アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

サマリー

DNAメチル化は、遺伝子発現の安定したレベルを維持するだけでなく、さまざまな刺激に応答して遺伝子発現の動的な変化を可能にすることができます。DNAメチル化における遺伝子特異的な変化と、これらの変化が遺伝子発現に及ぼす影響を研究することを可能にする技術について詳しく説明します。

要約

DNAメチル化は、シトシン-グアニンジヌクレオチド中のシトシンのC5位にメチル基が共有結合することにより、遺伝子発現を調節する役割を果たします。DNAメチル化は、遺伝子発現に長期的かつ安定した変化をもたらしますが、DNAメチル化のパターンとレベルも、さまざまなシグナルや刺激に基づいて変化する可能性があります。このように、DNAメチル化は、遺伝子発現の強力で動的な調節因子として機能します。ニューロエピジェネティクスの研究により、DNAメチル化の全体的な変化と遺伝子特異的な変化の両方に関連するさまざまな生理学的および病理学的状態が明らかになりました。具体的には、遺伝子発現の変化とDNAメチル化との間には顕著な相関関係が、シナプス可塑性中枢神経系損傷後の神経精神疾患や神経変性疾患に存在します。しかし、ニューロエピジェネティクスの分野が中枢神経系生理学におけるDNAメチル化の役割についての理解を広げ続けるにつれて、遺伝子発現の変化とDNAメチル化に関する因果関係を描写することが不可欠です。さらに、神経科学というより大きな分野に関しては、トランスクリプトーム、プロテオーム、エピゲノムを研究する際には、広大な領域と細胞固有の違いが存在するため、これらの違いに対処する技術が必要です。ここでは、RNA転写とDNAメチル化の両方のその後の検査を可能にする皮質アストロサイトのFACSソーティングについて説明します。さらに、DNAメチル化、メチル化感受性高分解能融解分析(MS-HRMA)、およびルシフェラーゼプロモーターアッセイを調べる技術について詳しく説明します。これらの組み合わせた技術を使用することで、DNAメチル化と遺伝子発現の相関関係の変化を探るだけでなく、特定の遺伝子領域のDNAメチル化状態の変化が転写活性に影響を与えるのに十分であるかどうかを直接評価することができます。

概要

エピジェネティクスは、ゲノムの転写活性に影響を与える可能性のある化学修飾の研究です。基本的に、DNA配列を変化させることなく、DNAメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化などのエピジェネティックな修飾は、遺伝子発現パターンを可逆的に変化させるのに十分です¹。DNAメチル化は、遺伝子発現の強力な調節因子であり、最もよく特徴付けられたエピジェネティックな修飾です。DNAメチル化は、シトシンのC5位、通常はシトシン-グアニンジヌクレオチドのシトシン(CpG部位としても知られる)にメチル基が共有結合することです。CpG部位が高密度に存在する領域は、CpGアイランド(CGI)として知られています。CGIは、転写開始部位(TSS)および遺伝子プロ^{モーター1-3}と頻繁に関連しています。したがって、CGIでのDNAメチル化の変化は、必ずしも細胞の発現や機能の変化と伴うわけではありませんが、CGIでのDNAメチル化の変化は、転写活性に強力な調節力を発揮することができます²。

歴史的に、DNAメチル化は胚形成、刷り込み、発生に不可欠であることが観察され、有糸分裂後の細胞で起こるDNAメチル化のレベルにはほとんど変化が見られませんでした（癌関連遺伝子の変化を除く）^4,5。しかし、ニューロエピジェネティクスの分野は、DNAメチル化の重要な非発達的役割を強調しています。具体的には、認知エピジェネティクスは、....

