アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関 KCNJ10（Kir4.1）

Summary

DNAメチル化は、遺伝子発現の安定したレベルを維持するだけでなく、さまざまな刺激に応答して遺伝子発現の動的な変化を可能にすることができます。DNAメチル化における遺伝子特異的な変化と、これらの変化が遺伝子発現に及ぼす影響を研究することを可能にする技術について詳しく説明します。

Abstract

DNAメチル化は、シトシン-グアニンジヌクレオチド中のシトシンのC5位にメチル基が共有結合することにより、遺伝子発現を調節する役割を果たします。DNAメチル化は、遺伝子発現に長期的かつ安定した変化をもたらしますが、DNAメチル化のパターンとレベルも、さまざまなシグナルや刺激に基づいて変化する可能性があります。このように、DNAメチル化は、遺伝子発現の強力で動的な調節因子として機能します。ニューロエピジェネティクスの研究により、DNAメチル化の全体的な変化と遺伝子特異的な変化の両方に関連するさまざまな生理学的および病理学的状態が明らかになりました。具体的には、遺伝子発現の変化とDNAメチル化との間には顕著な相関関係が、シナプス可塑性中枢神経系損傷後の神経精神疾患や神経変性疾患に存在します。しかし、ニューロエピジェネティクスの分野が中枢神経系生理学におけるDNAメチル化の役割についての理解を広げ続けるにつれて、遺伝子発現の変化とDNAメチル化に関する因果関係を描写することが不可欠です。さらに、神経科学というより大きな分野に関しては、トランスクリプトーム、プロテオーム、エピゲノムを研究する際には、広大な領域と細胞固有の違いが存在するため、これらの違いに対処する技術が必要です。ここでは、RNA転写とDNAメチル化の両方のその後の検査を可能にする皮質アストロサイトのFACSソーティングについて説明します。さらに、DNAメチル化、メチル化感受性高分解能融解分析(MS-HRMA)、およびルシフェラーゼプロモーターアッセイを調べる技術について詳しく説明します。これらの組み合わせた技術を使用することで、DNAメチル化と遺伝子発現の相関関係の変化を探るだけでなく、特定の遺伝子領域のDNAメチル化状態の変化が転写活性に影響を与えるのに十分であるかどうかを直接評価することができます。

Introduction

エピジェネティクスは、ゲノムの転写活性に影響を与える可能性のある化学修飾の研究です。基本的に、DNA配列を変化させることなく、DNAメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化などのエピジェネティックな修飾は、遺伝子発現パターンを可逆的に変化させるのに十分です¹。DNAメチル化は、遺伝子発現の強力な調節因子であり、最もよく特徴付けられたエピジェネティックな修飾です。DNAメチル化は、シトシンのC5位、通常はシトシン-グアニンジヌクレオチドのシトシン(CpG部位としても知られる)にメチル基が共有結合することです。CpG部位が高密度に存在する領域は、CpGアイランド(CGI)として知られています。CGIは、転写開始部位(TSS)および遺伝子プロ^{モーター1-3}と頻繁に関連しています。したがって、CGIでのDNAメチル化の変化は、必ずしも細胞の発現や機能の変化と伴うわけではありませんが、CGIでのDNAメチル化の変化は、転写活性に強力な調節力を発揮することができます²。

歴史的に、DNAメチル化は胚形成、刷り込み、発生に不可欠であることが観察され、有糸分裂後の細胞で起こるDNAメチル化のレベルにはほとんど変化が見られませんでした（癌関連遺伝子の変化を除く）^4,5。しかし、ニューロエピジェネティクスの分野は、DNAメチル化の重要な非発達的役割を強調しています。具体的には、認知エピジェネティクスは、DNAメチル化を、学習と記憶のプロセスに不可欠な遺伝子の転写活性化と抑制の両方を媒介する上で不可欠な高度に可塑的なメカニズムとして再定義しました⁶。認知エピジェネティクスとは別に、虚血性損傷と神経障害性疼痛をモデル化する研究では、DNAメチル化をさまざまなCNS障害に迅速に反応する不安定なメカニズムとして特徴付けられています^7-9。アストロサイトに関しては、DNAメチル化がアストリオグリオージェニゼーションに重要な役割を果たしていることを示唆するいくつかの証拠があります。Fanらは、神経前駆細胞(NPC)におけるDNMT1の条件付きKOが、全体的な低メチル化状態と一致するアストロサイトの早発症をもたらすことを発見しました¹⁰。さらに、Perisicらは、GLT-1プロモーターのDNAメチル化の差レベルが、皮質および小脳におけるグルタミン酸トランスポーターの発現の差を媒介すると結論付け、アストロサイト遺伝子発現の脳領域特異的パターンを確立するDNAメチル化の役割を強調した¹¹。全体として、環境、薬物、および損傷のすべてがDNAメチル化を変化させ、しばしば遺伝子発現を変化させることが示されているため、多くの研究がCNSにおけるDNAメチル化の動的で不安定な性質を強調しています^4,9。これらのニューロエピジェネティックな研究を総合すると、DNAメチル化は、さまざまな中枢神経系の病状を緩和する可能性のある実行可能な治療標的として指摘されています。

