 加温ブランケットの上に背側横臥位で動作テーブルの上に羊を置きます。胃内容物の受動的な追放を可能にするために、中規模の経口胃管を渡します。拡大する羊の首と、必要に応じて配置を維持するために協力的緩衝材を使用しています。
    1. 7.5％ベタジン浸したガーゼを使用して、最終的な無菌スクラブを行い、手術前に5分間座ってすることができます。
  4. 橈側皮静脈に配置された血管カテーテルを通して10ミリリットル/ kg /時間での静脈内輸液（乳酸リンゲル液または0.9％生理食塩水）を管理。ペニシリンGプロカイン6600 U / kgを筋肉内（IM）、ゲンタマイシン1.6 mg / kgを、IM、およびブプレノルフィン0.005から0.01 mgのIVまたはIM：術中抗生物質や鎮痛を管理します。
  5. 電気焼灼を使用して腹側正中首の上に縦に~12センチ切開する。鈍的切開技術を用いて結合組織を除去することにより、左右の頸動脈（1~6 cm）を単離する。オフネクタイと出血を最小限にするために頸動脈から分岐したマイクロ血管を焼灼する。
  6. すべての配線とチューブ（フロープローブ、超音波水晶ワイヤーを掘り進むを支援するために（非滅菌）の手術看護を利用することにより、無菌性を維持皮膚の皮下層内のカテーテルチューブ）。背外側首に外科的に準備さ切開を通って出る鈍いトロカールを使用してください。
    1. 無菌ドレープの下に到達し、首の側はドレープの下で可視化することができるように、羊の頭を回す。
    2. 腹側正中頸部切開と首の側との間の皮下空間を介してトンネルに8センチメートル湾曲した止血剤を使用してください。オープンとぶっきらぼうに幅1.5cmの管〜のためのスペースを解剖するために止血剤を閉じます。止血のヒントは、頭と肩の間の中間に右または左耳に尾約10cmを配置する必要があります。ヒントは表面的な皮膚に向かって指しているように止血剤を回します。
    3. 無菌ドレープの下にリーチし、滅菌＃11ブレードと止血剤の先端の上に、皮膚を介しての1.5cm切開する。皮膚を通して明確な終了を確認する止血のヒントを視覚化する。
    4. 含むタイゴンチューブを渡す皮下トンネルを通してLL配線とチューブ。無菌ドレープ上記ワイヤーとチューブを保持する。
    5. それは羊の首を離れるとして移植配線を露出させ、首から外側のタイゴンチューブを削除するにはドレープの下に達する。皮下空間内の任意の緩みを最小限に抑えるために、個々の行を引き出します。適切に動脈に機器を取り付けるための十分な距離にしておきます。
  7. 両方の頸動脈に4ミリメートルドップラーフロープローブを配置し、初期読み取ります（ 図1）を達成する。動脈をクランプする前に、ヘパリンIVの30分の100 U / kgのを管理します。
  8. 手術の終了まで100 U / kg /時間でのヘパリン投与を継続します。非破砕血管クランプを使用して頸動脈をクランプ部分（長さ約4 cm）を切り出す。対側頚動脈流量は、脳への血流を維持するために、50％-100％に増加する。
    注：これは、除去することによって本来の​​血管の反跳によって縦延伸を制限することが可能である置き換えおよび/または完全な吻合手順が完了するまでの間隔を短くするために血管クランプを使用してネイティブ動脈延伸さより短いセグメント。これは、個々の保持縫合糸の張力と移植された移植片を制限するのに役立ちます。
  9. 7-0プロリンethalloy重武装したモノフィラメント縫合糸でシンプルな中断されたステッチを使用して所定の位置にTEVを縫合。必要に応じて、吻合の縫合を妨げるであろう血管収縮を防止するために、天然の血管系に局所的にそのようなパパベリンた（15mg / ml）またはニカルジピン（1.25 mg / ml）での血管平滑筋弛緩剤を適用する。
    注：約1ミリメートル間隔で縫合糸を配置することから始めます。これは非常に、場合に変化することができる。組成やTEV厚さは、縫合糸との間の有効距離に影響します。天然の組織またはTEV減少の厚さとしては、互いに接近、縫合糸を配置する必要があるかもしれない。
    1. 二つの対向するSを配置することによって、ネイティブ動脈にまずアンカーTEVの4点近位端および遠位端（図2 -Di）の両方でtitches。止血剤を使用して教えた各アンカーを持ちます。
      注：近位および遠位の説明は、紙全体に血流の方向に関連している。
    2. 吻合を開始するために、近位端および遠位端の両方の表面的な側面に5-6以上の縫合糸を追加します（図2 -Pr）。同時に血管を180度回転させるクランプ。
    3. 繋留縫合糸の張力を再確立する。 TEVの回転側（5~6）近位ために縫合糸端部および遠位端部を追加的に中断加える。
