このプロトコルの目的は、ラットの糸球体濾過率、尿流量、ナトリウムとカリウムの排泄を測定し計算するための原理と技術を示すことです。このデモンストレーションは、腎機能の測定方法に関する全体的な概念的理解を学生に提供するために使用できます。
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この記事について
サマリー
要約
糸球体濾過率(GFR)の測定、およびナトリウム(Na)とカリウム(K)の分別排泄の測定は、健康と病気における腎機能を評価する上で重要です。GFRは、糸球体でろ過されるが、ネフロンに沿って分泌または再吸収されないイヌリンの定常状態の腎クリアランスとして測定されます。NaとKの分別排泄は、血漿と尿中のNaとKの濃度から決定できます。イヌリンの腎クリアランスは、大腿動脈、大腿静脈、膀胱にカテーテルがある麻酔動物で実証できます。この手順に使用される機器と消耗品は、研究の中核施設で一般的に入手可能なものであるため、この手順は腎機能を測定するための実用的な手段になります。このビデオの目的は、利尿薬の前後に腎機能を評価するラボデモンストレーションを実行するために必要な手順を示すことです。提示された技術は、腎疾患のラットモデルにおける腎機能を評価するために利用することができる。
概要
腎臓の最も重要な機能は、細胞外水分と電解質含有量の恒常性調節です。腎臓は、細胞外水分、ナトリウム(Na)、カリウム(K)を密接に調節して、正常な生理学的レベルを維持しています。腎機能の障害は、致命的となる可能性のある深刻な代謝障害を引き起こす可能性があります。基本的な腎プロセスはネフロンで発生し、糸球体での血漿の濾過から始まり、尿の排泄で終わります。尿中の水分、Na、Kの最終濃度を決定する他のプロセスは、ネフロン内での分泌と再吸収です。糸球体濾過率(GFR)とNaとKの分別排泄の測定は、健康と疾患の腎機能を評価する上で重要です。読者は、腎機能1-4についてより徹底的に議論するために、以前に出版されたレビュー記事や教科書を参照します。
GFRは、糸球体でろ過されるが、ネフロン5に沿って分泌または再吸収されないイヌリンの定常状態の腎クリアランスとして測定できます。この技術には麻酔、外科的準備、および最終実験が必要ですが、GFR測定のゴールドスタンダードと見なされています。フルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)でタグ付けされたイヌリンを使用すると、FITC-イヌリンの血漿および尿中濃度を少量で簡単に測定でき、実験の複数の時点でGFRを計算するために使用できます。NaとKの分別排泄は、血漿と尿中のNaとKの濃度から決定できます。
腎機能の測定方法に関する概念的な理解は、学生が実....
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プロトコル
任意の動物手順、制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）の前には、プロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、ミシガン州立大学IACUCによって承認されました。
FITC-イヌリン溶液の1前のラボの準備
- 全てのイヌリンが溶解するまでゆっくりと加温20〜70℃の生理食塩水のミリリットルとは、FITC-イヌリン（5 mg / mlのFITC-イヌリン）を100mgを加えて混ぜます。
- 室温に冷却液と（基本的に、アガロースゲル電気泳動によりフリー、低エンドトキシン、≥98％純度グロブリン、40 mg / mlのBSA、凍結乾燥粉末）、ウシ血清アルブミン800mgのを追加します。
- 濾紙（グレード1）とイヌリンBSA溶液をフィルタリングします。シリンジチップフィルター（0.2μm）で、20 mlシリンジで濾過した溶液を置き、光から保護するためにホイルでカバーしています。
2.麻酔と手術
- 麻酔を誘導するために、5％のイソフルランで満たされた導入室にラットを置きます。レコードBODY重量（250〜350グラム）と、実験を通して37℃の体温を維持するように設計された加熱された外科用プラットフォーム上にラットを置きます。ゆっくり足の上に実験用テープでプラットフォームにラットを固定します。 0.8〜1.0リットル/分の空気流量で医....
