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方法論記事

覚醒ラットにおける口腔内味物質投与の間に高速スキャンサイクリックボルタンメトリーと迅速ドーパミンダイナミクスの検討

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DOI：

10.3791/52468

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2015年8月12日

 ,  ,  , 
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

この記事について

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サマリー

細胞外ドーパミン（DA）の急激な変動は、哺乳類の報酬処理と動機付け行動の両方を媒介します。この原稿では、覚醒して自由に動くラットのテイスタントが急速なドーパミン放出をどのように変化させるかを決定するために、高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)と経口タスタント投与の併用について説明します。

要約

>jove_content<哺乳類の脳内での急速な位相ドーパミン(DA)の放出は、報酬処理、強化学習、および動機付け制御において重要な役割を果たします。高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)は、高い空間的および時間的(サブ秒)分解能を持つ電気化学技術であり、いくつかのタイプの調製物における位相DA放出を調べるために利用されています。単一細胞および脳切片でのin vitro実験、および麻酔をかけたげっ歯類でのin vivo実験は、正常な条件下でのドーパミンの放出と取り込みを媒介するメカニズムを同定するために使用されてきました。過去20年間、覚醒して自由に動くげっ歯類でのin vivo FSCV実験は、報酬処理と報酬学習におけるドーパミン作動性メカニズムの洞察も提供してきました。覚醒して自由に動く準備の大きな利点の1つは、特定の行動イベントに時間的に固定された急激なDA変動を調べたり、プレゼンテーションに報酬や合図を出すことができることです。しかし、複合行動実験とボルタンメトリー実験の1つの制限は、主要な報酬刺激または嫌悪刺激に特異的なDA効果を、報酬指向性または他の運動行動を媒介する共起するDA変動から切り離すことの難しさです。ここでは、覚醒状態のラットにin vivo FSCVと経口内注入を併用して、経口試飲に対するDA応答を直接調査する方法について説明します。これらの実験では、報酬指向行動や自発的な飲酒行動をバイパスして、ラットの口蓋に直接経口テイスタントを注入し、テイスタント刺激に対するDAの反応を直接調べることができます。

概要

Phasic DAの放出は、報酬指向の行動を媒介する上で重要な役割を果たします[1-3]。しかし、一次報酬が位相性DAの放出をどのように変化させるかを分離して研究することは、意思決定プロセスや報酬を獲得するための報酬指向の運動行動など、位相性DAの放出を変化させる可能性のある行動的または認知的プロセスが同時に発生することによって複雑になることがよくあります。現在の研究では、経口カニューレを介したテイスタント送達と組み合わせたin vivo高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)を使用して、テイスタントに対する位相DA応答を分離します。この技術は、選択と行動をバイパスし、ラットの口蓋にテイスタントを直接注入する際の細胞外DA放出を調べることができます。

FSCVは、高い時間的および空間的分解能を持つ電気化学的手法であり、サブセカンドスケール(10Hz分解能)で離散的な局所領域(約100μm)でのDA放出の測定を可能にします。経口内送達とFSCVの組み合わせは、従来のマイクロダイアリシス法では調べられない、タスタントに対する迅速な「リアルタイム」DA応答を観察できるという利点を提供します。さらに、報酬または報酬関連の手がかりに応答した位相性DA放出は、FSCVの10〜20 nM検出閾値を超える20〜100 nMの濃度で発生します[4]。FSCVの高い空間分解能により、側坐核(NAc)などの小さな脳領域のサブ領域からの記録も可能になります。したがって、FSCV とテイスタントの口腔内注入の組み合わせは、テイスタントまたは他の刺激が覚醒して行動する動物の位相 DA 放出をどのように変化させるかを研究するための理想的なモデルです。実際、これらの技術により、報酬と嫌悪感のあるテイスタントが細胞外DA放出をどのように変化させるかを調査する実験が可能になりました[5]。

過去10年間で、FSCV分析は、薬物依存モデルにおける位相DAメカニズムの役割を特定するために、静脈内薬物送達[6]およびラット自己投与パラダイム[7, 8]と成功裏に組み合わされてきました。さらに、FSCV と組み合わせた経口送達は、コカインの利用可能性と組み合わせたテイスタント キューが、感情的な影響を反映する位相 DA 放出と行動反応をどのように調節するかを調べるために使用されています [3]。この経口内およびFSCV組み合わせ方法論は、紙巻きたばこや溶解性たばこ製品に添加されるメントールや経口甘味料などの香料に対する相性DA反応を調べるためにも強力に利用できます[9-11]。タバコ製品に添加される香料の多くは食欲をそそるものですが[9-11]、これらの香料が報酬のある快楽価と一致する方法で相性DA放出を増加させるかどうかは不明です。実際、紙巻たばこおよび溶解性たばこ製品に添加される香料は、DA報酬系に直接影響を与える可能性があり、ドーパミン作動性メカニズムを通じて作用して、紙巻たばこや他のたばこ製品の報酬価に影響を与える可能性があります。したがって、FSCVと組み合わせた経口送達は、フレーバー剤が急速なDA放出をどのように調節するかについての新たな理解を提供することができます。経口内およびin vivoのFSCV法を組み合わせた方法、およびそのような研究から得られたデータを使用することは、香料とニコチンがどのように相互作用してDAシグナル伝達を変化させ、ニコチン強化を調節するかを決定する将来の研究も促進できます。さらに、このような研究から得られたデータは、たばこ製品香料に関する規制上の決定に情報を提供するために使用できます。