  10. TEVがしっかりと所定の位置に縫合された後、元の位置にそれを回転させ、第一、血管は、一度に1つをクランプ遠位クランプを外す。吻合部位でのわずかな出血が一般的です。これは自然にクランプ解除とreclampingの数分後に解決するか、追加の縫合糸の配置が必要な場合があります。 （ 図3ドップラーフロープローブを配置バックTEV入る血流及びモニタ流量に対するネイティブ動脈の近位に-Fl）。
    注：左右の頸動脈の流量は、約15分後に平衡化することを期待。移植されたTEVと頚動脈における流量が着実に低下した場合には、TEVが凝固されることが可能である。流れに関する他の可能な異常がTEVに対して近位または遠位ネイティブ動脈の収縮に起因することができます。この問題が発生した場合、追加の血管平滑筋弛緩剤の使用が適用されてもよい、と本来の血管は、移植部位上の組織の閉鎖後30〜60分後に、基礎トーンに返す必要があります。
    1. 必要に応じて、対側頸動脈を切除し、「シャム」対照としての所定の位置に戻し、それを縫合。これは、より臨床的に関連する単独の右頸動脈を残すのみフロープローブ、超音波クリスタル、及びカテーテルを取り付けるよりも長い。シャム制御が望まれる場合は、2.11のステップに続行する前にこれを実行。
  11. 7-0プロリンを使用したTEVの両側に1ミリメートルの超音波結晶（ 図3 -cr1 CR2）を縫合。超音波クリスタルヘッドを通して縫合糸を通し、唯一のTEVの表層にステッチ。
  12. テフロン織り前立て（ 図3のCa＆図4A）で修飾18 Gカテーテルを用いて動脈をカテーテルを挿入。ネイティブ動脈組織上のTEVに対するカテーテル遠位に配置します。
    1. 出血を制御するために5/0 Ethibondで動脈壁に前立てを縫合。生理食塩水でフラッシュされたカテーテルにマイクロボアチューブを接着するためにシクロヘキサノンを使用してください。補助線としてチューブを使用してください。
    2. チューブの体外に終了します（ 図4B）を密封するためにSurfloインジェクションプラグ付き20 Gルアースタブアダプターを使用してください。カテーテルの開通性を維持するために、2〜3日ごとにラインのプライミングボリュームを取得し、食塩水10mlでそれをフラッシュヘパリンナトリウム注射、次いで5000 U / mlの。
  13. フロープローブと超音波の結晶、ならびにフロープローブとカテーテルとの間の距離との間の距離を記録する。これはソフトウェアに関連して算出する脈波伝播速度を可能にする。このような計算を必要としない場合、カテーテルを移植しない。
  14. 機能しているすべての移植ハードウェアを確実にするために必要に応じて手術中の測定値を取得する（セクション3を参照）。
  15. 2/0シルクとテーパー針（ 図3）を使用して、近くの筋肉組織に注入された線や電線を固定します。
    1. プローブ尾とワイヤー頭側拡張してから、横の筋肉組織に向けて「Uターン」ことで、容器に血流プローブ線と平行に配置します。ワイヤーまたはフロープローブは、容器上の任意の歪みを配置することができないように、2箇所にテーパー針に2-0シルクを使用して、隣接する筋肉組織にワイヤを固定します。縫合糸がしっかりされていることを確認しますが上musculaを締めとstrangulateはありませんトゥーレ（ 図3）。
    2. フロープローブを固定するための前述の手順と同様のたるみ~1.5センチ（ 図3）を考慮して、横方向の筋肉組織に結晶配線および動脈カテーテルラインを縫合。
    3. 一緒にグループすべてのワイヤや線、ちょうど前のステップと同様の皮下トンネル、を通って出る前に筋肉組織にそれらを固定する。
  16. （;針をカット、皮膚フェーシャ、非切削針）皮膚にマットレスステッチを実行して、フェイシアと真皮下で実行されている縫合パターンを用いた層で2-0ビクリル縫合糸により手術部位を閉じます。 2/0のVicrylとカッティング針を用いて体外に電線や線の周りの背側頚部で1.5センチの切開を閉じます。
  17. しっかりと羊（ -回復した後の図5）の皮膚に縫合されるパウチに置きフロープローブワイヤ、カテーテル線、超音波水晶ワイヤ（×10cmの10cm）に。
  18. 徐々にオフ麻酔羊を引き離す自発呼吸が再開されたときと一回換気量の換気装置はその後羊を抜管。必要に応じて橈側皮静脈と包帯に挿入された血管カテーテルを削除します。
  19. 切開、Telfaパッド、ストレッチロールガーゼ、及びエラスチコンにトリプル抗生物質軟膏を使用して首を包帯。
  20. 一日一日二回ブプレノルフィン0.005から0.01 mgのIVまたはIM、2日間1日1回の回復中に一度フルニキシンメグルミン2.2 mg / kgをIM、その後1.1 mg / kgをIM：術後鎮痛を管理します。