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結果
ラボのデモに使用される利尿剤は非常に迅速に薬物投与の数分以内に増加したのNa、K、その結果、腎臓、および水の排泄によってフィルタリングNaおよびKの再吸収を阻害するフロセミドました。その主要なメカニズムによって、フロセミドは、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷の最小の効果を持っている必要がありますが、尿の流れを増加し、NaおよびKの分数排泄
麻酔したラットにおいて、GFRのための薬物前値の平均は3.2ミリリットル/分であったことを表3に示す代表結果、ナトリウム排泄/分0.58マイクロモル（ろ過負荷の0.1％）であり、Kの排泄は4.4でしたマイクロモル/分（ろ過負荷の27％）。フロセミド（薬物後1）、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷5分後には、影響を受けませんでした。しかし、ナトリウム排泄分画は11.5％に増加し、K排泄分画は、それぞれのフィルタ処理の負荷の63％に増加しました。 MAの測定PとHRは、フロセミドは、MAPとHR（ 表2）に最小限の影響を及ぼしたことを示しています。
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ディスカッション
血漿タンパク質に結合していないこと、自由に糸球体で濾過され、吸収されたことも、ネフロンに分泌されることもない：GFR測定のための適切なマーカーは、4つの基準を満たす必要があります。イヌリンはこれらの基準を満たすフルクトースポリマーです。その結果、イヌリンの腎クリアランスはGFR 7を測定するためのゴールドスタンダードと考えられています。実証技術はイヌリン8,9の一定の注入時に時限尿コレクションを使用して、イヌリンの腎クリアランスを決定する従来のアプローチを表しています。従来のイヌリンの測定は、分光光度計10,11によって測定されたイヌリンの定量比色決意を生成するためにアントロン法を用いて作製されています。しかし、尿および血漿の小さい体積でイヌリンの測定を容易にするための試みにおいて、イヌリンは15-17 12-14放射性、蛍光標識でタグ付けされています。このビデオUに提示ラボデモSED FITCが原因人間の放射線被曝の危険性の欠如とFITC蛍光15の測定の容易さの腎機能を測定するためのイヌリンを標識しました。
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開示事項
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。ここに含まれる意見やアサーションは、作者の個人ビューであり、公式として、または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではありません。
謝辞
GM077119：ラボのデモンストレーションのための資金源は、NIGMS助成金でした。我々は、統合および臓器システム薬理学におけるショートクーゼの彼らのサポートのために博士ジョセフ·R·ヘイウッドとピーター·コベットに感謝します。また、実験室でのデモの彼女の技術支援のためにさんハンナGarverに感謝します。
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材料
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 ウシ血清アルブミン Sigma Chemical Co A2934-25G 遠心分離機 Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG コットンチップアプリケーター Solon Manufacturing Co 56200 データ収集ソフトウェア ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digitalスケール デンバーインスツルメンツ APX-4001 FITC-イヌリン シグマ ケミカル Co F3272-1G ガーゼ スポンジ Covidien 2146 加熱手術ベッド EZ-麻酔 EZ-212 ヘパリン サグネット NDC 25021-402-10 HEPES シグマ ケミカル Co H3375 イソフルラン アボット アニマル ヘルス IsoFlo、5260-04-05 イソフルラン気化器 EZ-麻酔 EZ-190F マイクロ解剖鉗子 Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 マイクロプレート リーダー - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL、5210460 NOVA 5+ ナトリウム/カリウム アナライザー NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegarはさみ付きニードルホルダーファインサイエンスツール12002-12 PE-190(膀胱カテーテル用)BDメディカル427435圧力トランスデューサ ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann 共同105から420< / p>
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| アッセイプレート、96ウェル | 共演 | 3922 | |
| ウシ血清アルブミン | シグマケミカル株式会社 | A2934-25G | |
| 遠心分離機 | ベックマンコール | ターMicroFuge 18、357160 | |
| 円錐形サンプルチューブドット | サイエンティフィック株式会社 | #711-FTG | |
| コットンチップアプリケーターSolon | Manufacturing Co | 56200 | |
| データ収集ソフトウェア | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| デジタルスケール | デンバーインスツルメント | APX-4001FITC | |
| -イヌリン | シグマケミカルCo | F3272-1G | |
| ガーゼスポンジ | Covidien | 2146 | |
| 加熱手術ベッド | EZ麻酔 | EZ-212 | |
| パリン | サグネット | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | シグマケミカルCo | H3375 | |
| イソフルラン | アボットアニマルヘルス | IsoFlo、5260-04-05 | |
| イソフルラン気化器 | EZ麻酔 | EZ-190F | |
| マイクロ解剖鉗子 | 生物医学研究機器株式会社 | 70-1020 | |
| マイクロプレートリーダー - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ ナトリウム/カリウム分析装置 | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar ニードルホルダー (ハサミ付き | ) Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (膀胱カテーテル用) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | コーニング株式会社 | 99445-12 | |
| ラット大腿骨先細動脈カテーテル | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| 斜視ハサミ | ファインサイエンスツール | 14075-11 | |
| 学生用手術用ハサミ | ファインサイエンスツール | 91402-12 | |
| サージカルグローブ | キンバリークラーク | スターリング ニトリルグローブ | |
| シリンジポンプ | Razel Scientific | R99-E | |
| 組織鉗子 | ファインサイエンスツール | 91121-12 | |
| 組織ハサミ | ジョージティーマン Co | 105-420< | |
参考文献
- Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
- Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
- Levey, A. S.
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