聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化

サマリー

このプロトコルの目標は、マウスモデルにおける背側蝸牛核への直接アクセスを提供する外科的アプローチを概説することです。

要約

逮捕または難聴逆転するウイルス媒介遺伝子導入の使用の調査は、主に末梢聴覚系に追いやられています。いくつかの研究は、中枢聴覚系への遺伝子導入を検討した。聴覚路の二次ニューロンが含まれている脳幹の背側蝸牛神経核（DCN）は、遺伝子導入のための潜在的部位である。このプロトコルでは、後頭蓋窩アプローチを経由してネズミDCNの直接的かつ最大の露出のための技術が実証されている。このアプローチは、急性または生存のどちらかの手術が可能になります。 DCNの直接可視化に続いて、実験のホストは、青色光レーザに結合された光ファイバによる蝸牛神経核およびその後の刺激へのオプシンの注射を含む、可能である。そのような電気刺激と神経インジェクタトレーシングのような他の神経生理学実験は、また可能である。visualizaのレベルると、刺激の持続時間は、達成可能な実験の広範囲にこのアプローチを適用する。

概要

ウイルスを介した逆難聴への遺伝子導入は、主に末梢聴覚系に焦点を当ててきました。¹ 蝸牛を標的として、研究者は、浸透圧ミニポンプ注入²、ベクター導入遺伝子複合体に浸した Gelfoam®² またはゼラチンスポンジ³、直接マイクロインジェクション⁴;多数の遺伝子導入ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス^{ベクター5,6}、レンチウイルス^{ベクター7}、およびカチオン性リポソーム²;標的^{組織を超えた}遺伝子導入ベクターの播種2。最近では、アデノ随伴ウイルス(AAV)-1が蝸牛に導入され、小胞性グルタミン酸トランスポーター-3の喪失によるマウスの難聴を治療しています。⁸ さらに、最近、末梢聴覚系における光遺伝学の応用が説明されています。⁹

>jove_content<しかし、中枢聴覚系への遺伝子導入を調べた研究はほとんどありません。脳幹の背側蝸牛核(DCN)には、聴覚経路の二次ニューロンが含まれています。蝸牛核(CN)の遺伝子導入技術は多くの研究に利用できますが、光感受性タンパク質であるオプシンのDCNへの遺伝子導入も、光遺伝学に基づく実験技術を可能にするために利用できます。ウイルスを介したカネロドプシン-2(ChR2)などのオプシンの遺伝子導入後、DCNのニューロンは光刺激に敏感になります。光遺伝学的遺伝子導入は、ラット後台形核、マウス青斑核、サル上丘、マウス腹側被蓋野など、いくつかの脳幹領域でこれまでに試みられてきました。^10-14

最近、研究者たちはDCNにおける光遺伝学の使用について調査しました。^15,16 DCNは、ヒトに聴覚脳幹インプラントを留置する場所であり、聴覚神経プロテーゼのトランスレーショナル研究を研究する聴覚系の魅力的な部分となっています。しかし、DCNの位置を考えると、外科的曝露は困難です。本明細書に記載の技術は、マウスモデルにおけるウイルスベクター遺伝子導入および光遺伝学に基づく実験を可能にするために、後眼窩アプローチによるDCNの最大曝露のためのプロトコルを提供する。以前の研究では、チャネルロドプシン-2によるDCNへの定位マイクロインジェクションを使用していました。¹⁶ しかし、定位固定装置による注射は、特にDCNのように脳幹に沿って小さく深い核で、直接可視化による注射よりも精度が低い可能性があります。CNで組織特異的タンパク質を発現するトランスジェニックマウスも魅力的な選択肢であり、遺伝子導入の必要性を排除します。DCNの曝露に関する私たちのプロトコルは、光刺激のためにDCNを直接曝露する必要があるため、トランスジェニックマウスでも機能します。DCN の外科的曝露のためのこの技術は、マウスおよびラット モデルの聴覚神経および蝸牛核からの録音を含む以前のプロトコルから適応されています。^15,17-20

プロトコルの全体的な目標は、遺伝子導入技術を可能にするためにCNへの直接的な曝露を提供することです。より具体的には、このアプローチは急性期手術と生存手術の両方に適合し、その後の神経生理学的検査のために同じ動物で調製を繰り返すことができます。DCNプロトコルの直接曝露は、脳幹の他の核における光遺伝学およびウイルス媒介遺伝子導入ベースの実験に影響を及ぼします。

プロトコル

注：すべての実験手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーを含む全国の動物保護ガイドラインに従うマサチューセッツアイ、耳診療所とハーバード大学医学部の動物実験委員会、に従って行われる、 ILARガイド、および動物福祉法。左DCNの詳細暴露下に表示実験手順。生存手術を行いながら、無菌の楽器を使用してください。