エピジェネティクスの分野が神経発達と疾患におけるDNAメチル化の役割についての理解を拡大するにつれて、DNAメチル化を治療標的へと移行させるという課題は、特定の遺伝子標的と部位を定義する相関研究だけでなく、原因となる研究を行うことです。さらに、脳領域や細胞タイプに特異的なDNAメチル化の変化を調査することは、ニューロエピジェネティクスの分野に特有の、現在進行形での時間的価値のある課題です。このプロトコルは、星状細胞の蛍光活性化セルソーティング(FACS)、メチル化感受性高分解能融解分析(MS-HRM)、メチル化ルシフェラーゼアッセイなど、さまざまな技術を利用して、Kir4.1をコードする遺伝子であるKCNJ10のDNAメチル化状態を調査します。Kir4.1は、CNS ^12-16における脳領域と細胞特異的な発現パターンの両方を示すグリア特異的カリウムチャネルです。 Kir4.1の発現は、吻側から尾側CNS領域に移動するにつれて増加し、最も高い発現は脊髄¹⁵で発生します。このチャネルは上衣細胞、オリゴデンドロサイト、およびそれらの前駆細胞で発現していますが、Kir4.1は主にアストロサイトで発現しており、カリウムの恒常性レベルを維持し、アストロサイトの静止膜電位を過分極した-80mVに設定することによりグルタミン酸の取り込みをサポートするために不可欠であると考えられています^12,16-19。重要なことに、Kir4.1の発現は、発生中および複数の形態のCNS損傷後の両方で非静的です^20-25。私たちは、このチャネルのエピジェネティックな制御を、特に発生中のアストロサイトにおいて調べたいと考えていました。利用される技術は、KCNJ10遺伝子発現の調節におけるDNAメチル化の役割の因果関係を示す遺伝子特異的および標的CpG部位解析を提供します。これらの技術は、他の遺伝子にも適用できます。

Protocol

全ての動物は、国立衛生研究所のガイドラインに従って処理されました。アラバマ大学バーミンガム校で動物実験委員会は、動物の使用を承認しました。

1.全脳組織からのアストロサイトの選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用してエンリッチドアストロサイトの集団からRNAとDNAの取得

