このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

16.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/52424

⸱

2015年11月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

この記事について

サマリー

ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。

要約

カルシニューリン阻害剤タクロリムスは、米国の固形臓器移植後の免疫抑制ほとんどの治療プロトコルの基礎となるものです。タクロリムスは、狭い治療指数薬であり、そのようなものとして、その全血トラフ濃度に基づく治療薬モニタリングおよび用量調節を必要とします。家庭治療薬と遵守の監視を容易にするために、乾燥した血液スポットのコレクションは魅力的な概念です。フィンガースティックの後、患者は自宅でろ紙上の血液滴を収集します。血液が乾燥した後、それは、タクロリムスは、単純な手動のタンパク質沈殿工程およびオンラインカラム抽出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（HPLC-MS / MS）を用いて定量された分析研究室に郵送されます。

タクロリムスの分析のために、6 mmのディスクは、血液スポットの飽和中央から打ち抜かれます。血液スポットは、弾丸ブレンダーaを使用して均質化され、ND次いでタンパク質は、内部標準D 2、13 C-タクロリムスを含むメタノール/ 0.2 MのZnSO 4で沈殿させます。ボルテックス及び遠心分離後、上清100μlをオンライン抽出カラムに注入し、5 mlの0.1ギ酸/アセトニトリル/分（7：3、V：V）で洗浄し、1分間。以降、切替弁が活性化され、分析物は、分析カラム上にバックフラッシュ（0.1％ギ酸/アセトニトリル勾配を用いて分離されます）。タクロリムスは、タンデム質量分析計を用いて、正の反応マルチモード（MRM）で定量化されます。

アッセイは、1〜50 ng / mlでの直線です。アッセイ間の変動（3.6％-6.1％）と精度（91.7パーセント-101.6％）20日間にわたって評価として受け入れ基準を満たしています。平均抽出回収は95.5％です。キャリーオーバー、マトリックス干渉とマトリックス効果該当はありません。タクロリムスは、室温で1週間4℃で乾燥した血液スポット中で安定です。で抽出したサンプルオートサンプラーは、少なくとも72時間4℃で安定しています。

概要

タクロリムスは、マクロライド構造8（ 図1）を持つ強力なimmonosuppressant 1-7です。 653グラム/ L、エタノール： - シスのためにCN結合のトランス異性それを逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離することができる液9中の2つの回転異性体を形成する（HPLC）は、タクロリムスは、アルコール（メタノール中の親油性と可溶性である355 G / L）、ハロゲン化炭化水素（クロロホルム：573グラム/ L）およびエーテル。 9分子は、任意の発色団を含んでいないし、その紫外線吸収極大が192 nmである0.0047グラム/ L）タクロリムスの行為カルシニューリンの阻害を介して：0.1グラム/ Lおよび水（pHは3：それは（ヘキサン脂肪族炭化水素に難溶性です。 。その作用機序は、参考文献10,11に概説されている。これは、現在、米国において12固形臓器移植患者の80％以上に使用されています。

タクロリムスの治療指数はconsidereですdは13狭くします。また、タクロリムスの投与量と血中濃度との相関が悪く、薬物動態変数14,15あります。移植患者におけるタクロリムスの投与をガイドするための治療薬モニタリングは、したがって、一般的な臨床実践16-20です。目標は、事前定義された治療範囲内タクロリムスの血中濃度を維持することです。治療の窓を超える濃度が過剰免疫抑制、癌や、腎毒性、神経毒性、高血圧、および糖尿病などの毒性のリスクを増加させながら、治療範囲以下のタクロリムスの血中濃度は、慢性または急性同種免疫反応の活性の増加をもたらす可能性があります。タクロリムスの高い薬物動態個体内変動は、移植臓器と患者の生存21,22の両方に有害である可能性があります。タクロリムスの薬物動態の個体間変動は、主にCYP3A5の遺伝子多型、個体内の理由によって引き起こされている間可変性は、薬物-薬物、疾患、薬物および食品薬物相互作用は、14,15、含まれるが、これらに限定されません。また、免疫抑制治療薬レジメンの遵守の欠如が要因と移植片喪失の23,24の主な理由です。