生体内の監視3.

  1. 適切な拘束を​​確実にするために、モバイルカートに羊を置きます。これは羊は、ハードウェアを損なうことなく、穏やかで意識したまますることができます。計装録音を得る前に30分間カートに2〜3回の羊を順応する必要があるかもしれません。
  2. 袋からすべての配線や線を削除し、監視装置に接続します。流量計フロープローブを接続し、1ミリメートルの超音波結晶TRBに接続-USBボックス、及び圧力トランスデューサのカテーテルライン。この設定のフローチャート（ 図6）が設けられている。
  3. 流量プローブおよびデータ収集に先立って圧力変換器を校正。
    注：、ソフトウェアのバージョンや使用される機器の違い、キャリブレーションや設定の間の電位の変動に、場合によって異なります。
  4. 製造業者のプロトコルに従って、微調整Sonometrics結晶測定をオシロスコープを利用する。
  5. コンピュータソフトウェアを使用して記録データ（ 図7）。赤い色の下半分にトレースはシャム/ネイティブに対応している白色で、図7の上半分でトレースは、移植されたTEVに対応している。 TEVとシャム流量（ml /分）、動脈圧（mmHgで）及び直径（mm）の両方のためにライブ記録されている。
  6. 無擾乱少なくとも1分間の記録。より詳細な分析のためにこのデータをエクスポートします。記録後、DISCONNECTすべてのワイヤと背中羊の首に縫合ポーチに入れる。