1. 落ち着いた1分間の_CO 2で、動物、その後急速に首を切ります。 アルバカーキらに記載されているように、皮質を解剖^26。それは、髄膜を除去する必要はありません。
   注意：S100β（アストロサイトマーカー）プロモーター下のeGFPを発現するトランスジェニックラットは²⁷板倉らによって生成され、アストロサイトのFACSソーティングのために利用しました。
2. 製造業者のプロトコルに従って、非無菌条件下でパパイン解離キットを用いて全脳ホモジネートを準備します。 10分間、水浴中で37℃でパパインを熱活性化します。注意：パパイン溶液は、製造業者によって提供され、L-システインおよびEDTA（材料の表を参照）が含まれています。
   1. 閉じたコニカルチューブ（ 図1A）内に供給される5％のCO _2：95％のO _2を運ぶチューブを可能にするために50 mlのコニカルチューブの頂部に穴を開け、またはドレメル。解離培地を含む10ミリメートル培養皿に解剖皮質を置き（MEMは、20mMのグルコースおよびペニシリン/ストレプトマイシン（500 U / ml）を補充し、95％O ₂で平衡化：5％のCO _2）で1に組織をミンチする清潔なカミソリの刃を使用しX 1ミリメートル²枚。
3. パパイン溶液を含有する50 mlのコニカルチューブに10 mlの手動ピペットマンを用いて転送組織。組織が引き継が解離媒体の量を最小限にするために排出する前に、転送ピペットの底に沈殿することを許可します。インキュベーションの間、表面ガス交換を経て、5％のCO _{2：95％O 2}に平衡化パパインソリューションをしてください。バブルパパインsolutiにしないでください上。 37℃の水浴中で20分間組織をインキュベートします。
4. パパイン溶液中でのインキュベーション後、磨砕組織低速で10ミリリットルの転送ピペットで10回。 RTで5分間1,000×gで遠心濁った細胞懸濁液。
   1. 表面ガス交換を介して、（製造者によって提供される）、DNアーゼ/​​アルブミン阻害剤溶液を平衡化し、DNアーゼ/​​アルブミン阻害剤溶液3mlに細胞ペレットを再懸濁します。メーカーの指示に従って、商業不連続密度勾配を準備します。
5. 6分、1000×gで不連続密度勾配をスピン。ピペットを用いたボトムペレットを吸引してチューブの底から解離した細胞を分離します。
6. 0.02％のウシ血清アルブミンおよび1mg / mlのDNアーゼまたは培地HEPES緩衝好適にDPBSの2-3 ml中に解離した細胞を再懸濁します。 FACS（ 図2A）の前に40μmのフィルターを通過。ソートするまで氷上で細胞を保管してください。
   1. FACS ^{28を実行します} 。
   2. 4℃で5分間、2,000×gで1.5 mlの遠心管中で細胞をペレット化。
      注：ペレット化した星状細胞は、直ちに利用またはDNA抽出まで-80℃で維持することができます。
7. 好適な分離法^{29 30を}使用して、RNAおよびDNAを抽出します。分光光度計とバイオアナライザ^{31を介して} RNAとDNAの濃度と品質を評価します。
   注意：以降の唯一の高品質のRNAとDNAを利用し、それぞれ280分の260 = 2.0〜2.2と1.8から1.9に、。バイオアナライザー分析は、RNAの分解またはDNA断片化のために評価することが不可欠です。 RNAまたはDNAは、それぞれ、その後の研究のため、すぐに利用または-80℃で保存するか、または-20℃できます。

2.メチル化感受性高分解能融解分析（MS-HRMA）を用いた遺伝子のDNAメチル化状態を評価します

1. 遺伝子の任意のCpGアイランドを同定するために好適なオンラインメチルマッピングソフトウェアへの目的の遺伝子配列を入力します興味³²の。
   1. 亜硫酸水素塩に対する設計プライマーは、DNA配列^33に変換し、製造業者のプロトコルに従って、好ましいDNAポリメラーゼを用いて増幅します。 45分間、100Vで1％アガロースDNAゲルを実行することにより、増幅産物のサイズを確認します。 -20℃で20μMのストック濃度で保存するプライマー。
2. 亜硫酸水素塩は、同じ動物種³⁴から0〜100％の範囲で、各サンプルおよびメチル化DNA標準のDNAの500〜1,000 ngのを変換します。溶出サンプルは、20 ngの/μlの濃度を提供します。分光光度計^{31を介して}重亜硫酸変換したDNAの濃度を確認してください。
3. 表1および2に記載の 5μMの濃度で好ましいDNAポリメラーゼおよびプライマーを使用して、MS-HRM増幅のためのセットアップ20μlの反応は。三重で、FACSのDNAメチル化規格を含むすべてのサンプルを実行します。
4. 解析ソフトウェアによっては、事前設定したパラメータを開始および停止後融解曲線の遷移の周り。 0.5℃ - 両者の差が0.2であるので、事前に溶融開始とプリメルト停止パラメータを設定します。ポスト溶融開始を設定し、同様に停止後の溶融。各サンプルのピーク温度差データを抽出します。
5. ％のメチル化標準（y値）とそれに対応する平均ピーク温度差（x値）を使用すると、線形回帰方程式（ 図3A-B、表3-4）を生成します 。未知試料³⁵のメチル化状態を推定するために、この線形回帰式を使用してください。

