このプロトコルの目的は、ラットの糸球体濾過率、尿流量、ナトリウムとカリウムの排泄を測定し計算するための原理と技術を示すことです。このデモンストレーションは、腎機能の測定方法に関する全体的な概念的理解を学生に提供するために使用できます。
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この記事について
サマリー
要約
糸球体濾過率(GFR)の測定、およびナトリウム(Na)とカリウム(K)の分別排泄の測定は、健康と病気における腎機能を評価する上で重要です。GFRは、糸球体でろ過されるが、ネフロンに沿って分泌または再吸収されないイヌリンの定常状態の腎クリアランスとして測定されます。NaとKの分別排泄は、血漿と尿中のNaとKの濃度から決定できます。イヌリンの腎クリアランスは、大腿動脈、大腿静脈、膀胱にカテーテルがある麻酔動物で実証できます。この手順に使用される機器と消耗品は、研究の中核施設で一般的に入手可能なものであるため、この手順は腎機能を測定するための実用的な手段になります。このビデオの目的は、利尿薬の前後に腎機能を評価するラボデモンストレーションを実行するために必要な手順を示すことです。提示された技術は、腎疾患のラットモデルにおける腎機能を評価するために利用することができる。
概要
腎臓の最も重要な機能は、細胞外水分と電解質含有量の恒常性調節です。腎臓は、細胞外水分、ナトリウム(Na)、カリウム(K)を密接に調節して、正常な生理学的レベルを維持しています。腎機能の障害は、致命的となる可能性のある深刻な代謝障害を引き起こす可能性があります。基本的な腎プロセスはネフロンで発生し、糸球体での血漿の濾過から始まり、尿の排泄で終わります。尿中の水分、Na、Kの最終濃度を決定する他のプロセスは、ネフロン内での分泌と再吸収です。糸球体濾過率(GFR)とNaとKの分別排泄の測定は、健康と疾患の腎機能を評価する上で重要です。読者は、腎機能1-4についてより徹底的に議論するために、以前に出版されたレビュー記事や教科書を参照します。
GFRは、糸球体でろ過されるが、ネフロン5に沿って分泌または再吸収されないイヌリンの定常状態の腎クリアランスとして測定できます。この技術には麻酔、外科的準備、および最終実験が必要ですが、GFR測定のゴールドスタンダードと見なされています。フルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)でタグ付けされたイヌリンを使用すると、FITC-イヌリンの血漿および尿中濃度を少量で簡単に測定でき、実験の複数の時点でGFRを計算するために使用できます。NaとKの分別排泄は、血漿と尿中のNaとKの濃度から決定できます。
腎機能の測定方法に関する概念的な理解は、学生が実験のいくつかの側面に積極的に参加できるように設計された短い研究室で容易に示すことができます。このビデオでは、ラボ前の準備、腎機能のデモンストレーション、およびラボ後の結果の評価を示しています。GFRの測定に必要な外科的技術は、麻酔をかけたラットで実証されています。また、利尿薬の投与前後におけるGFRの計算例、NaとKの分別排泄
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プロトコル
任意の動物手順、制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）の前には、プロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、ミシガン州立大学IACUCによって承認されました。
FITC-イヌリン溶液の1前のラボの準備
- 全てのイヌリンが溶解するまでゆっくりと加温20〜70℃の生理食塩水のミリリットルとは、FITC-イヌリン（5 mg / mlのFITC-イヌリン）を100mgを加えて混ぜます。
- 室温に冷却液と（基本的に、アガロースゲル電気泳動によりフリー、低エンドトキシン、≥98％純度グロブリン、40 mg / mlのBSA、凍結乾燥粉末）、ウシ血清アルブミン800mgのを追加します。
- 濾紙（グレード1）とイヌリンBSA溶液をフィルタリングします。シリンジチップフィルター（0.2μm）で、20 mlシリンジで濾過した溶液を置き、光から保護するためにホイルでカバーしています。
2.麻酔と手術
- 麻酔を誘導するために、5％のイソフルランで満たされた導入室にラットを置きます。レコードBODY重量（250〜350グラム）と、実験を通して37℃の体温を維持するように設計された加熱された外科用プラットフォーム上にラットを置きます。ゆっくり足の上に実験用テープでプラットフォームにラットを固定します。 0.8〜1.0リットル/分の空気流量で医療グレード100％のO 2を1〜2％イソフルランで麻酔を維持します。
- 血圧および心拍数のモニタリング、及び血液サンプリングのために大腿動脈にカテーテルテーパー（血管内先端OD、2.7F）を挿入します。
- イヌリン注入のための大腿静脈にカテーテル（PE-50）を挿入します。 5-O編み絹縫合糸6と周囲の組織にカテーテルを固定します。
- ひずみゲージ圧力変換器に動脈カテーテルを取り付けます。リアルタイムでコンピュータ画面上のデータ取得ソフトウェア、ディスプレイを使用して記録する血圧と心拍数。この技術は、映像6に詳細に示されています。
- 恥骨上切開により膀胱を公開します。小さなをカット膀胱の先端に穴や熱でカニューレ（PE-190）を挿入するには、尿採取のために、膀胱の内側に先端をフレア。巾着縫合で膀胱にカニューレを固定します。
3.尿や血液コレクション
- 1ミリリットル/体重（300グラムの重さのラットについて3ミリリットル/時）の100グラムあたりの時間の流速が設定されたシリンジポンプにFITC-イヌリンの注射器を置きます。大腿静脈カテーテルに注射器を取り付けます。イヌリンの注入を開始し、1〜2時間の平衡期間を可能にします。光から保護するために箔で覆われた注射器を保管してください。
- 尿流量が安定しており、10分の期間、予め秤量した回収バイアル中の尿サンプルを採取することにより、試料分析（20μL/分）のために適切であるかどうかを確認します。デジタルスケールで重量測定により尿量を決定します。 10分の回収期間のための適切な尿量は、0.2 mlです。二つの連続コレクションが20μL/ Mの尿流量を示すまでの尿サンプルを収集し続けますで以上。
- プレドラッグサンプル
