海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

サマリー

このバイオアッセイは、栄養的に同等の食品マトリックスを使用して、天然の濃度での海洋生物の組織の有機抽出物からの給電抑止代謝産物の存在を評価するためのモデル捕食魚を用いる。

要約

海洋化生態学は、海洋生物の組織からの二次代謝産物の生態学的機能を調べることを目的として、1980年代に天然物化学者と海洋生態学者の協力から生まれた新しい学問です。その結果、実験アプローチの生態学的関連性をますます洗練させるプロトコルが進歩しました。ここでは、研究者が海洋生物の組織からの二次代謝産物の抗捕食活性を評価できるようにする、魚を飼う実験室バイオアッセイの最新版を紹介します。すべての極性の有機代謝物は、標的生物の組織から徹底的に抽出され、栄養的に適切な食品マトリックスに自然濃度で再構成されます。実験的な食品ペレットは、抽出物の抗捕食活性を評価するために、実験室の摂食アッセイでジェネラリストの捕食者に提示されます。ここで説明する手順では、ブルーヘッドであるThalassoma bifasciatumを使用して、カリブ海の海洋無脊椎動物の嗜好性をテストします。ただし、設計は他のシステムに容易に適合させることができます。このラボアッセイを使用して得られた結果は、潜在的な捕食者の完全な補完の摂食応答に依存するフィールド実験の重要な前奏曲です。さらに、このバイオアッセイは、バイオアッセイガイドによる分画を通じて摂食抑止性代謝物の単離を指示するために使用できます。この摂食バイオアッセイは、カリブ海のサンゴ礁における海洋無脊椎動物の分布と豊富さを制御する要因の理解を前進させ、薬理学、バイオテクノロジー、進化生態学など、さまざまな研究分野での研究に役立つ可能性があります。

概要

化学生態学は、化学者と生態学者のコラボレーションにより開発された。地上波化学生態学のsubdisciplineがしばらくの周りされているが、海洋化学生態学のはわずか数十年古いですが、海洋生物^1-8の進化生態学と社会構造に重要な洞察を提供してきた。スキューバダイビングとNMR分光法の緊急の技術を利用して、有機化学者は急速に1970年代と1980年代⁹底生海洋無脊椎動物と藻類由来の新規の代謝産物を記述する出版物を多数生成した。二次代謝産物は、経験的証拠なしに新しい化合物に生態学的に重要な特性を帰さこれらの出版物の多くは、いくつかの目的を果たす必要があることを仮定する。約同時に、生態学者は、以前あちこちに知られているスキューバダイビングの出現を利用することと底生動物や植物の分布と存在量を記述したそのような浚渫などの比較的効果サンプリング方法をメートル。これらの研究者の仮定が固着し、ソフトボディの何かが化学的に捕食者¹⁰によって消費を避けるために擁護しなければならないということでした。種の存在量にそうでなければ説明的な作業だったものに経験主義を導入するための努力では、いくつかの生態毒性アッセイ¹¹からの化学防御を外挿する開始しました。最も毒性アッセイは半アッセイ生物を死滅させるために責任の抽出物の乾燥質量濃度の後続の決定に、脊椎動物の組織の粗有機抽出物の水性懸濁液に、魚全体、または他の生物の曝露を含んでいた。しかし、毒性アッセイは、潜在的な捕食者は、自然条件の下で獲物知覚している様子をエミュレートしていない、とその後の研究では、毒性や嗜好性^12-13の間には何の関係は認められません。それは、権威ある雑誌に出版物はほとんど、あるいは全くecologicaを持つ技術を使用していることは驚くべきことであるLの関連性^14-15、これらの研究はまだ広く引用されている今日。これは、毒性データに基づいて、研究は^16〜18を発表され続けることに注意することは、さらに憂慮すべきである。明細書に記載のバイオアッセイ法は、antipredatory化学防御を評価するために、海洋化学生態学者のための生態学的に関連したアプローチを提供するために、1980年代後半に開発されました。方法は、より生態学的に意味のある毒性データよりも嗜好性データを提供する、栄養的に同等の食品マトリックス中の天然の濃度で標的生物からの粗有機抽出物をサンプリングするために、モデル捕食者を必要とする。

海洋生物の組織のantipredatory活性を評価する一般的なアプローチは、4つの重要な基準は、（1）適切なジェネラリスト捕食者は、摂食アッセイにおいて使用されなければならない、（2）すべての極性の有機代謝産物は徹底的の組織から抽出されなければならない生物体を標的とする、（3）代謝産物をbしなければならないeは、それらを抽出した生物に見られるのと同じ体積濃度で栄養的に適切な実験食品に混入、及び（4）実験デザインと統計的アプローチは、相対的なdistastefulnessを示すために意味のある測定基準を提供する必要があります。

