方法論記事

ナの機能的特徴 + / H +交換器

DOI：

10.3791/52453

⸱

2015年3月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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この記事の最初の部分は、原形質膜で小胞性Na+/H+交換体を発現する変異細胞株を選択する方法を示しています。第2部では、細胞内pH測定と高速イオン取り込みに基づくプロトコールを提供し、これらの交換体のイオン選択性と速度論的パラメータを決定するために使用されます。

要約

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エンドソームの酸性化は、タンパク質のリサイクルと劣化、受容体の脱感作、およびシナプス小胞における神経伝達物質の負荷などのプロセス、幅広いするために重要である。この酸性化のClC塩化物輸送体に結合されたプロトンATPアーゼによって媒介されることが記載されている。電気的中性のプロトン輸送体を高度に保存された、のNa + / H +交換体（NHE）6、7及び9は、これらのコンパートメントにおいて発現される。それらの遺伝子の変異は、人間の認知と神経変性疾患にリンクされています。それらの細胞内局在化は、詳細な機能解析を妨げているように逆説的に、彼らの役割は、とらえどころのないまま。この原稿は、この問題を解決する方法を示している。これは、原形質膜で細胞内NHEsを保持することにより急性のサイトゾル酸性化の生存可能な変異体細胞系の選択から成る。次に、イオン選択性および活性を測定するために二つの相補的なプロトコルを示している（i）1種の蛍光ビデオ顕微鏡を用いて細胞内pH測定値に基づいて、および（ii）1つのリチウムの取り込みの迅速な動態に基づくこ​​れらの交換器。そのようなプロトコルは、他の非起電性輸送を測定するために外挿することができる。さらに、ここで提示選択手順は、細胞内の保持不良表現型を有する細胞を生成する。従って、これらの細胞は、原形質膜における他の小胞の膜タンパク質を発現する。ここに示された実験戦略は、したがって、その後の選択のために使用される小胞のNa + / H +の交換とともに原形質膜で発現される他の細胞内タンパク質を研究するための潜在的に強力なツールを構成することができる。

概要

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ほとんどの細胞内区画は、タンパク質またはホルモンの成熟、人身売買、リサイクル、神経伝達物質の負荷のために重要なパラメータである酸性の管腔のpHを、表示します。これは、サイトゾルおよび小胞の内容の間のpH勾配が小胞のClC塩化物トランスポーター2に結合され、液胞型H + -ATPアーゼ1によって生成されることが示されている。ノックアウト（KO）マウスとヒト患者の両方で、これらのトランスポーターの重要性は、その遺伝子3-6の突然変異によって引き起こさ重い表現型によって強調されています。

ナトリウム-水素交換体SLC9Aファミリーのメンバー、またのNa + / H +交換体のためNHEsと呼ばれるが、細胞内pHと細胞容積調節において、ならびに上皮を横切る酸-塩基当量のベクトル輸送における重要なエフェクターであることが示されている。原形質膜NHEs、3つの高度に保存されのNa + / H +交換体、NHE 6,7に加えおよび9はトランスゴルジ網および初期エンドソーム7で表されている。それらの遺伝子の変異は、アンジェルマン様またはクリスチャンソン症候群8-9、家族ベースの自閉症10及び注意欠陥多動性障害11-12でリンクされている。これらの交換器はまた、アルツハイマー病感受性13とX連鎖精神遅滞隣接遺伝子症候群14などの神経変性の問題に関わってきた。まとめると、これらの研究は、脳の発達および/または機能のこれらの細胞内NHEsの重要性を強調している。

これらの交換器の細胞内局在化は、それらのイオン選択性、搬送方向、速度論的パラメータ、及び規制の正確な測定を妨げる。細胞内区画において発現すべてのトランスポーターの場合のように、それらの生化学的活性を評価するために、したがって、完全にそれらの生理学的役割とmechanを理解することは極めて困難である彼らの病理学的な意味を根底にあるISMS。高い細胞質ゾルK +濃度に基づいて、最も一般的に受け入れられて仮説は、彼らがK +結合したプロトン排出トランスポーターとして働いていたということでした。それは定常状態の水疱性pHを維持するために、V-ATPアーゼによってプロトンポンプを相殺できるようなプロトンリークの存在が仮定されていた。この視覚資料の目的は、それらの形質膜にこのような小胞輸送体を発現する細胞株の遺伝的選択を可能にする、および（ii）これらのトランスポーターの機能を測定するために、二つの独立したアプローチを示すための方法を実証するためには、（i）である。