- 20分の期間中に尿サンプルを採取します。尿収集期間の中間点において動脈カテーテルから血液サンプル（0.5ml）に収集します。 1 Uのヘパリンを含むコレクションバイアルに血液サンプルを収集する前に生理食塩水を完全に透明に動脈カテーテルに注意してください。動脈血の0.5ミリリットルの収集を容易にするために、ボリュームマーキングコレクションバイアルを使用します。
- 血液（約0.1ミリリットル）のカテーテルをクリアするためにヘパリン生理食塩水（20 U / ml）で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルの長さは、洗い流すために必要なヘパリン - 生理食塩水の量を制限することが可能な限り短くすべきです。
注：希釈された血液サンプルはGFRおよびNaとKの分数排泄の不正確な計算を生成します - 10分待ってから、第2のプリ薬物の尿と血液サンプルの収集を繰り返します。
- 2つの事前薬物サンプルの収集に続いて、利尿DRUの管理G、フロセミド（10mg / kgの）、動脈カテーテルを介し。薬物のカテーテルをクリアするためにヘパリン化生理食塩水で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルを介して空気を注入しないように注意してください。フロセミド注射の時間を記録します。
- 尿収集期間の中間点で下3時間点の各々で、10分間の収集期間中に尿サンプルを採取し、血液試料（0.5mL）を：ポスト薬剤サンプル。
- 後薬物サンプル1について - フロセミド後5分を収集します。
- 後薬物のサンプル2について - フロセミド後10分を集めます。
- 後薬物サンプル3について - フロセミド後に15分を集めます。
- 全てのサンプルが収集された後、開胸し、心臓を除去することによって機関の手順に従ってラット安楽死させます。両方の腎臓を削除します。逆カプセル化（周囲の膜を除去）し、過剰の血液を除去するために腎臓をブロット。腎臓を計量。
4。試料分析
- デジタルスケールで重量測定により、すべての尿サンプル量を測定し、記録の重み。
- テーブルトップ遠心機（1,800 XG）で遠心分離し、全血サンプルは、血漿を分離しました。小さなラベル付きバイアルに血漿サンプルを転送します。
- ナトリウム/カリウムアナライザーで尿および血漿試料中のNa、Kの濃度を分析します。
- 血漿および尿中のFITC-イヌリンの測定
- HEPES緩衝液（500mMの、pH7.4）で、ポスト薬物尿（1:10）（400：1：200〜1）から予め薬物尿を希釈します。
- 96ウェルプレート（ウェルごとに1つのサンプル）にHEPES緩衝液の標準またはサンプルを60μlの40μlを添加して、アルミホイルで覆いながら10分間混合することができます。
- の濃度についてのFITC-イヌリンの標準曲線を生成6.25、12.5、25、50、100、200、400 / mlの（ 図1）。元にマイクロプレートリーダーを使用してサンプルと標準でFITC-イヌリン蛍光を決定それぞれ485および538 nmでの引用及び発光波長。
- 4-PARAMTERロジスティック関数の回帰分析に標準の蛍光値を取り付けます。回帰関数のパラメータは、血漿および尿サンプル（ 表1）にFITC-イヌリン濃度を計算するために使用されます。
結果5.ポストラボ分析：計算
- 【尿量収集（ミリリットル）]÷[収集の時間（分）]：;尿流量（ml /分UV）を計算します
- 糸球体濾過率を計算（GFR、ml /分）：尿イヌリン濃度（/ mlの）UV（ml /分）をX]÷[血漿イヌリン濃濃度（μg/ ml）を]
- 計算フィルタリングさナトリウム負荷（μモル/分）：血漿ナトリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
- 尿中ナトリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;ナトリウム排泄率（μモル/分U のNa V）を計算します
- ナトリウム排泄分画（;％FE NA）を計算します：[U のNa V（マイクロモル/分）]÷[濾過ナトリウム負荷（マイクロモル/分）]×100
- 計算フィルタリングさカリウム負荷（μモル/分）：血漿カリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
- 尿中カリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;カリウム排泄率（μモル/分U K V）を計算します
- 計算カリウムの分別排泄（FE K;％）：[U K V（マイクロモル/分）]÷[濾過カリウムロード（マイクロモル/分）]×100
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結果
ラボのデモに使用される利尿剤は非常に迅速に薬物投与の数分以内に増加したのNa、K、その結果、腎臓、および水の排泄によってフィルタリングNaおよびKの再吸収を阻害するフロセミドました。その主要なメカニズムによって、フロセミドは、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷の最小の効果を持っている必要がありますが、尿の流れを増加し、NaおよびKの分数排泄
麻酔したラットにおいて、GFRのための薬物前値の平均は3.2ミリリットル/分であったことを表3に示す代表結果、ナトリウム排泄/分0.58マイクロモル（ろ過負荷の0.1％）であり、Kの排泄は4.4でしたマイクロモル/分（ろ過負荷の27％）。フロセミド（薬物後1）、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷5分後には、影響を受けませんでした。しかし、ナトリウム排泄分画は11.5％に増加し、K排泄分画は、それぞれのフィルタ処理の負荷の63％に増加しました。 MAの測定PとHRは、フロセミドは、MAPとHR（ 表2）に最小限の影響を及ぼしたことを示しています。
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ディスカッション