以下に概説する手順は、カリブ海の海洋無脊椎動物でantipredatory化学防御を評価するために特別に設計されています。この種はカリブ海のサンゴ礁に一般的であり、底生無脊椎動物¹⁹の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られているので、私たちはモデル捕食魚として、blueheadベラ、Thalassoma bifasciatumを採用。標的生物由来の組織は、まず、抽出された食品の混合物と混合し、最終的にTのグループに提供されbifasciatumは、それらが抽出処理された食品を拒否するかどうかを観察した。この方法を用いたアッセイのデータは、海洋生物^12,20-21、Lの防御的な化学に重要な洞察を提供してきたIFE履歴トレードオフ^22-24、およびコミュニティ生態学^25-26。

プロトコル

注：このプロトコルのステップ3は、脊椎動物動物被験体を伴う。手順は、動物は、可能な限り最も人道的な扱いを受けるように設計されており、ノースカロライナ州ウィルミントンの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

1）組織の抽出

1. これは二次代謝産物の体積濃度が変更されますように絞った、乾燥したアウトまたは過度に湿った水和のその自然の状態ではないです組織を使用してください。 50mlの遠心管に挿入することができる断片またはスライスに組織を切断またはチョップ。注：新鮮な組織は、いくつかのケースで使用することができるが、それは時カットを圧迫を受けない凍結組織を、切断又は切るほうが良い場合が多い。
2. 40ミリリットルの最終体積に達するまで目盛り遠沈管にジクロロメタンの1：1混合物（DCM）およびメタノール（MeOH）で30 mlに1の組織片を追加する。移転すべてのステップを実施するようにしてください適切な換気と換気フード中の溶剤。
3. チューブに蓋をし、それを数回転倒し、4時間の抽出期間中に繰り返し攪拌する。注：この期間中、水はMeOHで結合し、得られたメタノール：水相をDCM相から分離する。組織を交互DCMおよびMeOHにさらされる：チューブなどのエマルジョン等の水が攪拌される。
4. 丸底フラスコにDCM抽出物を移し、低熱を使用して、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで蒸発させ（<40℃）。最小限の溶媒を用いて20mlのシンチレーションバイアルに乾燥した抽出物を移す。ロータリーエバポレーターアダプタでバイアルを取り付け、再び弱火を使用して、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固する（<40℃）。
   注：（1）ナット（2）、ワッシャー、および（3）ドングリナット：次のステップでは、ねじロッドの端部上に順番に以下の項目をねじ込むことによって組み立てることができる自家製圧迫器の使用を必要とする。ワッシャーは、穿孔またはいずれかでなければなりませんそれを50mlの遠心分離管の内径よりも小さくなるように嵌め込ま。
5. 圧縮により組織から抽出媒体を絞る、水抽出：組織およびMeOHを含んで目​​盛り遠心管に戻る。 MeOHを転送：同じ丸底フラスコに、水抽出物を、冷却保存（<10℃）。
6. 水抽出物：今、脱水組織は2から6時間の期間の第二の抽出のために水没されるまで、新たなMeOHをメタノールを含む冷却丸底フラスコに抽出転送した後、卒業した遠心管にメタノールを追加します。組織が完全に抽出されなかったことをいずれかの懸念がある場合は、2〜6時間のメタノール抽出を繰り返す。
7. 低熱を使用して、ロータリーエバポレーターでメタノールを乾燥（<40℃）。丸底フラスコをすすぎ、MeOH中の最小体積を用いて、乾燥した非極性抽出物を含有するシンチレーションバイアルに丸底フラスコから残りの水性抽出物を移す。
8. E真空濃縮器で弱火（<40℃）を使用して乾燥するまで水抽出物をvaporate。シンチレーションバイアルは現在、組織の10ミリリットルの総乾燥粗製の有機抽出物を含有する。密栓し、酸化を防ぐためにN ₂ガ ​​スをバイアルのヘッドスペースを排気し、ストアは凍結（-20℃）。

