覚醒ラットにおける口腔内味物質投与の間に高速スキャンサイクリックボルタンメトリーと迅速ドーパミンダイナミクスの検討

Summary

細胞外ドーパミン（DA）の急激な変動は、哺乳類の報酬処理と動機付け行動の両方を媒介します。この原稿では、覚醒して自由に動くラットのテイスタントが急速なドーパミン放出をどのように変化させるかを決定するために、高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)と経口タスタント投与の併用について説明します。

Abstract

>jove_content<哺乳類の脳内での急速な位相ドーパミン(DA)の放出は、報酬処理、強化学習、および動機付け制御において重要な役割を果たします。高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)は、高い空間的および時間的(サブ秒)分解能を持つ電気化学技術であり、いくつかのタイプの調製物における位相DA放出を調べるために利用されています。単一細胞および脳切片でのin vitro実験、および麻酔をかけたげっ歯類でのin vivo実験は、正常な条件下でのドーパミンの放出と取り込みを媒介するメカニズムを同定するために使用されてきました。過去20年間、覚醒して自由に動くげっ歯類でのin vivo FSCV実験は、報酬処理と報酬学習におけるドーパミン作動性メカニズムの洞察も提供してきました。覚醒して自由に動く準備の大きな利点の1つは、特定の行動イベントに時間的に固定された急激なDA変動を調べたり、プレゼンテーションに報酬や合図を出すことができることです。しかし、複合行動実験とボルタンメトリー実験の1つの制限は、主要な報酬刺激または嫌悪刺激に特異的なDA効果を、報酬指向性または他の運動行動を媒介する共起するDA変動から切り離すことの難しさです。ここでは、覚醒状態のラットにin vivo FSCVと経口内注入を併用して、経口試飲に対するDA応答を直接調査する方法について説明します。これらの実験では、報酬指向行動や自発的な飲酒行動をバイパスして、ラットの口蓋に直接経口テイスタントを注入し、テイスタント刺激に対するDAの反応を直接調べることができます。

Introduction

Phasic DAの放出は、報酬指向の行動を媒介する上で重要な役割を果たします^[1-3]。しかし、一次報酬が位相性DAの放出をどのように変化させるかを分離して研究することは、意思決定プロセスや報酬を獲得するための報酬指向の運動行動など、位相性DAの放出を変化させる可能性のある行動的または認知的プロセスが同時に発生することによって複雑になることがよくあります。現在の研究では、経口カニューレを介したテイスタント送達と組み合わせたin vivo高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)を使用して、テイスタントに対する位相DA応答を分離します。この技術は、選択と行動をバイパスし、ラットの口蓋にテイスタントを直接注入する際の細胞外DA放出を調べることができます。

FSCVは、高い時間的および空間的分解能を持つ電気化学的手法であり、サブセカンドスケール(10Hz分解能)で離散的な局所領域(約100μm)でのDA放出の測定を可能にします。経口内送達とFSCVの組み合わせは、従来のマイクロダイアリシス法では調べられない、タスタントに対する迅速な「リアルタイム」DA応答を観察できるという利点を提供します。さらに、報酬または報酬関連の手がかりに応答した位相性DA放出は、FSCVの10〜20 nM検出閾値を超える20〜100 nMの濃度で発生します^[4]。FSCVの高い空間分解能により、側坐核(NAc)などの小さな脳領域のサ....

Protocol

すべての実験は、実験動物の管理と使用に関する健康（NIH）ガイドの国立研究所に従って行ったとエール大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1）手術前の準備

1. 経口溶液の調製
   1. 10％のスクロースおよび脱イオン水（pH7.4）で0.005％のL-メントールのソリューションを作成します。室温で、密閉容器にこれらのソリューションを保存し、劣化を防ぐために、2週間毎にリメイク。
2. 電極較正溶液
   1. キャリブレーションの前に、任意の時点でのトリス緩衝液（pH7.4）にしてください。解決策は、12.0 mMトリス塩酸、140mMのNaClを、3.25のKCl、1.20 mMの塩化カルシウム、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、1.20のMgCl _2、および2.00 mMののNa ₂ SO ₄で構成されています。
   2. 0.1Mの過塩素酸中で、10 mMのドーパミン（塩酸ドーパミンDA）の原液を作成します。過塩素酸は、ドーパミンの酸化を防ぐことができますE。 -20℃で、このストック溶液を保存し、6ヶ月までのために使用します。一度だけ各アリコートを使用するために保管するDA原液のいくつかのアリコートを作成します。
   3. 10 mMのDAストックから、1μM、500 nMで、250 nMの、....

