多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Summary

緑色蛍光タンパク質遺伝子の発見以来、蛍光タンパク質は分子細胞生物学に影響を与えてきました。このプロトコルは、遺伝子工学による異なる蛍光タンパク質の発現が個々の細胞のバーコード化にどのように使用されるかを説明しています。この手順により、細胞混合物中の異なる集団を追跡できるため、マルチプレックスアプリケーションに最適です。

Abstract

蛍光タンパク質、蛍光色素、蛍光色素は、一般的に分子細胞生物学の分野に革命をもたらしました。特に、蛍光タンパク質とその遺伝子の発見により、局在化のためのタンパク質融合体のエンジニアリング、目的のタンパク質の転写活性化と翻訳の解析、または個々の細胞と細胞集団の一般的な追跡が可能になりました。蛍光タンパク質遺伝子とレトロウイルス技術の組み合わせにより、これらのタンパク質を哺乳動物細胞で安定的かつ信頼性の高い方法で発現させることがさらに可能になりました。ここでは、これらの遺伝子を利用して、細胞集団内の細胞に独自のバイオシグネチャーを与える方法を示します。バイオシグネチャーはレトロウイルス技術によって達成されるため、細胞は「無期限」にバーコード化されます。そのため、バーコード化された細胞の混合物内で個別に追跡し、より複雑な生物学的アプリケーションに利用することができます。細胞混合物中の異なる集団の追跡は、多数の標的に対する薬物の発見や異なるプロモーターの活性化プロファイルなど、マルチプレックスアプリケーションに最適です。このプロトコルでは、異なる遺伝的蛍光マーカーを使用してバーコード化された哺乳類細胞をエレガントに開発および増幅する方法、および一度に複数のマーカーを使用するか、異なる強度で1つのマーカーを使用する方法について説明します。最後に、このプロトコルでは、細胞を細胞ベースのアッセイと組み合わせてさらに利用し、マルチプレックスによる分析能力を高める方法を説明しています。

Introduction

そのような蛍光分光法などの技術、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、すべてが、蛍光に広く、生化学的、生物医学的、及び化学的用途において利用性を依存している。蛍光、内因性または標識を介して、タンパク質発現パターンおよびプロファイル、細胞の運命、タンパク質相互作用及び生物学的機能^1-9の分析のために利用され、されているかどうかの生体分子相互作用及び立体配座の変化を検出するための蛍光/蛍光共鳴エネルギー移動を介して^10-13。 オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質^（GFP）14の単離以来、他の刺胞動物、特にサンゴからの追加の天然に存在する蛍光タンパク質の発見は、大部分が識別可能な励起/発光スペクトルを有する既存の蛍光タンパク質の数が増加している。一緒に彼らの遺伝子に変異を導入し^15-19とこれら、HAVEさらに、顕微鏡を利用する研究者に利用可能な蛍光タンパク質の真のパレットを取得し、可能性を拡大し、フローサイトメトリーとその研究のために他の蛍光ベースの技術。

並行して、独立しているが、レトロウイルス技術の開発が大幅に哺乳動物細胞における異所性の遺伝情報^20-23の安定な発現を促進した。その技術は、細胞型および組織^24-28の広い数に、またはトランスジェニック動物の産生のために^29〜31の蛍光タンパク質の遺伝子を導....

Protocol

遺伝バーコーディングのための哺乳動物細胞、ウイルス産生および形質導入の作製

1. 10％ウシ胎児血清（FCS）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中にトランスフェクションの前に、プレート10cmプレート（または周囲の50〜60％コンフルエンシー）で2.5×10 ⁶個の接着性細胞を一日。そのようなフェニックス-GP（ゲイリー·ノーラン、スタンフォード大学からの親切な贈り物）として選択したレトロウイルス生産用パッケージング細胞線に対する。
   注：パッケージング細胞株を安定トランスにおけるレトロウイルス粒子形成のためのGagおよびPolタンパク質を発現する。細胞が健康と単層板に接着し、トランスフェクションの前にあることを確認してください。
2. 24時間後、DNAトランスフェクション混合物を調製。
   1. 無血清DMEMの125μlに関心の蛍光タンパク質遺伝子を有するベクター（PCI-VSVG）及びトランスファーベクターの3μgの糖タンパク質3μgの水疱性口内炎ウイルスエンベロープを追加します。 2 mg / mlの（混ぜ、ポリエチ15μlのを追加）。
   2. 15分間室温で混合物をインキュベートし、滴ずつ細胞に添加する。
      NOTE：ポリエチはポリプレックスを形成するためのトランスフェクション試薬として均質なDNA混合物に添加される。異なる蛍光タンパク質マーカーを担持するウイルス粒子を得るために、選択したマーカーでそ....