これらの考慮事項は、頻繁に家の治療薬やタクロリムス全血濃度の遵守の監視は、患者が常に所望の治療ウィンドウ内タクロリムスエクスポージャーを持っていることを確認することが有益であり得ることを示唆しています。しかし、それは現在の臨床実践15であるように、より頻繁な治療薬モニタリングの物流コストは法外です。理由の一つは、患者が瀉血専門医が描画に必要な静脈血のサンプルを持って見る必要があることです。乾燥血液スポットは最近、魅力的なコンセプト25-28として浮上しています。簡単な指の後、患者は特別なろ紙カードに血液滴を収集し、血液スポットの後にdを有するスティックリート、患者が現在服用してもよいことタクロリムス及び他の免疫抑制剤の分析のための中央検査室に郵送することができます。これは、そのような乾燥血液スポット（血液の一般的に20μl）を25,29-43のような非常に少量の血液量のタクロリムスおよび他の免疫抑制剤の定 ​​量化のための高感度かつ特異的LC-MS / MSアッセイの開発が可能となっています。別の利点は、乾燥血液スポットとして低侵襲性、低容量のサンプル収集戦略が大きく小さな子供28中の治療薬のモニタリングおよび薬物動態学的研究を促進することです。

タクロリムスは、通常、静脈のEDTA全血15で測定されます。理由は、タクロリムスは、広範囲の血液細胞に分配することと臨床研究は、臨床イベント15,18のプラズマに比べて血液中のタクロリムストラフ濃度との間のより良好な相関関係を報告しているということです。比較では、TAの分析乾燥血液スポットにおけるcrolimusを濾紙マトリックスと混合される毛細管血に基づいています。これは、タクロリムスおよびLC-MS / MS分析での潜在的な干渉の可溶化の点で課題を提示。ここでは、高流量のオンラインコラムサンプルクリーンアップの手順とLC-MS / MS分析と組み合わせて、箇条書きのブレンダーを用いて乾燥血液スポットの均質化に基づいて設立され、確認されたアッセイを提示します。今日のように、このアッセイは成功し、臨床試験における遵守を監視するための以上5000タクロリムス乾燥血液スポットサンプルの定量に使用されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

健康な個体からの匿名化血液サンプルは、コロラド大学病院（オーロラ、コロラド州）からのものでした。検証研究のためだけでなく、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製のための非識別血液バンクサンプルの使用は、コロラド多施設内倫理委員会（COMIRB、オーロラ、コロラド州）によって「免除」と考えられました。

参照とソリューションの作製

  1. タクロリムスと内部標準のD 2を購入し、材料リストに記載されているベンダから13 C-タクロリムス。
    1. タクロリムス1 mg / mlの濃度とD 2のために10μg/ mlの、13 C-タクロリムスの濃度で純粋なメタノール中のストック溶液を準備します。三つの独立した重みに基づいて、標準物質のストック溶液を作ります。小分けストック溶液とストア-70℃以下です。
  2. タンパク質を沈殿させるために溶液を調製します（：、3 V：7 v）を、水にメタノール/ 0.2 MのZnSO 4を使用して、タクロリムスを抽出します。この溶液は、内部標準D 2、2.5 ngの/ mlの濃度の13 C-タクロリムスを含有し、ブランク試料の抽出を除くすべてのサンプル（1.3.3を参照）の抽出のために使用されます。
    1. 各抽出日に新鮮にこのタンパク質沈殿溶液を調製し、12時間で溶液の有効期限を設定します。
  3. 検量線および品質管理（QC）サンプルの作製
    1. 純メタノールを使用したスト​​ック溶液の適切な希釈を行うことにより、タクロリムスのス​​トック溶液を調製します。
    2. 、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製EDTA全血の中に適切に希釈されたストック溶液20μlをスパイクするために、20分およびアリコートのための細胞の血液成分へのタクロリムスの均一な分布を可能にするために、水浴中で穏やかに振盪下、37℃でインキュベート1.5ミリリットルポリープへ円錐形の底部を有するr​​opyleneチューブとスナップオンふた。有機溶剤の相対量が5％を超えないことを確認してください。
    3. スポットピペットを使用してフィルタカード上の各円の中央にスパイクの全血50μlの。
    4. 3時間室温でのフィルタカードの血液スポットを乾燥させます。
    5. 1、2.5、5、10、25、および50 ngの/ mlのタクロリムスの濃度で人間のEDTA全血中タクロリムス校正標準を準備します。内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ゼロサンプル」）を含むタンパク質沈殿溶液と較正基準のような抽出のためのブランク試料を準備します。
    6. 0、2、4、20、40 ngの/ mlの濃度のヒトEDTA全血にQCサンプルを準備します。ブランク試料を準備します。内部標準D 2を含む沈殿を用いて抽出されたQCサンプルとは対照的に、13 C-タクロリムス、ないタンパク質沈殿溶液とこのブランクサンプルを抽出します内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ブランク試料」）を含みません。
  4. 臨床サンプルの採取
    1. 43,44で説明したように乾燥した血液スポットを収集します。

