マウスにおける自発運動と不安様行動を測定するために、オープンフィールド迷路の利用

サマリー

A プロトコルは、実験用マウスモデルの一般的な自発運動活動、不安、感情にアクセスするために、オープンフィールド迷路を使用するために提供されています。

要約

動物モデルは、行動のメカニズムに関する質問に答えようとする研究者にとって非常に貴重であることが証明されています。オープンフィールド迷路は、動物モデルの行動を測定するために最も一般的に使用されるプラットフォームの1つです。これは、一般的な歩行能力から対象動物の感情に関するデータまで、さまざまな行動情報を提供する高速で比較的簡単なテストです。げっ歯類モデルに関連するため、この手順により、実験室で飼育されたマウスと野生捕獲されたマウスまたはラットの異なる系統の研究が可能になります。また、この技術は、抗不安作用や抗不安作用のためのさまざまな薬理学的化合物の研究にも容易に適しています。ここでは、マウスの行動を記述するためにオープンフィールド迷路を使用するためのプロトコルが詳細に説明され、C57BL/6マウスの2つの系統間の一般的な自発運動能力と不安関連の感情行動の簡単な分析が行われます。簡単に言えば、記載されたプロトコルを使用して、野生型マウスは、年齢を一致させたノックアウトマウスよりも不安関連行動が有意に少なかったことを示していますが、両方の系統は同様の歩行能力を示しました。

概要

オープンフィールド迷路(OFM)は、1934年にげっ歯類¹の感情を測定するためのテストとして最初に開発されました。それは、動物心理学²において最も広く使用されている行動尺度の1つであるという地位を獲得しています。これは、被験者へのトレーニングを必要とせず、テストを管理する人間に対する専門的なトレーニングをほとんどまたはまったく必要としない、明確に定義された行動の簡単でかなり迅速な評価を提供します。これらの特性により、子牛、豚、ウサギ、霊長類、ミツバチ、ロブスターなどの他の動物種にまで及ぶ研究で、オープンフィールド迷路が広く利用^{されるようになりました3。}その人気の一部は、テストの根底にある心理学的および生理学的概念が一般的に単純でよく理解されているという事実から生じています。 例えば、進化の力が動物に共通の反応を選択し、ほとんどの種が特定の刺激に対して不安媒介性の恐怖や逃走反応を示すと仮定されてきた。たとえば、げっ歯類は、大きく、明るく、明るく、開放的で未知の環境に対して明確な嫌悪感を示します⁴。彼らは、これらのタイプの環境を危険と見なすように系統発生的に条件付けられてきたと推測できます。これらの機能はすべてオープンフィールド迷路に組み込まれており、行動パラダイムテストでの使用の基礎を形成しています。

オープンフィールド迷路は、対象者が脱出するのを防ぐのに十分な高さの壁で囲まれたエリアで構成されています。典型的な迷路の形状は、テスト対象のサイズに基づいて、迷路の中心に開放感を引き出すのに十分な大きさの領域を持つ円形または正方形です。オープンフィールド迷路では、多くの変数を採点でき、ほとんどのパラメーターにはさまざまなタイプの運動活動^{が含まれます2}。歩行は研究された最も一般的な行動ですが、潜伏時間や飼育などの他の行動も測定できます。ほとんどの場合、げっ歯類の行動は裸の迷路で分析されます。しかし、迷路の床に1つまたは多数の物体を追加することで、被験者が新たな追加刺激²とどのように相互作用するかを見る能力が加わる。オブジェクトが提示されるときに関連するパラメータは、通常、オブジェクトへのアプローチの数、または場合によっては、あるオブジェクトが別のオブジェクトよりも優先または嫌

悪されます。

多くの不安行動テストは、被験者の動物の身体活動と^{移動運動に基づいています}5。運動活動などの非感情的な交絡因子を分離しながら、感情性の行動テストを解釈することは、激しい議論の対象となっています^6,7。 OFMが最初に記述されたように、感情の2つの尺度、自発運動活動と糞便ボリ沈着または排便¹を推論できます。しかし、これら2つの尺度は、げっ歯類の感情が多次元であるという結論を支持するいくつかの研究で無関係であることが示されている⁵。いずれにせよ、これらの測定値に関する文献の不一致や、マウスモデルにおける感情や不安は、分析基準の違いや試験手順の違いに起因する可能性があります。研究によると、^{マウスモデルを比較する}と、OFM分析の結果が他の不安の尺度と決定的に関連しています8。

