ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
カルシニューリン阻害剤タクロリムスは、米国の固形臓器移植後の免疫抑制ほとんどの治療プロトコルの基礎となるものです。タクロリムスは、狭い治療指数薬であり、そのようなものとして、その全血トラフ濃度に基づく治療薬モニタリングおよび用量調節を必要とします。家庭治療薬と遵守の監視を容易にするために、乾燥した血液スポットのコレクションは魅力的な概念です。フィンガースティックの後、患者は自宅でろ紙上の血液滴を収集します。血液が乾燥した後、それは、タクロリムスは、単純な手動のタンパク質沈殿工程およびオンラインカラム抽出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（HPLC-MS / MS）を用いて定量された分析研究室に郵送されます。
タクロリムスの分析のために、6 mmのディスクは、血液スポットの飽和中央から打ち抜かれます。血液スポットは、弾丸ブレンダーaを使用して均質化され、ND次いでタンパク質は、内部標準D 2、13 C-タクロリムスを含むメタノール/ 0.2 MのZnSO 4で沈殿させます。ボルテックス及び遠心分離後、上清100μlをオンライン抽出カラムに注入し、5 mlの0.1ギ酸/アセトニトリル/分（7：3、V：V）で洗浄し、1分間。以降、切替弁が活性化され、分析物は、分析カラム上にバックフラッシュ（0.1％ギ酸/アセトニトリル勾配を用いて分離されます）。タクロリムスは、タンデム質量分析計を用いて、正の反応マルチモード（MRM）で定量化されます。
アッセイは、1〜50 ng / mlでの直線です。アッセイ間の変動（3.6％-6.1％）と精度（91.7パーセント-101.6％）20日間にわたって評価として受け入れ基準を満たしています。平均抽出回収は95.5％です。キャリーオーバー、マトリックス干渉とマトリックス効果該当はありません。タクロリムスは、室温で1週間4℃で乾燥した血液スポット中で安定です。で抽出したサンプルオートサンプラーは、少なくとも72時間4℃で安定しています。
概要
タクロリムスは、マクロライド構造8（ 図1）を持つ強力なimmonosuppressant 1-7です。 653グラム/ L、エタノール： - シスのためにCN結合のトランス異性それを逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離することができる液9中の2つの回転異性体を形成する（HPLC）は、タクロリムスは、アルコール（メタノール中の親油性と可溶性である355 G / L）、ハロゲン化炭化水素（クロロホルム：573グラム/ L）およびエーテル。 9分子は、任意の発色団を含んでいないし、その紫外線吸収極大が192 nmである0.0047グラム/ L）タクロリムスの行為カルシニューリンの阻害を介して：0.1グラム/ Lおよび水（pHは3：それは（ヘキサン脂肪族炭化水素に難溶性です。 。その作用機序は、参考文献10,11に概説されている。これは、現在、米国において12固形臓器移植患者の80％以上に使用されています。
タクロリムスの治療指数はconsidereですdは13狭くします。また、タクロリムスの投与量と血中濃度との相関が悪く、薬物動態変数14,15あります。移植患者におけるタクロリムスの投与をガイドするための治療薬モニ....
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プロトコル
健康な個体からの匿名化血液サンプルは、コロラド大学病院（オーロラ、コロラド州）からのものでした。検証研究のためだけでなく、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製のための非識別血液バンクサンプルの使用は、コロラド多施設内倫理委員会（COMIRB、オーロラ、コロラド州）によって「免除」と考えられました。
参照とソリューションの作製
- タクロリムスと内部標準のD 2を購入し、材料リストに記載されているベンダから13 C-タクロリムス。
- タクロリムス1 mg / mlの濃度とD 2のために10μg/ mlの、13 C-タクロリムスの濃度で純粋なメタノール中のストック溶液を準備します。三つの独立した重みに基づいて、標準物質のストック溶液を作ります。小分けストック溶液とストア-70℃以下です。
- タンパク質を沈殿させるために溶液を調製します（：、3 V：7 v）を、水にメタノール/ 0.2 MのZnSO 4を使用して、タクロリムスを抽出します。この溶液は、内部標準D 2、2.5 ngの/ mlの濃度の13 C-タクロリムスを含有し、ブランク試料の抽出を除くすべてのサンプル（1.3.3を参照）の抽出のために使用されます。
- 各抽出日....
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結果
サンプルは定量下限と患者試料にスパイクブランク試料の代表的なイオンクロマトグラムは、 図3に示されています。
検量線
検出の下限値は、0.5 mlのNG /であり、定量化の下限はng / mlで1.0でした。より高い濃度は、通常の状況下では、診療所に到達されそうにないとして50ngの/ mlの最高キャリブレーターとして選ばれました。
検量線たて、人間のEDTA全血に各バリデーション日に調製フィルタカードで乾燥させ、メタノールで抽出した/ 0.2 MのZnSO 4（70:30 V / V）+内部 標準の内部標準（最終濃度：2.5 ngの/ mlの）。 1日目の検証（Nキャリブレーターのための6とn = QCレベル6 =）と2日目のためにのために - （各QCレベルのためのn =キャリブレータのための2及びn = 4）20、濃度1、2.5、5を用いて分析しましたCALIBのための10、25、50 ng / mlでrat.......