2.タクロリムスの抽出乾燥血液スポットサンプル

  1. 視覚的に許容可能なサンプルの品質とボリューム45を確実にするために、乾燥血液スポットを検査します。
  2. 6 mmの穴パンチとフィルタカード上の血液スポットのパンチ中心。
    注：パンチの品質を秤量することによってモニターすることができます。パンチ飽和フィルターディスクは、0.09ミリグラム（：4.83- 5.14 mgであり、N = 12の範囲）±平均5.02ミリグラムで重量を量ります。
  3. 円錐形の底部及びスナップオン蓋付き1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに置きディスク。
  4. 各チューブに20〜30箇条書きを追加します。
  5. 各チューブにタンパク質沈殿溶液（2.5 ngの/ mlの内部標準とV：0.2 MのZnSO 4、7：3、Vメタノール）の500μlのを追加します。 EXTRについてブランクサンプルの動作は、内部標準なしでタンパク質沈殿溶液を使用しています。
  6. （「10」を設定し、最高速度）1分間の弾丸ブレンダーでディスクを均質化します。
  7. 10分間（「10」を設定し、最高速度）マルチチューブボルテックスに室温でサンプルを振ります。
  8. 10分間16,000×gで4℃で遠心分離サンプル。
  9. 300μlのインサートを備えたガラス製HPLCバイアルに上清を移します。前スリットテフロンシールを使用してください。
    注：抽出したサンプルは、-20℃以下でLC-MS / MS分析まで保存することができます。

3. LC-MS / MS分析

  1. C8カートリッジ抽出カラム上に負荷抽出されたサンプルの上清100μlを、図7を用いて洗浄する：水中の0.1％ギ酸の比率3：1分間5 ml /分の流量でアセトニトリル。切替弁の接続は、 図2に示されており、勾配は、 表1の抽出ポンプによって実行されます栄。
  2. 以下、分析カラム上に、プレカラムからの検体のバックフラッシュの結果、切替弁を作動させます。
  3. 65°Cまでのカラムサーモスタットを設定します。
  4. 表1に示す流量と勾配を用いて分析カラムから分析物を溶出します。
  5. ターボエレクトロスプレーイオン化源を介してタンデム質量分析計に分析カラムを接続します。 表2に記載の質量分析装置の主要なパラメータを調整します。
  6. 複数の反応モード（MRM）中の正イオン（[M +のNa] +）を検出します 。定量化のために、次のイオンの移行を使用して：タ ​​クロリムス：m / z（質量/電荷）= 616.2→826.6とD 2、13 C-タクロリムスた：m / z = 829.6→619.2。
    注：総実行時間は4.6分です。

4.定量

  1. 各実験について、1.3.5で製造したキャリブレーターに基づいて検量線を作成し、各分析の実行に含めます。
    1. 質量分析計ソフトウェアを使用して、分析物（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）の応答係数対名目濃度をプロットすることにより検量線を作成します。
    2. 1 / Xの重み付けと組み合わせて二次フィットを用いてキャリブレータを取り付けます。
  2. 乾燥血液スポットにおける量タクロリムスタクロリムス抽出のMRMクロマトグラムにおける内部標準のピークを統合することができます。タクロリムスの応答係数（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）を計算し、質量分析ソフトウェアを使用して検量線と比較します。