血漿タンパク質に結合していないこと、自由に糸球体で濾過され、吸収されたことも、ネフロンに分泌されることもない：GFR測定のための適切なマーカーは、4つの基準を満たす必要があります。イヌリンはこれらの基準を満たすフルクトースポリマーです。その結果、イヌリンの腎クリアランスはGFR 7を測定するためのゴールドスタンダードと考えられています。実証技術はイヌリン8,9の一定の注入時に時限尿コレクションを使用して、イヌリンの腎クリアランスを決定する従来のアプローチを表しています。従来のイヌリンの測定は、分光光度計10,11によって測定されたイヌリンの定量比色決意を生成するためにアントロン法を用いて作製されています。しかし、尿および血漿の小さい体積でイヌリンの測定を容易にするための試みにおいて、イヌリンは15-17 12-14放射性、蛍光標識でタグ付けされています。このビデオUに提示ラボデモSED FITCが原因人間の放射線被曝の危険性の欠如とFITC蛍光15の測定の容易さの腎機能を測定するためのイヌリンを標識しました。
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開示事項
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。ここに含まれる意見やアサーションは、作者の個人ビューであり、公式として、または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではありません。
謝辞
GM077119：ラボのデモンストレーションのための資金源は、NIGMS助成金でした。我々は、統合および臓器システム薬理学におけるショートクーゼの彼らのサポートのために博士ジョセフ·R·ヘイウッドとピーター·コベットに感謝します。また、実験室でのデモの彼女の技術支援のためにさんハンナGarverに感謝します。
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材料
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 ウシ血清アルブミン Sigma Chemical Co A2934-25G 遠心分離機 Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG コットンチップアプリケーター Solon Manufacturing Co 56200 データ収集ソフトウェア ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digitalスケール デンバーインスツルメンツ APX-4001 FITC-イヌリン シグマ ケミカル Co F3272-1G ガーゼ スポンジ Covidien 2146 加熱手術ベッド EZ-麻酔 EZ-212 ヘパリン サグネット NDC 25021-402-10 HEPES シグマ ケミカル Co H3375 イソフルラン アボット アニマル ヘルス IsoFlo、5260-04-05 イソフルラン気化器 EZ-麻酔 EZ-190F マイクロ解剖鉗子 Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 マイクロプレート リーダー - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL、5210460 NOVA 5+ ナトリウム/カリウム アナライザー NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegarはさみ付きニードルホルダーファインサイエンスツール12002-12 PE-190(膀胱カテーテル用)BDメディカル427435圧力トランスデューサ ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann 共同105から420< / p>
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| アッセイプレート、96ウェル | 共演 | 3922 | |
| ウシ血清アルブミン | シグマケミカル株式会社 | A2934-25G | |
| 遠心分離機 | ベックマンコール | ターMicroFuge 18、357160 | |
| 円錐形サンプルチューブドット | サイエンティフィック株式会社 | #711-FTG | |
| コットンチップアプリケーターSolon | Manufacturing Co | 56200 | |
| データ収集ソフトウェア | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| デジタルスケール | デンバーインスツルメント | APX-4001FITC | |
| -イヌリン | シグマケミカルCo | F3272-1G | |
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| パリン | サグネット | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | シグマケミカルCo | H3375 | |
| イソフルラン | アボットアニマルヘルス | IsoFlo、5260-04-05 | |
| イソフルラン気化器 | EZ麻酔 | EZ-190F | |
| マイクロ解剖鉗子 | 生物医学研究機器株式会社 | 70-1020 | |
| マイクロプレートリーダー - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ ナトリウム/カリウム分析装置 | NOVA BioMedical | 14156 | |
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| Pyrex Culture Tubes | コーニング株式会社 | 99445-12 | |
| ラット大腿骨先細動脈カテーテル | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
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| 組織鉗子 | ファインサイエンスツール | 91121-12 | |
| 組織ハサミ | ジョージティーマン Co | 105-420< | |
参考文献
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