Results

多重蛍光は、遺伝的に、個々のクローン集団が生成された後にのみ達成することができる生物学的用途の目的のために細胞をバーコード。バーコードの集団は最小限のスペクトルの重なりとの明確な異なる蛍光特性を持っているとき多重化は最も効果的である。哺乳類SupT1細胞のクローン集団を図1に示す例では、mCherryをシアノ蛍光タンパク質（CFP）とバーコードの細胞は容易に個々の蛍光特性を損なうことなく、同時に分析することができることを示している。この行列は、このようにまだ追加の利用可能なチャネルにおける読み出しとの多重化の生物学的用途のために使用可能である蛍光遺伝子組バーコード細胞のパネルを例示している。そのようなパネルを得るためにはそれが原因挿入EFへの集団内の蛍光強度の可変範囲につながるレトロウイルス技術の本質を、覚えておくことが重要ですfectsおよび/ ​​またはMOI。 図2のいずれか一方または強度の広い範囲（左パネル）における蛍光タンパク質の両方を発現する細胞におけるトマトまたはE2クリムゾン結果をtdとのいずれかを含むウイルス粒子を哺乳動物細胞の最初の形質導入を示してい.......

Discussion

ここでは、2つのよく確立された手順がまとめられました。レトロウイルス技術、フローサイトメトリーを用いて蛍光タンパク質を検出することにより遺伝子工学。ユニークな細胞株の生産のための蛍光タンパク質ベースの遺伝的バーコードは、多重化されたアプリケーションのための堅牢かつ簡単な方法を提供します。レトロウイルス技術による遺伝子操作されたバーコード細胞を生成する、最初は長いプロセスですが、一つは、一度、電池材料の信頼性と安定した供給源を確立し、取得することができます。この技術の性質は、一貫して、自分の本当の識別可能なbiosignatureなって安定した蛍光特性を持つ遺伝的に操作された細胞株を生成します。

接着性および非接着細胞タイプの両方が、それらの物理的吸光/発光スペクトルに基づいて、容易に識別可能である蛍光タンパク質を利用してバーコードすることができる。これらには、そのようなCFP、mCherryをなどのタンパク質に限定されるものではない、E2クリムゾンとTDトマト。遺伝的にそれらの識別可能な蛍光タンパク質とバーコードと、それらは細胞集団のパネルを製造するために組み合わせることができる。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mlシリンジ	BD	309604
0.45µをろ過するために使用されます。ウイルス		DMEM
(Dulbeccoの変更されたワシ媒体)	コーニング	45000-304HEK	293T細胞のための細胞成長媒体
PEI(ポリエチレン)	poly科学	23966-2	2 mg / mlの濃度を使用
ハンギングバケツ遠心分離機(冷蔵)	エッペンドルフ	5805 000.017	のために使用されるスピン感染
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	Corning	21-040-CV	の洗浄に使用される
ポリブレン(臭化ヘキサジメレン)	Sigma-Aldrich	107689	ウイルス感染効率を高めるために使用されます。5 & マイクロで使用。g / ml濃度。
FACSAria	BD Biosciences		機器 細胞集団の選別に使用される
機器 FACSCanto	BD Biosciencesの		機器 細胞分析に使用される
Phoenix-GP	Gary Nolan		からのギフト レトロウイルス粒子の生成に使用される
子牛胎児血清		の選別に使用される	Mediatech
	ATCC	CRL-1942	ヒト T リンパ芽球
HEK 293T 細胞	ATCC	CRL-11268	SV40 大型 T-抗原
RPMI 1640	コーニング	10-040-CV	SupT1 細胞用細胞増殖培