5.検証手続

  1. 検出（LLOD）及び定量化（LLOQ）の下限値の下限。
    1. 検出（LLOD）の下限として1：4のピーク対雑音比で最低のタクロリムス濃度を考えてみましょう。定量化（LLOQ）の下限を定義します。等しいか、または名目濃度に等しいか、またはより良好な20％の精度（変動係数）から±20％の偏差よりも良好な精度で較正曲線の最低濃度です。
  2. 内および間日間の精度と精度。
    1. 2 ng / mlで（QC1）、4 ng / mlで（QC2）、20 ng / mlで（QC3）および40 ng / mlで（QC4）の4濃度レベルで正確さと精度をテストします。
    2. フィルタカード、エキスの乾燥、人間のEDTA全血に各バリデーション日にQCサンプルを用意し、上記のように分析します。
    3. QC濃度レベルごとに6つのサンプルでイントラデイの正確さと精度を決定します。
    4. 20日間の間日間の正確さと精度を評価します。 4サンプルを毎日各QCレベルを測定します。
    5. 毎日のQCサンプルと一緒に2つの較正曲線を分析します。
    6. 名目上の濃度の％（濃度レベルごとに6つのサンプルは、5.2.2を参照してください）​​などのイントラデイ精度を計算します。 Calcの分散係数（CV％）としてulate精度。
    7. それは名目濃度の115％に許容限界に85％を下回る場合には許容可能なイントラデイ精度を考えてみましょう。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できるならばイントラデイの精度を考慮してください。
    8. 20検証日間にわたって分析各QC濃度レベルの平均としてインター日間の正確さと精度を計算します。
    9. それは名目濃度の115％に許容限界に85％低下した場合に許容できるインター日間の精度を意味することを検討してください。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できる場合インター日間の精度を考慮してください。
  3. マトリックス干渉の排除。
    1. マトリクス信号によって引き起こされることがある干渉を排除するために、空白の乾燥血液スポット（8異なる個体、好ましくは4人の男性と4人の女性）を分析。
    2. 視覚イオンクロマトグラムを検査します。もし保持時間内にピークタクロリムスのウィンドウがLLOQでタクロリムスでスパイク統合し、ブランク試料におけるタクロリムスピークのものと曲線下その面積を比較し、検出されました。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。
  4. イオン抑制/イオン強化。
    1. 共溶出マトリクス成 ​​分によるイオン抑制/イオン強化の潜在的な干渉を評価するために45を説明するようにポストカラム注入プロトコルを使用してください。
    2. 10μL/分の速度でメタノール（30：70、v / v）のポストカラム：0.1％ギ酸に溶解した10μg/ mlの濃度のタクロリムスを注入。
      1. 分析カラムと質量分析計のエレクトロスプレー源との間にTピースを経由してシリンジポンプを接続します。
      2. タクロリムスのためのMRMトランジションのMS / MSシグナル強度を監視し、その内部標準（のm / z = 616.2とのm / z = 829.6→619.2→826.6）extracの注射後テッドのブランクサンプル（N =異なる個体から8サンプル）。
        注意：イオン抑制が信号とイオン増強ピークのディップが発生している間イオン抑制/イオン強化がない場合には検体の注入によって引き起こされる連続信号は、ブランクマトリックスの注入によって影響されるべきではありません。
  5. 持ち越す。
    1. 最高キャリブレーター後に抽出ブランク試料を分析することにより、潜在的なキャリーオーバーを評価する（50 ngの/ mlの、N = 6）。
    2. 視覚イオンクロマトグラムを検査します。タクロリムスの保持時間ウィンドウ内のピークが検出された場合、LLOQでタクロリムスをスパイクブランクサンプル中のタクロリムスのピークのものと曲線の下のそれらの領域を統合し、比較します。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。
  6. 抽出回収。
    1. QC SAMの抽出後の検体の信号を比較することにより、回収を決定しますブランクの乾燥血液スポットのものとすべての4つの濃度レベルでples（N =濃度につき6）は、抽出後のタクロリムスの対応する量でスパイク。
    2. 4のQCのセット（：2、4、20、40 ngの/ mlの濃度レベル）を準備します。
    3. ろ紙のカードに空白のEDTA全血50μlのをスポッティングし、2時間乾燥させることにより、「回復試験サンプル」に対応する他の4セットを準備します。
    4. 以下、QCとブランク」回収試験サンプル」の両方のために、はさみでフィルタカードの全体の血液スポットを切り出し、円錐状の底部とのスナップ式の蓋付きポリプロピレンチューブに生じたディスクを配置します。
    5. すべてのサンプルを抽出します。
    6. ガラスHPLCバイアルに上清（400μl）を転送します。
    7. 2、4、20、および40 ng / mlで（200、400、2000、4000 ngの/ mlのタクロリムスストックゾルの4μLの濃度に到達するまでの空白」が抽出回収試験サンプル」にタクロリムス原液を追加上清400μlにutions）。
    8. LC-MS / MS分析の後、QC試料及び対応する濃度の「回収試験試料」の両方の信号を比較する（抽出/信号サンプルを抽出X 100の後にスパイクする前に、回復％=信号サンプルをスパイク）。
  7. 希釈の整合性。
    1. サンプルを使用して希釈の整合性を確立ng / mlで500、250および100での検体でスパイク。
    2. 抽出後、タンパク質沈殿溶液を用いて、サンプル希釈（1:10、n = 3の濃度レベルにつき）。
    3. 名目濃度からの偏差を計算します。 85％の範囲内の公称許容できるの-115％減の結果を考慮してください。
  8. 安定性。
    1. すべての4つの濃度レベルでQCサンプルを使用して安定性を調査した（n =濃度あたり4）異なる時点で、異なる貯蔵条件下で分析しました。
    2. 公称値で保存した後の結果を比較してください。 Rを考えてみましょう85％の範囲内の公称許容できるの-115％減esults。
    3. 4℃、-20℃で1ヶ月間、-80℃で1ヶ月に1週間、室温で1週間のサンプルの安定性を確立します。
    4. 3サイクルにわたってテスト凍結融解安定性（-20℃）。試験は、4℃に調節サーモスタットオートサンプラーにサンプルを配置することによって、サンプル及びオートサンプラー安定性を抽出しました。 72時間後にサンプルを注入します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