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プロトコル

すべての実験は、実験動物の管理と使用に関する健康（NIH）ガイドの国立研究所に従って行ったとエール大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1）手術前の準備

  1. 経口溶液の調製
    1. 10％のスクロースおよび脱イオン水（pH7.4）で0.005％のL-メントールのソリューションを作成します。室温で、密閉容器にこれらのソリューションを保存し、劣化を防ぐために、2週間毎にリメイク。
  2. 電極較正溶液
    1. キャリブレーションの前に、任意の時点でのトリス緩衝液（pH7.4）にしてください。解決策は、12.0 mMトリス塩酸、140mMのNaClを、3.25のKCl、1.20 mMの塩化カルシウム、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、1.20のMgCl 2、および2.00 mMののNa 2 SO 4で構成されています。
    2. 0.1Mの過塩素酸中で、10 mMのドーパミン（塩酸ドーパミンDA）の原液を作成します。過塩素酸は、ドーパミンの酸化を防ぐことができますE。 -20℃で、このストック溶液を保存し、6ヶ月までのために使用します。一度だけ各アリコートを使用するために保管するDA原液のいくつかのアリコートを作成します。
    3. 10 mMのDAストックから、1μM、500 nMで、250 nMの、125 nMで、62.5 nMであり、31.25 nMの濃度にトリス緩衝液中の溶液を希釈します。
    4. pH値の校正のために、7.2、7.3、7.5、および7.6のpHを有するトリス緩衝液の溶液を準備します。これは、in vivo実験中に発生する可能性があるのpHシフトを模倣するソリューションを提供します。
  3. 電極の製造
    1. 真空吸引によって、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（直径0.4ミリメートルの内側長さ10ミリメートル、外径0.6ミリメートル）にT-650炭素繊維（7μmの直径）を吸引します。
    2. 垂直電極の引き手に炭素繊維を充填したガラスキャピラリーを置きます。最初のパラメータについては、55.0にヒーターを設定し、磁石をオフにします。ヒーター磁気両方の設定がFRを変化しかし、さらなる最適化が必要であり得ます研究室へのOMラボ。
      注：それは簡単にマイクロマニピュレーターに収まることができるとラット脳内に少なくとも6.9ミリメートル硬膜下に挿入されるように、電極は（テーパーを含む）は、少なくとも5.5センチメートル長さでなければなりません。電極が短すぎると、側坐核の腹の部分からの記録が達成されません。一方、全電極の長さ6.5 cmを越えてはいけませんそれ以外の場合は、マイクロマニピュレーターに収まらないほど長くなります。
    3. それはガラスの端を超えて75〜100ミクロンを拡張するように、光学顕微鏡を用いて、露出した炭素繊維をカット。電極は、その後の記録中に、最小限のノイズを生成するガラス電極と炭素繊維との間に非常にタイトな、かろうじて認識できる、シールを、持っていることを確認します。シール不良の指標であるガラスやシールが緩んでいるかの顕著な亀裂が存在する場合、電極を捨てます。詳細な手順は、[12]と[13]を参照してください。
  4. マイクに電極を組み立てますromanipulator
    1. ワイヤの長さの半分に沿って絶縁ワイヤに直接銀塗料の薄い層を適用するために小さなブラシを使用されている30Gワイヤ、​​3を得ます。直ちに銀塗料を塗布した後、炭素繊維の物理的および電気的接続を提供するために、電極の上部の穴にワイヤーを挿入。顕微鏡下で、銀線が炭素繊維と接触することを確認してください。
    2. 熱収縮を使用してマイクロマニピュレータに銀線と電極を固定します。
    3. 電極表面をきれいにし、ドーパミンの後に感度を高めるために、少なくとも10分間、精製し、イソプロピルアルコール（IPA）中に調製した炭素繊維電極を置きます。 IPAに浸漬した後、IPAを除去するために、水道水で炭素繊維をすすぎます。
  5. 参照電極の製造
    1. 、約6mmのAg / AgのClでメッシュ（単独の7mm銀線6ミリメートルメッシュ0.4ミリメートルの直径）を有する13ミリメートル銀線を取りダウンの約半分の元の長さに銀部を切断し、金のピンにワイヤの銀部をはんだ付けします。
    2. ピンのはんだの上にエポキシ樹脂を適用します。
    3. のAg / AgのClを各ディップの間に30分間空気乾燥期間と、5％のポリテトラフルオロエチレンとパーフルオロ-3,6-ジオキサ-4-メチル7octeneスルホン酸5回の共重合体に端をメッシュ浸し。
    4. コー​​ティングされたAg / AgのClを空気乾燥のO / Nにメッシュを許可します。
    5. 1時間120ºCのオーブンで硬化します。