1.プライマリ開頭と背側蝸牛神経核露出

1. 麻酔
   1. キシラジンの腹腔内投与による20mg / kgのケタミンを100mg / kgの18〜24グラム体重、高齢者8-12週間、マウスを麻酔。心拍数、呼吸数、ならびに足指ピンチ引っ込め反射を監視することによって、適切な麻酔を確認する。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を置きます。一度適切に麻酔下で、髪の上に重なるTを剃る彼は、手術部位への遮るもののないアクセスを提供するために頭皮。
2. 外科ポジショニング
   1. 鼻クランプにより所定位置に保持小動物定位ホルダー、に安全にマウスを置きます。
   2. 鼻クランプが十分な呼吸を可能にするのに十分な緩いが、完全にマウスの頭部を固定するのに十分タイトであることを確認してください。マウスヘッドが緩んでいる場合、動物は処置の開頭部分の間にヘッドホルダから脱落する可能性がある。
   3. 心拍数のモニタリングを可能にし、標準的な方法、で聴性脳幹インプラント電極を配置します。呼吸数は、視覚化することによって監視されるべきである。通常の心拍数や呼吸数は、マウスの年齢に応じて変化するであろうことに注意してください。
   4. 恒温加熱ブランケット上に配置介して温度計を配置し、euthermiaが確保される。
3. 皮膚切開と頭蓋骨のinterparietalと後頭部の骨の露出
   1. microscの下でOPE、直接耳介の間で、正中線から始まる、と後頭部の尾部に至る皮膚を介して垂直切開する。正中皮膚切開の後、横方向に皮膚を移動させる。頭蓋骨の左側の後部側面をカ​​バーする筋肉を視覚化する。
   2. メスまたはアイリスはさみと、それぞれの骨に筋肉の添付ファイルの離断によって筋肉左頭頂、interparietalの上にある、と頭蓋骨の後頭部の骨を削除します。カット筋縁に沿って、出血の小さな度合いを観察します。 10〜15秒間綿棒で穏やかな圧力によって、これを最小化します。
4. 開頭その上の蝸牛神経核
   1. 矢状及びラムダ縫合ライン（ 図1、左パネル）を含む関連縫合線を、特定します。
   2. 骨鉗子を使用して、interparietal骨の上に開頭手術をし、正中線のラムダ縫合線へ〜2mmの尾を残した。この領域は、DCNの上に重なる。
   3. FollowinGの開頭、小脳の上に重なる硬膜の薄い層を観察する。手術用メスの刃を使用して、硬膜を削除します。 （ 図1、中央のパネル）。
      注：硬膜の除去は、出血の小さな度合いを引き起こす可能性があります。硬膜を除去するために外科用メスの刃を使用したこのプロセスは、脳幹の表面とDCNの曖昧な同定にプールう小脳吸引の間の血液損失の量を低減することを目的とする。マウスの全血液量を15％以上>〜1.5ミリリットルを超えてはならないです。出血がこの量を超えた場合、マウスは、流体補充を用いて提供されるべきである。
   4. 綿棒アプリケーターで小脳を重ね凝固した血液を削除します。必要に応じて、優しく血液を血液を離れてクリアする小脳の上に歯科ポイントを使用して生理食塩水を滴下する。
5. 小脳吸引
   1. DCNのVIになるまで5フランス語吸引を使用して、DCNの上に重なる左小脳の横ほとんどの部分を吸引UAL（ 図1、右パネル）。左小脳の約1/4 1/3を削除します。 DCNに隣接した主なランドマークは、優れた半規管の膨大部である。
      注：小脳の吸引がプロトコルの重要なステップである。それが出血原因になります。このような吸引の複数のパスを持つ単一の試行で発生していない場合は、小脳の監督吸引が最も成功している。吸引を補助するために、小脳の表面にわずかに遠位されるであろう、CNの予想される深さに顕微鏡の焦点面を設定する。 CNに焦点面を設定すると、可視化を改善し、鮮明な画像が保証されます。
   2. DCNの以下の吸引、さらに出血、脳脊髄液（CSF）、ビルドアップ、及び小脳変位が期待されている。血液凝固を防ぐためにすぐに開頭術に滅菌生理食塩水0.5ccのを植え付ける。歯科ポイントと吸引優しい軽くたたくの組み合わせは、その後かもしれDCNの直接可視化するためのパスを離れてクリアするために使用。直接DCNの表面に接触しないでください。

ウイルス媒介遺伝子導入および外科回復2.圧力マイクロインジェクション

1. DCNは、その上の血液およびCSFの自由であり、はっきりと見えるした後、2分間にわたって10μlのハミルトンシリンジを使用して、DCNに圧力マイクロインジェクションを作る。
2. 先端がDCNの表面の下に見えなくなるまで、マイクロマニピュレーターで針を導入しない。
3. 最適なパフォーマンスを得るには、33または34ゲージの針を使用する薄いである、鈍的外傷を最小限にし、DCN内の注入量をローカライズするために、そのような45°と、浅いベベルと（34ゲージ針で気密注射器を使用します）と、浅い脳幹構造体（<厚さ300μm）。
   注：他のマイクロインジェクション器具ベースを利用することができる。理想的には、注射器は若干ベンを可能にするために柔軟であるべきであるD、直接DCNをターゲットにする必要がある場合。マウスは呼吸による手続きを通じて少し移動するとさらに、楽器、運動の少量に耐えるために十分に堅牢でなければなりません。