サンプルは定量下限と患者試料にスパイクブランク試料の代表的なイオンクロマトグラムは、 図3に示されています。

検量線

検出の下限値は、0.5 mlのNG /であり、定量化の下限はng / mlで1.0でした。より高い濃度は、通常の状況下では、診療所に到達されそうにないとして50ngの/ mlの最高キャリブレーターとして選ばれました。

検量線たて、人間のEDTA全血に各バリデーション日に調製フィルタカードで乾燥させ、メタノールで抽出した/ 0.2 MのZnSO 4（70:30 V / V）+内部 ​​標準の内部標準（最終濃度：2.5 ngの/ mlの）。 1日目の検証（Nキャリブレーターのための6とn = QCレベル6 =）と2日目のためにのために - （各QCレベルのためのn =キャリブレータのための2及びn = 4）20、濃度1、2.5、5を用いて分析しましたCALIBのための10、25、50 ng / mlでrat...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

上述のように、乾燥血液スポットに基づいて、タクロリムスの治療薬及び遵守監視の概念は魅力的であるが、一般的に静脈EDTA全血サンプル中のタクロリムスのLC-MS / MS分析に関連するものを超えた分析課題があります。これらには、マトリックスは、ここで使用されるフ​​ィルタカード材料と低血液量（20μL）のコットンリンターの材料に浸漬毛細血管全血であるという事実が、これらに限定されません。それにもかかわらず、中央検査室でのハイスループット分析は、特定の堅牢かつ高感度LC-MS / MS分析と組み合わせたマトリックス干渉及びマトリックス効果を欠いているサンプルをもたらす高速かつ信頼性の高い抽出方法を必要とします。すでにパンチフィルタカードが抽出/ LC-MS / MS分析に障害が発生した場合に再分析のために左側に十分な材料は通常存在しないとして、アッセイの信頼性は非常に重要です。