プロトコル

注：ここに実行されたすべての手順は、に提出され、動物実験委員会（研究コンプライアンス室）によって承認され、NIHガイドライン以下の行われたました。行動試験パラダイムで使用されるマウスは、ナイーブと他のテストには使用されませんでした。このプロトコルで使用されるC57BL / 6野生型およびノックアウトマウスは^、9以前に記載されており、ここに示されたデータは、その原稿からのものである。

テストルームとオープンフィールド装置の作製

1. 4活動チャンバーからなる複数の単位オープンフィールド迷路（OFM）を使用するこの分析（ 図1）のために使用した。各チャンバ50センチメートル（長さ）を測定した50センチメートル（幅）38センチメートル（高さ）×白と高密度非多孔性プラスチックから作られたxは。
2. 迷路の壁が滑らかであったが、歩行時のトラクションのための迷路の床を質感。迷路の象限は、この試験の目的のために完全に空だった。このプロトの残りの部分を考慮して鞍部、上述の迷路の単一象限はOFMを実証するために利用される。
3. 使用前に、前の主題をマウスで左どんな香り手がかりを除去するために次の試験の前に95％エタノールを有するチャンバを拭きます。
4. エタノールは、試験前のマウスに完全に蒸発することを許可する。これは、各テストセッションの間に5〜10分かかる場合があります。
5. この分析のために、マウスの動きを記録し、評価するPanLab /ハーバード装置からSMARTビデオ追跡ソフトウェアを使用しています。
   注：すべての商用ビデオ追跡カメラおよびソフトウェアは、被験者を追跡し、オープンフィールド迷路の結果を評価することができる。エンドユーザがキャリブレーションする方法を理解し、個々の分析のために使用されるソフトウェアを実行することは非常に重要である。カメラおよびソフトウェアが正しく製造業者の指示書に従って較正されたときにかかわらず使用されるビデオカメラやトラッキングソフトウェアの、最良の結果が得られる。
6. テストIを実行します標準迷路装置及びソフトウェアを実行するために必要なコンピュータを含むことが可能な照明された部屋をナ。天井に取り付けることにより、カメラのレンズが全体迷路領域（ 図2）を見ることを可能にする任意の高められたサポートシステムのいずれかを使用して迷路の上にビデオカメラを中断する。
7. テストの人間の管理者として、マウスの動作に影響しないように迷路内の被験者によって完全に観察不能であることが部屋に十分なスペースを用意してください。

2.活性を測定するためにソフトウェアの準備

1. ビデオ追跡ソフトウェアを開きます。
2. ソフトウェアが開かれると、「データ収集」タブと、このオプションを開くには、シングルクリックの下に位置する「シングルターゲット追尾」オプションにカーソルを移動。
3. 画面の下部にある「静的背景」オプションを選択します。
4. 「静的背景」を選択した後選んだあるnは、その前の被験者の添加迷路の画像を撮影するためのソフトウェアを使用する必要がある。これを行うには、画面とシングルクリックの下部にある「写真」ボタンにカーソルを移動します。
   注：ソフトウェアは、追跡プロセス中に撮影された画像から減算される被験者なしシナリオを撮影します。これは、被写体の動きをソフトウェアにより分析されることになる。
5. 上記撮影した背景画像が完全に画面の下部にある「テスト」ボタンにカーソルを移動し、一度クリックすることにより、追跡ソフトウェアによって除去されることを確認します。背景画像が完全に追跡画像から削除された場合、白色の固体フィールドが表示される。照明条件が変化したり迷路を誤って移動した場合は、2つのイメージが完全に一致していないことを示す、このフィールドに黒の「影」を参照してくださいます。この状況を解決するには、単にサントを繰り返すP上記2.4。
6. 背景の設定を確認した後、時間が取得時に制御されている方法を設定するタイミングオプションを使用します。これを行うには、「設定」タブにカーソルを合わせ、「タイミング」の見出しを一度クリックしてください。実験パラメータを入力するために、新しく開いたウィンドウを使用してください。
7. このプロトコルのために、10分間の追跡期間として「プログラムされた時間」オプションを選択しました。迷路の中央にマウスを置くと追跡の開始前に離れて移動するためのユーザーの時間を可能にするために5秒に「​​潜伏期間」に設定します。試験期間のための10分の「取得時間」と入力します。自動的にカメラとソフトウェアのトラッキング機能をオフにします」プログラムされた時間（10分）が終了すると "に設定し「停止制御」を設定してください。
8. すべてのタイミングは、ウィンドウを閉じるように設定された後、「閉じる」ボタンにカーソルを移動します。これで、テストを開始する準備ができました手順をる。