2）食品の準備

1. 凍結乾燥したイカマントル粉末を準備します。
   注：イカマントルは、他の底生無脊椎動物のものに匹敵する、および2.2のサブ工程の原料として使用される栄養源を提供する。
   1. 温かい脱イオン（DI）水中のイカマントルの融解凍結リングは、その後、高速ブレンダーでそれらをピューレ。
   2. 浅いクッキーシートと凍結にピューレイカマントルの薄層を注ぐ（-20℃）、次いで凍結乾燥される小さな断片に凍結されたイカピューレのシートを破る。
   3. FRの操作方法以下の凍結イカマントルピューレを凍結乾燥eezeドライヤー。
   4. 粉末を形成するために、高速ブレンダー中でイカマントルピューレの凍結乾燥された部分を粉砕する。
   5. ヒュームフードでは、回転小麦粉ふるいに粉末状のイカ外套を注ぐと微粉末から組織の大きな塊を分離するためにふるいにかける。
   6. 密封可能容器に微粉末イカ外套を転送します。酸化を防止し、凍結保存するためのN ₂ガ ​​スで容器のヘッドスペースを排気する（-20℃）。
2. 食品の混合物を準備します。
   注：必要に応じて、複数の連続した​​アッセイを実行するとき、それは〜食品の混合物の100ミリリットルを用意することが現実的である、しかしこのレシピは、より小さなボリュームにスケーリングすることができる。
   1. 3グラムアルギン酸150mlのビーカー中で脱イオン水100mlで5gの凍結乾燥したイカマントル粉末の混合物を組み合わせる。粉末が完全に水和され、混合物が均質になるまで数分間ミクロ激しく攪拌する。
      注：必要に応じて、食品着色料本STで添加することができるEP：それはむしろ追加することによって、抽出物処理混合物の色にマッチしようとするよりも、両方の処置および対照の混合物が生成されます食品混合物（抽出物処理混合物中の抽出物の天然色素をマスキング）に染料を追加する方が簡単です対照混合物に染料。緑がかった、または茶色がかった食品の色、粗抽出物中の任意の顔料をマスクすることが望ましい場合が多い。
   2. 卒業シリンジに食品の混合物の正確に10ミリリットルをロードします。このプロセスの間に気泡の混入を避けるように注意してください。
   3. 冷凍庫からの乾燥原油有機抽出物を20ミリリットルのシンチレーションバイアルを取り外します。その後ミクロとの均一な混合物にエキスをかき混ぜる、メタノールの低下や2を追加します。
   4. 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに食品マトリックスのロードを10mlシリンジを取り出し、抽出物処理食品混合物を均質化するためにミクロでかき混ぜる。
      注：小さい増分（IEで注射器を取り出すために役立つことがあり、2ミリリットルを取り出し、均質化する場合、R。すべての10ミリリットルまでのEPEAT）が均質化されています。
3. アッセイペレットを準備します。
   1. シリンジにエキス混合物（約1 ml）を、非常に小さなボリュームをロードし、0.25 MのCaCl ₂溶液にシリンジ先端を水没。長い、スパゲッティのようなストランドを形成するために、シリンジの内容物を取り出します。
   2. 数分後、その後、かみそりの刃でガラスカッティングボード上に4ミリメートル長いペレットにそれをチョップ、硬化ストランドを削除海水をですすぐ。
   3. 繰り返しますコントロールペレットを作るために組織抽出物を含まずに2.3.1と2.3.2を繰り返します。溶剤添加のために制御する（ステップ2.2.3で扱わ混合物にメタノールを添加することを参照のこと）、溶媒の等量の制御ペレットを扱うようにしてください。陰性対照は、そのアッセイの魚を確認することが望まれる場合、給電思いとどまることができ、2 mgのmlの濃度で安息香酸デナトニウムを追加^-1生食液^27。

3）嗜好性バイオアッセイ

1. 野生捕獲黄相blueheadベラと摂食アッセイを行う、Thalassomaのbifasciatumは、実験室の水槽の不透明な両面区画に3のグループに保管。
2. ゴム球付きガラスピペットを用いて、海水のビーカーから食物ペレットを配信。注：この方法で食べ物を受け取るために魚を訓練するために数日かかる場合があります。食品の配達の前に条件刺激（水槽のガラスにピペットの例えば数回タップ）は、食物ペレットの追加を期待する魚を訓練するために役立つことがあります。
3. スコアリングペレット。容易に魚が消費する場合は、受け入れられたペレットを考えてみましょう。彼らの口腔にそれを取るために1つ以上の魚による3回の試行の最小の後に食べていない場合は、拒否されたペレットを考えて、またはペレットは、そのような試みの後に接近され、無視されている場合。
4. スコアリングのサンプル。注：アッセイ手順は、 図1のフローチャートとして示されている食べたがらない魚のグループ。プロトコルの任意のステップにおいて、制御ペレットはさらに考慮されない。アッセイの一回の実行の2潜在的な結果があります。サンプルは、承認または拒否されるか。
   1. 魚のグループが協力的であることを確認するために、制御ペレットで始まる。治療ペレットを提供します。魚が扱わペレットを受け入れると受け入れとして、サンプルスコア。魚が扱わペレットを拒否した場合、魚が給餌を中止しているかどうかを判断するために次の制御ペレットを提供します。魚はその後の制御ペレットを受け入れると拒否されたとして、サンプルスコア。
5. レプリケーション。各抽出物のための魚の10の独立したグループでアッセイ手順を繰り返します。