30年前、PouysségurとフランキはNHEファミリー15のメンバーの分子クローニングおよび特性を有効に遺伝的アプローチを開拓してきた。これは、スクリーニング法として、細胞内のプロトンの毒性に基づいていた。最初のステップは、欠損細胞株を得ることであった任意のNa + / H +交換において、このトランスポーターの可逆性を用いて、原形質膜で発現する。線維芽細胞は、（CCL39細胞株）のNa +またはLi +でプリロードし、次いで2時間、酸性細胞外培地（pH6.5）中に入れた。これは、機能のNa + / H +交換体を発現する細胞の死およびアンチポーター欠損細胞（PS120細胞系）16の選択につながった。重炭酸塩を含まない培地中で培養した場合、これらの細胞は、急性細胞内酸性化に非常に敏感である。そのような細胞は、急性細胞acidificationsに提出された場合、結果として、原形質膜における任意の機能プロトン流出メカニズムの発現が正に（17を参照）が選択される。このような酸性化技術は、売買欠陥が原形質膜でWT細胞NHEsの強制発現を可能とする細胞株を単離することができる。

真核生物のNa + / Hとして+交換器は、彼らがチャンネルを測定するために大きな成功を収めて使用されている電気生理学的ア ​​プローチによって測定可能ではないが、電気的に中性である。この原稿は、したがって、細胞内pH測定及びリチウム取り込みの迅速な動態によって、この交換器の活性を測定する方法を示します。基礎となる概念が同じであるように、選択部のために開発プロセスの多くは、機能の測定のために直接使用されることに注意することは興味深い。

興味深いことに、我々は、この原稿に記載されたアプローチを使用して選択された細胞株に存在するトラフィッキング欠陥は、水疱性カリウムチャンネルTWIK1 18のように、原形質膜における他の小胞のタンパク質のより大きな発現をもたらすことを観察した。これは、小胞の膜貫通型タンパク質のための一般的なリテンション不良メカニズムの選択に向かって指摘している。したがって、この選択手順と、それが05を生成する細胞細胞内コンパートメントの膜タンパク質に取り組んで科学的なコミュニティのための有望なツールを構成している。同様にここで紹介する測定技術は、他の非起電性トランスポーターを研究するための適用可能な場合があります。