3.ルシフェラーゼアッセイの使用を介してハイパーメチル化プロモーター活性を評価します

1. 標的遺伝子（ステップ2.1）のCpGアイランドを識別します。 PCRは、CpGアイランド-luc2プラスミド^{37を生成するために} luc2ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に興味³⁶クローンの領域を増幅します。
2. 制限経由のCpGアイランドluc2プラスミド30μgのを線形酵素消化^38。制限消化のための部位を確認し、好ましいカッター^{ソフトウェア} 38 ^{を使用して}二重のカットを避けます。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度および時間で加熱不活性化する酵素。 DNAの最小限の損失が線形化工程の間に発生します。
3. 30℃でのCpGメチラーゼ（M.Sssl）O / Nを使用するか、次の調整を除き、未処理の次のメーカーのプロトコルを残すメチル化線​​状化したプラスミド。
4. 50μlの反応を行います。
5. 線状プラスミドの700 ngのをメチル化するのCpGメチラーゼの5単位を使用してください。
6. 13-19時間の反応O / Nを実行します。
7. CpGメチラーゼ反応に続いて、標準を用いてDNAのクリーンアップを実行し、市販のシリカゲル膜製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップします。 DNAの大幅な損失が30〜60％の損失を以下のCpGメチラーゼ反応を生じます。
8. Hpa II制限消化を介しプラスミドのメチル化を確認してください。
9. メチル化または非メチル化DNAの1μgのを取り、制限が37℃で1時間のHpa IIで消化。各μgのDNAのためのHpa IIの5〜10単位を使用してください。 Hpa II消化後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。可視化のために45分（ 図4B）を100 VでTAEまたはTBE緩衝液中、1％アガロースゲル上でのDNAのCpGメチル化および非メチル化プラスミドの両方を実行します。
10. 適切な制限酵素で二重消化の対象と両方メチル化および非メチル化プラスミドは、全長LUC 2（ベクトル）とCpGアイランド（挿入^{）38を断片化}を解除します。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度と熱不活性化する酵素で二重消化O / Nを実行します。 DNA濃度の最小の損失は、二重制限消化中に発生します。
11. O分離を可能にするために1時間、100Vで1％のDNAのアガロースゲル上の二重消化したプラスミドを実行します。Fベクターと挿入した （図4C）。注意。保護のUVフェイスシールドを着用、バンドを可視化するために卓上ブラックライトにDNAゲルを配置します。きれいな外科用メスを用いたサイズに基づいて、消費税メチル化および非メチル化インサートと非メチル化ベクトル。
12. 飽和フェノール、pHが6.6を使用してゲル抽出DNA。簡単に述べると、ベクターまたはインサートを含有するDNAゲルの重量を量ります。 DNAゲルの0.1グラムあたりフェノール100μlのを使用してください。ガラスダウンスホモジナイザーを用いてフェノールにDNAゲルをホモジナイズします。
13. （フェノール量の1/5を使用して）、クロロホルムを加え、20秒間のサンプルを横に振ります。 2-3分間、室温でサンプルをインキュベートします。 4℃での最大速度（16.1 X千XG）で15分間遠心。
14. 水溶液を削除し、3 M酢酸ナトリウムとエタノールの2.5倍の量の0.1Xボリュームを追加。 -80℃で1時間サンプルをインキュベートします。インキュベーション後、エタノールを除去し、好適な緩衝液30μlにDNAを再懸濁。 DNAの大幅な損失を挿入し、ベクトルの次の分離を発生し、30〜50％のLOssです。
15. T4 DNAリガーゼ^38を用いて、非メチル化ベクターを再ライゲーションメチル化及び非メチル化インサート。ライゲーション反応に挿入するためのベクターの4：1の比を使用してください。メーカーの指示に従ってセットアップ反応。反応のための50μlの総容量を使用してC°またはアイスバケットの上に蓋を氷上で-20℃でO / Nインキュベートします。
16. 連結後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。 DNAの有意な損失は、次のライゲーション反応、DNAのおよそ30-50％の損失を生じます。 45分間、100Vで1％アガロースゲル上でのDNA実行することにより、再連結を確認し、再連結したプラスミド（ 図4D）の濃度を評価します。
17. 製造業者のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬を用いて、D54細胞にメチル化または非メチル化プラスミドをトランスフェクトします。よく0.14×10 ^6細胞 /で12ウェルプレート上にシードD54細胞。
18. 24時間後、トランスフェクト細胞のwi（1）非methyatedのCpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターまたは（2）メチル化CpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターのいずれかの目等しい濃度。
19. 細胞は、デュアルルシフェラーゼアッセイを行う前に24時間トランスフェクトすることを許可します。製造者の指示に従ってアッセイを行います。ルミノメーターを用いて測定値を実行します。三連で各ウェルをお読みください。
20. ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性の比率を計算します。非メチルホタルに制御ルシフェラーゼ活性：メチル化されたホタルを正規化対照ルシフェラーゼ活性を、非メチル化ルシフェラーゼ活性によってメチル化ルシフェラーゼ活性を分割して