4）評価の意義

1. フィッシャーの正確確率検定²⁶の修正バージョンで処理されたペレットVSコントロールの消費量の差の有意性を評価します。制御のための限界​​合計と扱わペレットが固定されているように、テストを変更します、ランダムサンプルとしてそれらの両方を処理する。注：7ペレットを食べているときには、p = 0.057を提供します。 7以上のペレットを食べている場合は、したがって、すべての抽出物は、6個以下のペレットが食べられている場合には抑止力とみなされ、口当たりている。
2. 抽出物のグループ間の相対的な嗜好性を比較するために、各グループ内で食べられたペレットの平均数を計算します。ペレットの平均数は+標準誤差（SE）≤6を食べている場合ので、反復抽出物のグループが抑止力と考えられている6ペレットしきい値を保管してください。注意：代表的な結果では、グループ割り当ては、種であるので、複製する抽出物は、異なる個体に由来する相対嗜好性は、種間で比較することができる。

結果

ここでは、一般的なカリブ海のスポンジの6種（ 図2）については、このバイオアッセイの結果を報告する。これらのデータは、最初Pawlik らによって1995年に出版された^。12と共起する分類群の間で化学防衛戦略の違いを調査するために、このアプローチの力を証明している。結果は、それぞれの種のために、標準誤差（SE）+食べ食物ペレットの平均数として報告した。ほとんどないペレットはAgelasのclathrodes、アムピメドーンcompressa、及びAplysinaのcauliformisからの粗有機抽出物を用いるアッセイで食べました。これとは対照的に、 カリ膣、Geodiaのgibberosa、及びMycaleツメガエルからの抽出物で作られたペレットは容易にアッセイ¹²で消費された。 6未満のペレットは、最初の3種のために食べられたので、彼らはかなりの抑止力と考えられた。対照的に、第2の3種は、対照からの有意差はなかった、とあった口に合うと考えた。

ディスカッション

明細書に記載の手順は、海洋生物にantipredatory化学防御を評価するための比較的単純な、生態学的に関連する研究室プロトコルを提供する。ここでは、メソッドのこのセットによって満たされる重要な基準を確認してください。

（1）適切な捕食者を。この送りアッセイはblueheadベラ、Thalassoma bifasciatum、カリブ海全域サンゴ礁上で最も豊富な魚の1を採用しています。 blueheadは底生無脊椎動物¹⁹の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られてジェネラリスト肉食動物です。ジェネラリスト捕食者は、サンゴ礁上の捕食魚の大半はジェネラリストであるため、これらの初期アッセイのための最良の選択であり、それは防御を回避する機構を進化させてきたことが専門家の捕食者とは対照的に、antipredatory防御が広く、それらに対して向けられることが予想される。シングル潜在的な捕食者を使用する化学防御の実験室での調査はである10現場条件^28-33の下で潜在的な捕食者の完全な補完の応答に依存している...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ジクロロメタン	フィッシャーサイエンティフィ	D37-20
ノール	ッシャーサイエンティフィ	A41220
無水塩化カルシウム	ッシャーサイエンティフィック	C614-500
クライオクール伝熱流体	フィッシャーサイエンティフィック20-548-146		真空濃縮器用
アルギン酸ナトリウム塩高粘度	MPバイオメディカル
イカのマントルリング	N/	A N/A	食料品店で購入可能
安息香酸デナトニウム	アルドリッチ	D5765
50 ml 目盛り付き遠心分離管	フィッシャー・サイエンティフィック	14-432-22
20ml シンチレーション・バイアル	フィッシャー・サイエンティフィ	03-337-7
ディスポーザブル・パスツール・ピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	13-678-20D
パスツールピペット用ゴム球	フィッシャーサイエンティフィ	03-448-24
ペレット配送用赤色電球	フィッシャーサイエンティフィック	03-448-27
250 ml 丸底フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	10-067E
ロタバップ用シンチレーションバイアルアダプター	フィッシャーサイエンティフィ	K747130-1324
ウェイトボート	フィッシャーサイエンティフィ	02-202B
マイクロスパチュラ	フィッシャーサイエンティフィック	21-401-10
5 ml 目盛り付きシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	14-817-53
10 ml 目盛り付きシリンジ	フィッシャーサイエンティフィ	14-817-54
カミソリ刃	フィッシャーサイエンティフィック	S17302

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