オープンフィールド試験の3.管理

注：このプロトコルで使用されるソフトウェアパッケージは、一度に最大16の個々のマウスの追跡を可能にする。完了を容易にするために、上述したように、ここで説明するプロトコルは、OFMの単一象限を使用して、単一のマウスである。このプロトコルの使用中の機器については、4個々のマウスの最大は迷路の各象限を使用して追跡することができた。複数エンクロージャー迷路を利用した場合は、その定義された象限に第一の主題のマウスを配置した後、分析を追跡するための、それぞれの迷路の象限に残りのマウスを置く。このプロトコルの目的のために、さらなる命令は、迷路の単一象限に特異的である。

1. 試験室に彼らの住宅の部屋から自分のホームケージでマウスを持参してください。マウスは、試験の開始前に最低30分間​​処置室に順応できるようにします。
2. シングルMを削除そっとその尾をつかんでホームケージからウーズと同時にマウスの動きの追跡を開始するには、[開始]ボタンをシングルクリックすることでSMARTソフトウェアを起動しながら、オープンフィールド迷路の中央にマウスを置く。マウスは迷路の周囲の壁とリリースのタイミングに速やかに移動し、マウスのキャプチャをトラッキングこの動きを記録するために一致すべきであるのは正常です。
3. 、追跡ソフトウェアは動きを記録します、その間に1つの10分の期間（ 図3）のために迷路のそれぞれの象限を通じて主題マウスの自由と途切れない移動を可能に。
4. 試験期間の終わりに、静かに主題マウスを拾う迷路からそれを削除し、そのホームケージに戻す。
5. 迷路をクリーニングする前に、視覚的に迷路に存在する糞丸薬ペレットをカウントし、手動で、さらなる分析のための番号を記録します。
6. すべての糞を削除し、排尿の全てのスポットを拭き取る。 95％のエタノールで迷路象限の床と壁をスプレーし、清潔な紙タオルで拭いてください。事前の他のマウスの試験に完全に乾燥さエタノール溶液を許可する。
7. 次のマウスを使って手順を繰り返します。

4.測定とテスト手順の間挙動の解析

注：測定のために、オープンフィールド行動の三つの側面が容易に（説明を参照してください）​​このプロトコルを使用して特徴づけられる。ビデオトラッキングソフトウェアでこれらの測定値にアクセスする方法についての簡単な命令は以下の通りである。