Results

アストロサイトの濃縮集団は、eGFPの-S100βトランスジェニック動物²⁷のFACSソーティングを介して取得しました。生後50日目（P50）より古い動物から単離された細胞や分子の分子の品質を低下させるには、P0〜P40老化した動物は、そのような実験のために最適です。皮質組織は、これらの実験に使用しました。 2〜6匹の動物からの皮質を一緒にプールしました。 FACSは、UAB包括的フローサイトメトリーコア施設で行いました。ソートは、ベクトン・ディッキンソンFACSARIA IIで実施しました。 eGFPの励起は488nmのレーザーを用いて得ました。補償は必要ではなかったです。ゲートされた人口は、前方および側方散乱（ 図1B）に基づいて目標としました。生細胞の集団は、臭化エチジウム死細胞の指標とゲーティング（ 図1C）を用いて決定しました 。二つの異なる集団は、eGFPのプロファイル（ 図1D）に基づいて観察されました。経験的テスト、高いEGFPで細胞集団を通じプロファイルは、EGFP陽性細胞集団（ ...

Discussion

このプロトコルは、FACSを介したアストロサイトの濃縮集団の単離、およびDNAメチル化と遺伝子発現の間の相関研究と原因研究の両方を可能にするさまざまな技術について説明しています。これらの技術は、単独または組み合わせて使用され、細胞不均一性の高い組織を扱うラボや、特定の遺伝子または遺伝子領域のDNAメチル化状態と全体的なDNAメチル化変化に関心のあるラボに特に役立ちます。CNSのエピゲノムを研究する上での比較的ユニークな課題の1つは、細胞集団の多様性です。目的の遺伝子は、CNSの時間的および空間的に固有のパターンでさまざまな程度で発現する可能性があるため、組織全体を使用すると、転写研究とDNAメチル化研究の両方からのデータが混乱することがよくあります。

目的のタンパク質であるKir4.1は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、および上衣細胞で空間的および時間的に調節されています ^13,14,40-47。したがって、FACSにeGFP-S100βトランスジェニック動物 ²⁷ を使用すると、星状細胞 ¹⁵の濃縮集団が得...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
パパイン解離システム	ワージントン バイオケミカル コーポレーション	LK003150
AllPrep DNA/RNA ミニキット	Qiagen	80204
メチルプライマー	Applied Biosystems	オンライン	ソフトウェア CpGアイランド
EZ DNA メチル化キット	Zymo Research	D5001
ラット プレミックスキャリブレーション スタンダード	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG メチラーゼ (M.Sssl)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction	QIagen	28704	ゲル抽出とDNAクリーンアップに使用
制限酵素	ニューイングランドバイオラボ
NEBカッター	ニューイングランドバイオラボ	オンライン	制限消化部位を確認
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	プロメガ	E1910
Luc2ベクター、pGL4.10	プロメガ	E6651
レニージャベクター、pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 ルミノメーター	ターナー デザイン
リポフェクタミン LTX およびプラス	ライフ テクノロジー	A12621
フェノール、飽和 pH 6.6/6.9	フィッシャー サイエンティフィック	BP 17501-100
ナノドロップ 2000/2000c 分光光度計	ThermoScientific
MeltDoctor マスター ミックス	ライフテクノロジー	ズ4415440
高分解能メルト(HRM)ソフトウェアv2.0	ライフテクノロジー	ズ4397808
AB SDSソフトウェアv2.3	ライフテクノロジー	ズオンライン
AB高分解能メルト入門ガイド	ライフテクノロジー	ズオンライン
AB7900HT高速リアルタイムシステム	ライフテクノロジー