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プロトコル

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1. H +キリングセレクション

  1. 細胞株
    1. 安定的にNHE欠損細胞をトランスフェクト（ 例えば 、CCL39由来PS120細胞株16）線維芽細胞株で効率的なトランスフェクション収率及び選択を生成する哺乳動物発現ベクターおよびトランスフェクション方法の任意の組み合わせを使用して。
      注：長年、リン酸カルシウム沈殿19が良いトランスフェクション収率で使用された。これは、リポフェクタミン2000などの市販の試薬によって、より最近で置換された、トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って行われる。
  2. ソリューション
    1. 以下のように説明する3つの滅菌溶液を準備します。ろ過（0.22μm）とすることで、これらのソリューションを滅菌する。
      1. 50mMのNH 4 Clを、70 mMの塩化コリン、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMのglのからなるNH 4 +のロード液（pH7.4）を調製ucoseとpH7.4の15mMのMOPS。
      2. 120 mMの塩化コリン、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH7.0の5 mMグルコースおよび15 mMのHEPESから成るすすぎ液（pH 7.0）を準備します。
      3. pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる回収液（pH7.4）を調製。
  3. 選択を開始する前に、外部タンクのない追加のCO 2と共に37℃で使用することができる細胞培養インキュベーターを得る（CO 2と呼ばれる- 「フリー」インキュベーター）、5％とCO 2を損なうことがバッファリングをもたらす酸性化。約2×10 8細胞（典型的には約20コンフルエント100mmのプレート）に関心までのNHEを発現する細胞株を増幅する。
  4. H +手続きを殺す：
    1. 3で、ローディング溶液中で1時間関心の細胞内NHEを発現する細胞をインキュベートCO 2を含まないインキュベーターで7°C。
    2. ローディング溶液を吸引した後、上記の-リンス溶液中で二度、それらをすすぐ。酸性化が生成されます急なNH 4 +勾配の作成 ​​を損なう残留細胞外NH 4 Cl のを排除するために効率的にこの手順を実行します。
    3. 吸引によるすすぎ媒体を除去し、CO 2フリーのインキュベーター中で37℃で再び回復ソリューションで1時間細胞をインキュベート。
    4. 定期的な培養液（7.5％FCSを含む一般的にDMEM）を使用してリカバリメディアを交換し、（5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中で37℃）、標準的な培養条件で細胞を増殖させる。
  5. 安定なクローンが出現するまで、週2回の選択のこのサイクルを繰り返します。
    注：細胞培養​​および選択条件に関する特別な注意を払ってください。仕事の月数がoになりやすい任意の汚染によって台無しにすることができます文化と繰り返し、細胞操作の長い期間の後ccur。
    1. ここでは、クローンを増幅し、個別にさらにセクション2-3で説明し、それらを特徴づける、または特性化の前に細胞集団を生成するために、それらを一緒にプールするかどうかを選択します。
  6. カウンターを選択する親の酸感受性表現型（ 図1B）に復帰した可能性があるものをすることによって酸性化耐性細胞を保持するために臨時の選択（約2週間に1回）を適用します。

2.細胞内pH測定

2.1）蛍光性pHイメージング

  1. 490 nmで励起したときのpH感受性であり、製造者のプロトコルに従って、445 nmの等吸収点を有しているレシオメトリックpH感受性蛍光色素BCECF / AMを使用します。
    1. また、製造者のプロトコルに従って他のpH感受性プローブ​​を、使用しています。
  2. CON設定された撮影に使用します高感度ビデオカメラに接続された倒立顕微鏡のsisting。 450nmの励起に適した石英中性密度フィルタと対に490nmの狭帯域干渉フィルタと、このセットを装備する。
    1. 可能であれば比も両方λ1および/またはλ2のために、どちらが飽和または低すぎる設定されている基底蛍光値を避けるため1に近づくように、λ1とλ2のセットアップ同等の蛍光値にフィルタや照明条件の適切なセットを使用します。これは、その後、細胞内pHが変化しているものの、比率は検出されていない重要なアーティファクトをもたらすことができる。
      注：このシステムは、適切な発光波長（BCECFための535 nm）における急速な灌流、タイムラプス2上記の波長で励起し、取得を有効にする必要があります。ソフトウェアは自動データ収集と保存を可能にしてシステムを装備。

NHEフォワード活動の2.2）測定（の押出サイトゾルからのプロトン）

  1. NH 4 +のロード溶液中で1時間のインキュベーションによって細胞を酸性CO 2の非存在下で（ステップ1.4参照）。
  2. 最後の5分間溶液にBCECF-AM（5μM最終濃度）を追加した後、細胞外のプローブを除去するためにNH 4 +ローディング溶液でそれをすすいでください。
  3. 顕微鏡で細胞をマウントし、安定したベースラインを記録するために複数の画像を取る。リンス液（上記参照）を灌流する。これは、酸性化に対応する蛍光の低下をもたらす。
  4. pHが安定した後、リチウム+ / H +のNa + / H +またはK + / H +交換によって媒介されるpH回復速度を測定するために、下記の溶液のいずれかを灌流。各溶液をH +交換のために試験される潜在的結合カチオンを含んでいる。それらの一つは、輸送される場合、これはcorrespます495 nmでの蛍光増加をもたらす二の細胞内のpHの昇給へ：
    pH7.4の120mMのLiClを、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES
    pH7.4で120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES
    pH7.4での125mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES

NHEリバース活動の2.3）測定

注：ここでの原則は、膜貫通イオン性勾配を反転させることである。

  1. 測定前に、興味のある細胞内カチオンで細胞をロードする（下記参照）。
  2. （ステップ2.2.2を参照）BCECF / AMで5分間それらをインキュベートする。それらをすすぎ、ビデオ顕微鏡にマウント。
  3. ローディング溶液を灌流し、安定なベースラインを記録するために複数の画像を撮る。
  4. ベースラインが安定した後、画像セルが120メートルを含む細胞外酸性媒体で灌流されたpH変化Mの塩化コリン、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH6.5の5 mMグルコースおよび15 mMのMES。
  5. LiClをローディングのため、pH7.4の120mMのLiClを、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースと15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベート。原子吸光分光法によって測定された細胞内のリチウムは、約60mMの値が得られる。
  6. のNa +をロードするために、1mMのウアバインの存在下で、pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベートのNa / K ATPアーゼをブロックする。これらの条件において、細胞内のNa +濃度は、40mMの範囲である。
    注：細胞質ゾルK +濃度が140 mMの範囲にあり、外側に指向K +勾配を達成するのは容易であるようにK +ローディングが不要である。

2.4）データの処理と校正：

注：このステップでは、順方向および逆方向の測定値の両方に適用されます。

  1. 各実験の最後に、140ミリモルのKCl、20mMのHEPESおよび6.5と7.4の間のpH値に調整し、5μMナイジェリシンの溶液で細胞を灌流する。
  2. テキスト形式の下での画像（強度レベルを表すグレーレベル）と輸出から蛍光測定などのデータを収集し、スプレッドシートプログラムを用いて以下に説明するように扱う。
  3. 個々のセルまたは次の式を使用して、関心領域のための細胞内pH値を計算する。
    でpH = pKaは+（ログ（R-Rminを）/（R 最大 -R））×F 分（λ2）/ F MAX（λ2）
  4. Fの分（λ2）/ FのMA×（λ2）実験を通して450 nmの蛍光の減少、その結果、プローブの漂白や漏れがあった場合の比率を使用してください。しかし、これは非常にまれにDESで使用される条件で観察されないcribed実験。
  5. 較正データは、各pH測定の終了時に存在するように、対応する計算値を較正のために使用されるpH値と異なるかどうかをチェックする。それが事実である場合、次の手順を使用してキャリブレーションへのすべての実験的に決定されたpH値を調整します。
    1. 以下の商（Q、キャリブレーション値の間で測定された値/差と差）を計算します。計算値は、対応するキャリブレーション値と等しくなるように加算または減算することによって最終的な調整を行いますQ.によって全データセットを掛けます。

ファストLi +の取り込みによるNHE7の初期速度の3測定

  1. マルチウェルプレート上の種子細胞（6ウェル-24）および上記または20に記載の交互ナイジェリシン/ウシ血清アルブミン（BSA）酸性記載NH 4 +ローディング技法のいずれかを使用して酸性化する。
  2. の所望の量のために、上述したリンス液を用いて急速に二回、プレートを洗浄した後、（若干のKm値以下）1〜10 mMのリチウムを含有する取り込み溶液中で細胞をインキュベートし、カチオンおよび/または関心のある阻害剤の所望の濃度時間の。
  3. トランスポートが初期速度条件で動作することを保証するために短いと一貫性の取り込み期間（通常は1分以下）を維持します。また、取り込みのために使用されるすべてのソリューションが等張であることを確認してください。
  4. 取り込み時間の終わりに、慎重に取り込み培地を除去し、氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を4回洗浄する。 （そのうち4が理想的であるために10秒未満）リチウム流出を防ぐために可能な限り速く、これらの洗浄を行う。
  5. 溶解する25％の硝酸のセル。 25％の硝酸のウェル当たり250μlのを適用し、それがピペットチップの端部と各ウェルを廃棄し、新しいミシガン州全体の井戸サスペンションを転送した後、少なくとも1時間放置crocentrifugeチューブ。
  6. 細胞破片を除去するために15000 XG（室温）で5分間、それらを遠心分離、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを転送します。
  7. 原子吸光分光法21により上清のリチウム含有量を測定します。
    注：異なる企業がリチウム中空陰極ランプを装備する必要は原子吸光分光計を提供する。これらのマシンは非常に正確なだけでなく、非常に繊細であるように、メーカーの指示に従ってください。