Fiの本研究で使用しLTERカードは、これらがFDA承認されたクラスIIデバイスであるため、NCCLSガイダンスLA4-A5 44に準拠していると、CEマークの付いたヨーロッパにある選択...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、米国連邦医薬品局(FDA)の契約HHSF223201310224Cおよび米国国立衛生研究所/FDA助成金1U01FD004573-01の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
タクロリムス米国薬局方条約1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.
赤血球コロラド大学病院W20091305500 V
血漿コロラド大学病院W2017130556300Q
アセトン CHROMASOLV, HPLC, ≥99.9%Sigma-Aldrich439126-4 L
アセトニトリルオプティマ LC/MS、UHPLC-UVサーモフィッシャーサイエンティフィックA955-4
イソプロパノール 99.9%、HPLCフィッシャーサイエンティフィックBP2632-4
メタノールオプティマ LC/MSサーモフィッシャーサイエンティフィックA452-4
ウォーターオプティマ LC/MS、UHPLC-UVサーモフィッシャーサイエンティフィックW6-4
ギ酸サーモフィッシャーサイエンティフィックA118P-500
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichD8537
硫酸亜鉛サーモフィッシャーサイエンティフィックZ68-500
0.5 – 10 & マイクロ;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMSメトラー・トレド17008649
1.5 ml エッペンドルフチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック02-682-550
10 – 100 & micro;l ピペット, VoluMate LIQUISYSTEMSメトラー・トレド17008651
10 μl ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済みNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMSメトラー・トレド17008653
100 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済みNeptuneBT 100
1,000 μl ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済みMultimax2940
2 – 20 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMSメトラー・トレド17008650
2 ml エッペンドルフチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック02-681-258
20 – 200 µlピペット、VoluMate LIQUISYSTEMSメトラートレド17008652
20 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済みGeneMateP-1237-20
200 μl フィルター付きピペットチップマルチマックス2938T
200 μl ピペットチップ フィルター付き、滅菌済みMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl HPLCバイアル用インサートPhenomenexARO-9973-13
バランス PR2002メトラー・トレド1117050723
バランス AX205 デルタレンジメトラー・トレド1119343379
ブレットブレンダー ホモジナイザーNext AdvanceBBX24
遠心分離機 バイオフュージ フレスコヘレウス290395
使い捨てワイプPDIQ55172
ガラス製ウイルス、4 mlモフィッシャーサイエンティフィック14-955-334
ガラス製バイアル、20 mlサーモフィッシャーサイエンティフィックB7800-20
グローブ、ニトリルタイタンブランドグローブ44-100S
HPLCバイアル、9 mm、2 ml、透明フェノメネックスARO-9921-13
HPLCバイアル用蓋フェノメネックスARO-8952-13-B
針、18 G 1.5精密グライド305196
ラック エッペンドルフチューブ用サーモフィッシャーサイエンティフィック03-448-11
HPLCバイアル用ラックサーモフィッシャーサイエンティフィック05-541-29
スチールビーズ 0.9 – 2 mmネクストアドバンスSSB14B
冷凍庫/冷蔵庫用収納ボックスサーモフィッシャーサイエンティフィック03-395-464
標準マルチチューブボルテクサーVWR サイエンティフィックプロダクツ658816-115
ワットマン紙、903 プロテインセーバー US 100/PKGE ワットマン 2016-05
オートサンプラーCTC PAL パル。HTCABIx1
バイナリポンプ、Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
バイナリポンプ、Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
マイクロ真空脱気装置、Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
カラムオーブン、 Agilent 1290 2ポジション Agilent Technologies1290 G1216C
6ポートスイッチングバルブを内蔵したサーモステーテッドカラムコンパートメントAgilent Technologies1290 G1316C
HPLCプレカラムカートリッジ、Zorbax XDB C8(5 µm粒子サイズ)、4.6·12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC 分析カラム、Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm粒子サイズ)、4.6·150 mmPhenomenex993967-906
タンデム質量分析計
API5000 MS/MS と TurboIonspray ソースAB Sciex4364257
質量分析ソフトウェアAB SciexAnalyst 1.5.1
F370002サー

参考文献

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973(2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

タクロリムスの定量LC-MS/MS分析除タンパクオンラインカラム抽出マルチリアクションモード検量線内部標準血斑パンチングBullet Blenderホモジナイズ
LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。