3.外科回復

1. すぐに次の注射は、皮膚を再近似するとマウスが標準の回復手順ごとに回復することができます。残りの小脳および瘢痕組織が小脳の吸引に起因する空洞内に記入します。十分な意識が胸骨横臥位を維持するために回復するまで、常に動物を監視します。心拍数、呼吸数、ならびに供給する能力をモニターする。
   注：完全に回復するまでは、動物の手術を受けた他の動物とのケージに戻している。
2. マウスは、円術後（症例の<5％）の中を歩くが開始された場合、それはおそらく困難な時期送りを持っていると同じように、通常は2〜4時間皮膚切開の閉鎖後、すぐに、マウスを生け贄に捧げる。 T彼の副作用に起因小脳の吸引に起因する可能性が高い。動物は、術後の痛みのために監視し、適切な麻薬は、制度の基準に基づいて、動物の快適性を確保するために与えられるべきである。感染の証拠があれば抗生物質は、必要であり得る。

4.セカンダリ開頭と蝸牛神経核露出

1. 癒しとウイルス媒介遺伝子導入のインキュベーションの2-4週間後、再麻酔前に注射したマウスを繰り返しステップ1.1〜1.5の最適なインキュベーション時間は、導入遺伝子の種類によって異なります。
2. ピンセット、外科用メス、および骨鉗子の組み合わせによって開頭サイト上の瘢痕組織を削除します。
3. 開頭術を可視化した後、残りの小脳及びDCNを覆う瘢痕組織の組み合わせを特定する。その上小脳/（前の小脳吸引と同様）瘢痕組織を吸引する5フランスの吸引を使用してください。
4. 吸引後、さらに出血、CSF bを期待するuildアップ、および小脳の残りのビット。すぐに血液凝固を防ぐために開頭術に生理食塩水を導入。 DCNの直接可視化するためのパスをクリアするために穏やかな歯科ポイント軽くたたくと吸引を組み合わせて使用​​してください。
5. DCNの表面を観察します。 DCNがアクセスできるようになりましたように、光遺伝学ベースの生理学実験を行う。光遺伝学ベースの実験を駆動するために、光ファイバ（ 図2）と、例えば、光刺激を導入する。

5.組織学

1. 実験の終了後、ケタミンの過剰摂取でマウスを安楽死させる。 4％パラホルムアルデヒド、続いて生理食塩水でマウスを灌流する。
2. 2時間頭蓋骨とポストフィックスから脳幹を抽出します。 24〜48時間、30％スクロース中で脳幹をCryoprotect。第60ミクロン切片を用いて、標準的なクライオスタットを用いて、脳幹。

結果

部分的な小脳吸引は蝸牛神経核へのアクセスをデモ

頭蓋骨を覆う皮膚と筋肉がそのような冠状及びラムダ縫合線として、頭蓋骨の表面ランドマークを、除去された後、開頭のおおよその局在を実証する。鉗子との開頭術の後、小脳が可視化される。小脳の小部分を注意深く吸引し、次に注入することができ、CN、（ 図1）の可視化を実証する。

ブルーライトレーザーを刺激するための二次蝸牛神経核露出

オプシンとDCN、遺伝子導入、及びインキュベーション期間の最初の曝露に続いて、DCNは、青色光レーザーによって刺激され得る。光刺激のためのDCNの表面を露出させる二次開頭術は、プライマリ開頭術（SUPP。動画1）に技術的アプローチに似ています。さDCN、厚さが300μm未満である表面構造。実験的なネズミの準備には、最大6時間のための実行可能なままです。

ディスカッション

本稿では、中央聴覚系を操作するためのマウスモデルにおけるDCNの直接可視化の技術が記載されている。直接可視化の概略アプローチは、定位アプローチである主要な代替、上の大きな利点を提供する。定位のアプローチが直接可視化を与えないのに対し、主に、DCNの直接可視化は、脳幹の部位の即時確認することができます。注入は、ターゲットの場所を「ミス」した場合場合、ウイルス媒介遺伝子移入にあるように、延長インキュベーション期間を必要とする実験では、低い感染効率の可能性がある。さらに、直接可視化のアプローチは、広い範囲の動物の年齢に注入することができます。類似の外科的アプローチは、ラットおよびモルモットのような他の動物モデルと生存実験で使用することができる。

このプロトコルでいくつかの重要なステップがあります。まず、マウスは定位ホルダーに適切に配​​置する必要があります。頭の任意の動きが困難開頭術を作ることになります。第二に、開頭の場所は非常に重要です。開頭術が適切な位置で行われていない場合は、小脳のD​​CN以下吸引の可視化は、困難、不可能ではないであろう。最後に、プロトコルの最も重要なステップは、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脳定位固定装置ホルダー	Stoelting	51500
ホメオサーミックブランケット	ハーバード507214
メスの刃 #11	Fine Surgical	Tools 10011-00
Iris はさみ	Fine Surgical Tools	14084-08
5 フレンチ吸引	対称 外科 2777914
デンタルポイント	ヘンリーSchein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 & マイクロ;l ハミルトン シリンジ	ハミルトン	7633-01
34ゲージ、針	ハミルトン
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14