プロトコル

全ての動物は、国立衛生研究所のガイドラインに従って処理されました。アラバマ大学バーミンガム校で動物実験委員会は、動物の使用を承認しました。

1.全脳組織からのアストロサイトの選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用してエンリッチドアストロサイトの集団からRNAとDNAの取得

1. 落ち着いた1分間の_CO 2で、動物、その後急速に首を切ります。 アルバカーキらに記載されているように、皮質を解剖^26。それは、髄膜を除去する必要はありません。
   注意：S100β（アストロサイトマーカー）プロモーター下のeGFPを発現するトランスジェニックラットは²⁷板倉らによって生成され、アストロサイトのFACSソーティングのために利用しました。
2. 製造業者のプロトコルに従って、非無菌条件下でパパイン解離キットを用いて全脳ホモジネートを準備します。 10分間、水浴中で37℃でパパインを熱活性化します。注意：パパイン溶液は、製造業者によって提供され、L-システインおよびEDTA（材料の表を参照）が含まれています。
   1. 閉じたコニカルチューブ（ 図1A）内に供給される5％のCO _2：95％のO _2を運ぶチューブを可能にするために50 mlの....

結果

アストロサイトの濃縮集団は、eGFPの-S100βトランスジェニック動物²⁷のFACSソーティングを介して取得しました。生後50日目（P50）より古い動物から単離された細胞や分子の分子の品質を低下させるには、P0〜P40老化した動物は、そのような実験のために最適です。皮質組織は、これらの実験に使用しました。 2〜6匹の動物からの皮質を一緒にプールしました。 FACSは、UAB包括的フローサイトメトリーコア施設で行いました。ソートは、ベクトン・ディッキンソンFACSARIA IIで実施しました。 eGFPの励起は488nmのレーザーを用いて得ました。補償は必要ではなかったです。ゲートされた人口は、前方および側方散乱（ 図1B）に基づいて目標としました。生細胞の集団は、臭化エチジウム死細胞の指標とゲーティング（ 図1C）を用いて決定しました 。二つの異なる集団は、eGFPのプロファイル（ 図1D）に基づいて観察されました。経験的テスト、高いEGFPで細胞集団を通じプロファイルは、EGFP陽性細胞集団（ .......

ディスカッション

このプロトコルは、FACSを介したアストロサイトの濃縮集団の単離、およびDNAメチル化と遺伝子発現の間の相関研究と原因研究の両方を可能にするさまざまな技術について説明しています。これらの技術は、単独または組み合わせて使用され、細胞不均一性の高い組織を扱うラボや、特定の遺伝子または遺伝子領域のDNAメチル化状態と全体的なDNAメチル化変化に関心のあるラボに特に役立ちます。CNSのエピゲノムを研究する上での比較的ユニークな課題の1つは、細胞集団の多様性です。目的の遺伝子は、CNSの時間的および空間的に固有のパターンでさまざまな程度で発現する可能性があるため、組織全体を使用すると、転写研究とDNAメチル化研究の両方からのデータが混乱することがよくあります。

目的のタンパク質であるKir4.1は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、および上衣細胞で空間的および時間的に調節されています ^13,14,40-47。したがって、FACSにeGFP-S100βトランスジェニック動物 ²⁷ を使用すると、星状細胞 ¹⁵の濃縮集団が得.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パパイン解離システム	ワージントン バイオケミカル コーポレーション	LK003150
AllPrep DNA/RNA ミニキット	Qiagen	80204
メチルプライマー	Applied Biosystems	オンライン	ソフトウェア CpGアイランド
EZ DNA メチル化キット	Zymo Research	D5001
ラット プレミックスキャリブレーション スタンダード	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG メチラーゼ (M.Sssl)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction	QIagen	28704	ゲル抽出とDNAクリーンアップに使用
制限酵素	ニューイングランドバイオラボ
NEBカッター	ニューイングランドバイオラボ	オンライン	制限消化部位を確認
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	プロメガ	E1910
Luc2ベクター、pGL4.10	プロメガ	E6651
レニージャベクター、pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 ルミノメーター	ターナー デザイン
リポフェクタミン LTX およびプラス	ライフ テクノロジー	A12621
フェノール、飽和 pH 6.6/6.9	フィッシャー サイエンティフィック	BP 17501-100
ナノドロップ 2000/2000c 分光光度計	ThermoScientific
MeltDoctor マスター ミックス	ライフテクノロジー	ズ4415440
高分解能メルト(HRM)ソフトウェアv2.0	ライフテクノロジー	ズ4397808
AB SDSソフトウェアv2.3	ライフテクノロジー	ズオンライン
AB高分解能メルト入門ガイド	ライフテクノロジー	ズオンライン
AB7900HT高速リアルタイムシステム	ライフテクノロジー

試薬 ズ