1. SMARTソフトウェアのメイン画面から、ゾーンエディタを開くには、「ゾーン」タブをシングルクリック、「定義」にカーソルを移動します。
2. SMARTソフトウェアのユーザーズマニュアルの詳細な手順は、追跡経路上にオーバーレイするゾーンまたはグリッドを定義しない従ってください。ここでは、ソフトウェアは、迷路の床をカバーする10cmの正方形（5×5グリッドを定義するために使用された図4）。事前のゾーンエディタを閉じるに作成したゾーンファイルを保存してください。
3. SMARTソフトウェアのメイン画面から、「分析」タブにカーソルを移動して、単一のデータ分析]ウィンドウを開きます。
4. 「ファイル」タブにカーソルを移動し、上記で作成したゾーンファイルを開きます。
5. 「設定」タブにカーソルを移動し、「トラック分析」オプションを開きます。これは「シングル主題分析の設定」ウィンドウが開きます。
   1. 「標準」タブにカーソルを移動し、含まれるパラメータボックス（右側）に使用可能なパラメータボックス（左側）から「同伴距離」パラメータを移動します。
   2. 「ゾーントランジション」タブにカーソルを移動し、上記のように含まれるパラメータボックスにすべての適切なパラメータを移動します。
   3. 「フルトラック」ボックスがウィンドウの下部にチェックされていることを確認してください。
   4. モーOKボタンにカーソルをVEの、シングルサブジェクト解析設定ウィンドウを閉じます。
      注：あなたが実行したい分析によっては、他の多くのオプションが解析から、鉱山データに、このウィンドウで選択することができます。パラメータは、あなたのデータの分析のために最も重要であるか決定するためにあなたの特定のプログラムの詳細な取扱説明書をお読みください。
6. プログラムウィンドウの左上の[ファイル]タブの下では、単一の対象トラックウィンドウを開き、分析されているすべてのトラックの横にチェックマークを付けます。ウィンドウの上部にあるチェックマークボタンにカーソルを移動し、トラックExplorerウィンドウを閉じます。
7. データ解析ウィンドウ内の「移動」ボタンにカーソルを移動し、シングルトラックデータの分析を開始するためにクリックします。
8. 分析データは、いずれかのASCIIテキストフ​​ァイルとして出力することができるか、または直接EXCELスプレッドシートにエクスポートすることができる。出力DAには、使用しているソフトウェアプログラムの出力ツールを使用して、あなた自身の使用のためにTA。
   注：総移動距離と指示されたゾーンで過ごした時間は、上記で概説したデータ分析の手順に従って出力されます。ここでも、ここに表され、これらの測定に到達するまでの手順を使用し、ユーザソフトウェアによって異なりますことを強調している。しかし、データ自体と結果の解釈は、使用されるソフトウェアプログラムの同じような独立している必要があります。これは、収集されたすべてのデータは、ソフトウェアではなく、管理者が測定したデータを定量化し、試験管理バイアスが、このプロトコルから取り出されていることも注目に値する。以上説明のように収集されたデータへのqualifiable要素は存在しない。

結果

ほとんどの場合、試験したマウスの株当たりの個体の平均数は約20で十分な統計的関連性を生成することである。しかし、この数は、マウスの可用性に応じて8-30の範囲にすることができる。必要な測定または比較に応じて、年齢をマッチさせた被験者を使用することも好ましい。

オープンフィールド迷路に測定するための第一と間違いなく最も重要な特定のパラメータは、総歩行距離です。測定単位は、比較目的のためには無関係であるが、それはほとんどの場合、メトリック測定（cm）のように表される。ここでは（ 図5）に提示実験データでは、野生型（WT）または正常C57BL / 6マウスは、特定のノックアウトC57BL / 6マウス系統（KO）と同様の歩行能力を示す。横断総距離は株または治療の間で類似している場合には自発運動が効果的equaから削除されるため、感情的な行動のさらなる分析が簡略化されているる。試験したマウスの運動能力に大きな差がある場合は、さらにそのような迷路の特定の指定区域で過ごしたゾーンエントリや時間などの分析を代わりに歪みや治療効果の非アクティブが原因でスキューする...

ディスカッション

オープンフィールド迷路は、動物行動研究において最も広く使用されているプラ​​ットフォームのひとつです。 ^2,4 OFMの実行中に収集し、分析することができる重要な従来の動物行動学パラメータの数。これらのデータは、研究者は、全体的な運動活性から不安関連感情的な行動⁸に至るまでの行動を測定することができます。しかし、OFMの使用はその欠点がないわけではない。 One交絡の問題は、すべてのテストセッション中に操作することができ、静的変数の広い範囲です。例としては、時間、照明条件及び新規物体を含めることがあります。アプリケーションの広域スペクトルをサポートするために不可欠な実験プロトコルのセットアップやデザインの変動は、それが困難な研究を比較することができます。そのような別の背景またはトランスジェニックマウス系統として受けたときの変動、および薬物治療が含まれ、テストの比較が困難であるがさらに増大させることができる。これらの問題にもかかわらず、OFMは齧歯類行動研究において最も広く適用される技術の一つである。ここでは、それは、マウスの不安および情動に関連するOFM及びそれらの分析から得られた結果を議論す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マルチユニットオープンフィールドテスト	サンディエゴインスツルメンツ社	ホワイト 7001-0354	任意のシングルまたはマルチユニットのオープンフィールド迷路を使用することができます
SMART DTトラッキングソフトウェア	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	このプロトコルでは、任意のトラッキングソフトウェアを利用することができます
ソニー990xビデオカメラレコーダー		ソニーCCD-TRV328	任意の適切なビデオカメラをトラッキングプロファイルを記録するためにコンピュータに接続することができます。