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結果

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選択：

図1Aに示すように、選択を殺すH +は 、アンモニウム弱塩基の拡散に基づいている。細胞内のpHに弱塩基および酸拡散の効果がウォルターホウ素及び共同研究者22によって開拓されました。ポジティブ遺伝子選択のための致命的な酸性化を生成するために、この現象を使用するには、エレガントなアイデアは、その後ジャック·Pouysségur17によって開発されました。このようなプロトコルの下では、細胞内のpHは約5.5リンス工程の後に低下します。原形質膜における機能的NHEを発現しない細胞は、中性のpH値を回復し、扁平状と粒状細胞質ゾル（ 図1B）を有する典型的な酸性化の側面を示すことができない。 （手順/週を殺す約2個のH +）を繰り返し選択サ ​​イクルの後、完全に安定して、この酸性化（ 図1C）を生き残る細胞は、約10 -7の頻度で出現する。これは、個別に、又は所望であれば、...

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ディスカッション

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このプロトコルは、部位特異的突然変異誘発によって、その一次配列を変更することなく、原形質膜で細胞内のNa + / H +交換体を発現する細胞を選択する方法について説明します。これらの交換は今特徴付けることができる。

この方法は、原形質膜小胞でのNa + / H +交換体を発現する細胞株を選択するために、細胞内のプロトンの細胞毒性に基づいている。それは、Li +、K +、Cs等+として輸送することが疑われ得る他のカチオンを使用することが、原理的に、可能であろう。しかし、これは不確実性のレベルを高めることができます。選択は、任意の陽性クローンが得られない場合は、それを試験し、陽イオンが輸送されないかどうかを評価することは困難であるか、交換が原形質膜ではない。これらの理由から、選択は、これは、細胞外のsubstrそのまま結合カチオンとしてのNa +を使用して実行されている生理的条件下で最も高い豊富に見出さ食べた。これは、原形質膜（詩人と...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者は、ここで説明されている測定値を考案し、改善したpHとイオン輸送に取り組んでいる科学コミュニティのすべてのメンバーに深く感謝しています。彼らは特に、ここで使用されたH +殺人選択技術を考案したジャック・プイセギュール博士に感謝しています。彼らは、ニース上智大学アンティポリス、CNRS、ANR(JCJC SVSE1 NHEint)、およびICST Labexの支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
標準的な細胞培養機器カタログ番号の異なる多数のデバイスで構成されたH+殺傷選択に使用
CO2SanyoMCO15A
CO2ないインキュベーターBB6220
層流フード PSM1200NFフィッシャー 
DMEM ミディアムグマD5796
FBS ゴールドGE ヘルスケアA15-151
ペニシリン/ストレプトマイシンPAAP11-010
トリプシン 10xPAAL11-003
原子吸光分析装置 ゼーマン炉システムThermo ScientificICE 3500 GFZ
LiClシグマL4408
硝酸シグマ438073
蛍光ビデオ顕微鏡セットライカカタログ番号の異なる多数のデバイスで構成
倒立型自動顕微鏡ライカDMI6000B
顕微鏡スタンドライカ11888906
11888911
11888377
入射蛍光カ11888901 11504166
モーターブラケットライカ11888379
11505234
11521505
11522106
LED透過灯 ライカ8097321
8102034 11521580
電動プレートライカ11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
カメラ出力ライカ11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
画像取得・解析ソフトウェアライカ11888375
光学ライカ11506507
11506243
11506203蛍光
キセノンランプライカDMI6000
カメラ浜松8100601
メタフルー/Mmfluor 11640905
pH感知プローブ BCECF-AMライフテクノロジーB1170
ニゲリシンシグマN7143
52010120シ 11505180 ライ11888424ズ

参考文献

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