Results

口腔内カテーテル注入と組み合わせFSCVはどのようにスクロース、食欲味物質を試験するために使用した、側坐核コア内の相性DA放出を調節します。以前は味物質の点滴に、電気刺激（150μA、60ヘルツ、24パルス、赤いバーで示される）VTAのは、側坐核における相性DA放出（ 図1）において強い増加を生成図1上の電位のカラープロットを示します。 z軸上のy軸、x軸上の時間と、現在の（偽色として表されます）。カラープロットの下に時間トレース対DAの濃度です。時間に対する濃度は、ドーパミンの酸化電位における電流対時間のトレースを使用して測定した電極のポスト較正以下の濃度に変換した（破線の白線で示します）。時間トレースに対するこのDA濃度は、PCAのトレーニングセットの一部として使用されました。

スクロースのトレーニングセットを取得した後、25点滴（10％、注入あたり200μl）を、すべての1-3分を与えました。相性DA放出のスクロース変調の例としては、 図2および図3に示されている。

Discussion

FSCVと組み合わせた口腔内味物質の送達は、経口香味料に「リアルタイム」DA応答の分析を可能にします。成功したDAの測定のために必要とされるプロトコルにおける3つの重要なステップがあります。まず、経口カテーテルの適切な注入は、風味剤を送達するために重要です。カテーテルは、第一大臼歯の後ろに挿入し、所定の位置にくさび止めされていることを保証することは開通性を失うことから、カテーテルを防止し、動物によって偶発的な脱落を防止します。回復後の最初の数日の間にカテーテルをフラッシュすると、最初の2、3日中に動物に与えられるソフト食べ物は手術後、カテーテルを詰まらせる可能性があるので、また重要です。第二に、電極の品質を自由に移動するラットにおける信号対雑音比を増加させるために重要です。いくつかの例では、視覚的に高品質と良好な状態であるように思われる電極は、まだノイズの多い信号を与えることができます。この問題を解決する一つの方法は、（d）に、ベースラインの記録を取ることですorsal線条体（硬膜下の4ミリメートル）。電極は、あまりにも多くのノイズを生成する場合、電極を取り出し、前のNACコア記録部位に（硬膜下6〜7ミリメートル）の実験を行うに新しい.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
刺激電極	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	ご注文の際は、電極用台座カニューレの下に 22 mm カットをリクエスト
	BioAnalytical Systems	MD-2251
ガラス毛細管	A-M システム	624503
カーボンファイバー	Thornel	T650
電極プーラー	Narishige International	PE-22
神経ログ刺激アイソレータ	デジタイマー株式会社	DS4
熱収縮		3M FP-301
電極用絶縁電線	スクワイアズエレクトロニクス	カスタム	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
マイクロマニピュレーター	イリノイ大学シカゴ校、エンジニアリング機械工場
エポキシ	ITW Devcon	14250	"5分エポキシ"
パーフルオロ-3,6-ジオキサ-4-メチル-7オクテンスルホン酸とテトラフルオロエチレン	イオン	パワーLQ-1105	すなわち、ナフィオン
シルバーペイント	GCエレクトロニクス	22-023
電源	BK精密	9110
チューブ口腔内カテーテル	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
シリンジポンプ for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
外科用セメント	デンツプライ コーキング	675571および675572
エアアクチュエータ	VICI	A60	6 ポジション デジタル
バルブ インターフェース デジタル バルブ インターフェース	VICI	DVI	230 VAC
クワッド ヘッドステージ	ノースカロライナ大学、電子施設
UEI 電源	ノースカロライナ大学、エレクトロニクス施設
UEI ブレイクアウトボックス	ノースカロライナ大学、エレクトロニクス施設
テイスタントシリンジポンプ用電源	Med Associates	SG-504
Tastant シリンジポンプ	Med Associates	PHM-107
タングステン微小電極	MicroProbes	WE30030.5A3
銀線リファレンス with AgCl	InVivoメートル法	E255A
ショ糖 Σ		80497
塩化マグネシウム	Σ	M8266
クロイドナトリウム	Σ	S7653
過塩素酸		244252
塩酸 (4 M)	Σ	54435
水酸化ソイダム		Σ 306576
過酸化水素	Sigma	H1009
ドーパミン塩酸塩	Sigma	H8502
TarHeel HDCV ソフトウェア	ノースカロライナ大学チャペルヒル		校ソフトウェアをリクエストする必要があります：ソフトウェアリクエストページへのリンクはこちら