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ディスカッション
上述のように、乾燥血液スポットに基づいて、タクロリムスの治療薬及び遵守監視の概念は魅力的であるが、一般的に静脈EDTA全血サンプル中のタクロリムスのLC-MS / MS分析に関連するものを超えた分析課題があります。これらには、マトリックスは、ここで使用されるフィルタカード材料と低血液量（20μL）のコットンリンターの材料に浸漬毛細血管全血であるという事実が、これらに限定されません。それにもかかわらず、中央検査室でのハイスループット分析は、特定の堅牢かつ高感度LC-MS / MS分析と組み合わせたマトリックス干渉及びマトリックス効果を欠いているサンプルをもたらす高速かつ信頼性の高い抽出方法を必要とします。すでにパンチフィルタカードが抽出/ LC-MS / MS分析に障害が発生した場合に再分析のために左側に十分な材料は通常存在しないとして、アッセイの信頼性は非常に重要です。
Fiの本研究で使用しLTERカードは、これらがFDA承認されたクラスIIデバイスであるため、NCCLSガイダンスLA4-A5 44に準拠していると、CEマークの付いたヨーロッパにある選択.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、米国連邦医薬品局(FDA)の契約HHSF223201310224Cおよび米国国立衛生研究所/FDA助成金1U01FD004573-01の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| タクロリムス | 米国薬局方条約 | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | ||
| 赤血球 | コロラド大学病院 | W20091305500 V | |
| 血漿 | コロラド大学病院 | W2017130556300Q | |
| アセトン CHROMASOLV, HPLC, ≥99.9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| アセトニトリルオプティマ LC/MS、UHPLC-UV | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A955-4 | |
| イソプロパノール 99.9%、HPLC | フィッシャーサイエンティフィック | BP2632-4 | |
| メタノールオプティマ LC/MS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A452-4 | |
| ウォーターオプティマ LC/MS、UHPLC-UV | サーモフィッシャーサイエンティフィック | W6-4 | |
| ギ酸 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A118P-500 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 硫酸亜鉛 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 & マイクロ;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS | メトラー・トレド | 17008649 | |
| 1.5 ml エッペンドルフチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-682-550 | |
| 10 – 100 & micro;l ピペット, VoluMate LIQUISYSTEMS | メトラー・トレド | 17008651 | |
| 10 μl ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済み | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS | メトラー・トレド | 17008653 | |
| 100 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済み | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS | メトラー・トレド | 17008650 | |
| 2 ml エッペンドルフチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µlピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS | メトラートレド | 17008652 | |
| 20 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl フィルター付きピペットチップ | マルチマックス | 2938T | |
| 200 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl HPLCバイアル用インサート | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| バランス PR2002 | メトラー・トレド | 1117050723 | |
| バランス AX205 デルタレンジ | メトラー・トレド | 1119343379 | |
| ブレットブレンダー ホモジナイザー | Next Advance | BBX24 | |
| 遠心分離機 バイオフュージ フレスコ | ヘレウス | 290395 | |
| 使い捨てワイプ | PDI | Q55172 | |
| ガラス製ウイルス、4 ml | モフィッシャーサイエンティフィック | 14-955-334 | |
| ガラス製バイアル、20 ml | サーモフィッシャーサイエンティフィック | B7800-20 | |
| グローブ、ニトリル | タイタンブランドグローブ | 44-100S | |
| HPLCバイアル、9 mm、2 ml、透明 | フェノメネックス | ARO-9921-13 | |
| HPLCバイアル用蓋フェ | ノメネックス | ARO-8952-13-B | |
| 針、18 G 1.5 | 精密グライド | 305196 | |
| ラック エッペンドルフチューブ用 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 03-448-11 | |
| HPLCバイアル用ラック | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 05-541-29 | |
| スチールビーズ 0.9 – 2 mm | ネクストアドバンス | SSB14B | |
| 冷凍庫/冷蔵庫用収納ボックス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 03-395-464 | |
| 標準マルチチューブボルテクサー | VWR サイエンティフィックプロダクツ | 658816-115 | |
| ワットマン紙、903 プロテインセーバー US 100/PK | GE ワットマン | 2016-05 | |
| オートサンプラー | CTC PAL | パル。HTCABIx1 | |
| バイナリポンプ、Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| バイナリポンプ、Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| マイクロ真空脱気装置、Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| カラムオーブン、 Agilent 1290 2ポジション | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| 6ポートスイッチングバルブを内蔵したサーモステーテッドカラムコンパートメント | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLCプレカラムカートリッジ、Zorbax XDB C8(5 µm粒子サイズ)、4.6·12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC 分析カラム、Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm粒子サイズ)、4.6·150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| タンデム質量分析計 | |||
| API5000 MS/MS と TurboIonspray ソース | AB Sciex | 4364257 | |
| 質量分析ソフトウェア | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
参考文献
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
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