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結果

30以上の羊は、（印刷中）TEVSの移植のために、この報告書に記載されて外科技術9を受けている。プロトコルの最適化の後に、最新の羊操作をまとめた表を表2に示す。すべての羊のない生命を脅かす合併症を持つTEV注入後に回復した。いくつかの動物では、線維症は、留置動脈カテーテルの先端付近ネイティブ動脈で観察された。追加されたインスツルメンテーションの存在と炎症の有意な増加が観察されていない。まれに（1 18のカテーテル）、カテーテルTEVを通る血流の妨げを生じなかった。この1閉塞は1ヶ月後に発生した。カテーテルからのマイナーな合併症は動脈信号と血液を吸引することができないの減衰が含まれています。 TEV開発の研究を進め、最も一般的に報告されたデータは、通常、開存率、流速とコンプライアンスである。このプロトコルは、POSSであることを実証している実験期間を通じてそのような貴重なデータを取得するためにible。このレポートは、流量、直径および動脈圧の買収に焦点を当てているが、コンプライアンス、増加指数と脈波速度も算出することができる。

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ディスカッション

このレポートの目的は、ヒツジ頸動脈への関心のインプラントTEVSに信頼性と再現手順を提供することにある。このモデルで使用される動物の天然の頸動脈は、厚さ0.5〜0.75ミリメートルおよび外径4.5〜5ミリメ​​ートルであった。ここで説明する外科技術は、厚さが0.25〜1ミリメートル、外径4〜5ミリメ​​ートルと3ヶ月の期間までの効果的な証明して大きな成功を収め、意図されたエンドポイントと長さは4 cmの様々な形状のTEVSを移植するために成功している。この手術法の使用が収集しやすく、より一貫性がデータの取得を可能にした。

さらに、 インビボでのリモデリングのリアルタイムのパラメータを測定する能力が記載されている。様々な直径は、同様に、不一致と移植されたTEVの設計の所望の範囲に依存して、このモデルに首尾よく使用することができ、注入の持続時間は1賛成または超えて拡張することができるR。

このプロトコルの最適化における最大の進歩の一つは、結節縫合技術を用いてエンドツーエンドの吻合の使用である。この報告書の作成に使...

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開示事項

報告すべき開示はありません。

謝辞

この作品は、国立心臓と肺研究所（R01 HL086582）とニューヨーク幹細胞科学基金（NYSTEM、契約＃からの補助金によってサポートされていました   STAとジョン·ナイキストによって完成したJoveのビデオで使用されるDDSイラストにC024316）;バッファロー、ニューヨーク州立大学のメディカルイラストレーター。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
圧力トランスデューサベクトンディキンソンP23XL-1数量:1+(各動脈に1つ).
水で満たされたダイヤフラムドームで使用されます。
アンプとトランスデューサボックスグールド5900シグナルコンディショナーケージ数量:1.
2つのトランスデューサとアンプをケージに含める必要があります。この特定のユニットは製造中止になる場合がありますが、BNC /アナログ出力を備えた他の市販の圧力トランスデューサは、ソノメトリックス機器と通信します。
TS420血管周囲流量計モジュール(x2)Transonic SystemsT403モジュールおよびTS420(x2)数量:各頸動脈を通る流量を測定する1.
Flowプローブは、TS420ユニットの各に接続します。
デジタル超音波測定ユニットソノメトリクスTR-USB数量:1
フロープローブ Precision S-Series 4 mmTransonic Systems株式会社MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA数量:2
1 mmソノメトリクスクリスタルソノメトリクスシステム1R-38S-20-NC-SH数量:2-4(各動脈に2つ)
移植用カテーテルBD(ベクトンディキンソン) 381447数量:1+(動脈ごとに1つ).
カテーテルは切断され、マイクロボアチューブに固定され、スタイレットは挿入に使用されます。
タイゴンマイクロボアチューブノートンパフォーマンスプラスチック(AAQ04127) 配合 S-54-HL延長セット用に長さにカット
ルアースタブアダプターBD (ベクトンディッキンソン)427564 (20ゲージ)数量: 1+ (各動脈カテーテルにつき1つ)
Surflo インジェクションプラグテルモSR-IP2数量: 1+ (各動脈カテーテルにつき 1つ)
MeadoxPTFE (テフロン) フェルト19306サイズにカット.
私たちの研究で使用したPTFEフェルトは製造中止になりました。ただし、「サージカルメッシュ」同等の製品を提供します。
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参考文献

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