2）複合口腔内手術および頭蓋内カニューレ挿入手術（約75分）

  1. 経口カテーテル製造
    1. 経口カテーテルを作成し、少なくとも10日手術前に、エチレンオキシド滅菌によって滅菌します。
    2. 長さ6cmのセグメントにPE 100チューブをカットします。
    3. はんだごてを用いて、PEチューブの一方の端部を溶融し、すぐにPEチューブを冷却するために、固体表面に押し付け。結果は、作成する必要がありますPE管の一方の端部にある小さな、平らなディスクとフランジすべきではありません。針（18 G）を使用するか、このディスクの中心に穴を作成するためにピンを押してください。
    4. PEチューブのもう一方の端には、ぴったりのチューブに18 G針の鈍端を挿入します。
    5. 標準の用紙穴パンチャーを使用して、ポリテトラフルオロエチレンのワッシャーを作成するために、ポリテトラフルオロエチレンシートのいくつかの円形片（3.18ミリメートルの厚さ、直径6mm）をパンチ。
    6. ワッシャの中央に穴を作成します。 PE管に取り付けられた針を取るとワッシャを通し、それを完全に押し込みます。針が通過したら、それは洗濯機にぴったりになるように、PE管の底部にワッシャーをスライドさせます。
  2. 口腔外科
    1. （滅菌前台座下2.5mmまでトリミング）手術器具、カニューレ、および参照電極を滅菌した後に、ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の腹腔内注射でラットを麻酔。
      1. AFター5分、麻酔のレベルを評価するために、有害刺激試験（足や尾のピンチ）を適用します。被験者が（呼吸や心拍​​数の増加、応答を尻込み）侵害刺激試験への物理的な反応を示した場合は、元の投与量の10％〜15％のケタミンブーストを投与し、上記の侵害刺激プロトコルを繰り返します。
    2. ラットが完全に麻酔をかけていると侵害刺激試験に対する反応を示していない後、耳の後ろから約2mmの目から、ラットの毛を剃るために動物バリカンを使用しています。そして、手術中の体温を維持するために薄い水循環加熱パッド上にラットを置きます。目の潤滑剤を塗布します。前の任意の切開を実行する前口腔内カニューレを挿入する腹腔内注射により、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）薬、カルプロフェン（5ミリグラム/キログラム）を投与します。すべての回で無菌技術を使用してください。
    3. 肌をきれいにするために、70％エタノールに続いてベタジンを適用します。 3回繰り返します。
    4. ナンプラーその背中にラットを、CE、および滅菌綿棒を使用して、口を開いてください。最初の上部臼歯を探します。
    5. 直後の針が終了するまで頬と第一上部臼歯との間の組織に針を挿入し、耳に正中。
    6. ピアースは、PEチューブまで皮膚を通して針が皮膚から出て、アクセス可能です。
    7. （カニューレ自体ではなく針で把持）カニューレを引き上げ、カテーテルが所定の位置に残るように臼歯にポリテトラフルオロエチレン洗浄器を固定します。
      注：台形形状にワッシャーを切断し、頬に面した平坦な側面と大臼歯に対してそれを保護するには、この手順は簡単になります。
    8. 別のポリテトラフルオロエチレンワッシャを取り、プラスチックチューブダウン、および切開当接し、露出した針の上にスライドさせます。
    9. ワッシャーが上にスライドしないようにポリテトラフルオロエチレンワッシャを確保するために、三角形の「フラグ」を作成する滅菌テープを使用します。洗浄を確保ラットの皮膚や滅菌テープに対してえー。
    10. チューブ2-4 CMは、ラットの頭の上に露出されるように露出されたカテーテルをカット。
    11. 繰り返しは、口の反対側のために2.2.10を介して2.2.1を繰り返します。
  3. ボルタンメトリーのための頭蓋内手​​術
    1. （3サイクルの繰り返しで行い、70％エタノールのスクラブに続いてベタジンスクラブ）定位フレームにおけるラットを置き、2段階のスクラブを使用して、動物の頭皮をきれいに。
    2. 頭皮組織の15×15ミリメートルのセクションを離れてカットする滅菌ニードルノーズピンセットと手術用はさみを使用してください。
    3. 静かに滅菌綿棒のアプリケーターを用いて、頭蓋骨の表面を清掃してください。さらに3％の過酸化水素の2〜3滴を適用することにより、頭蓋骨をきれい。
    4. 基準エレクト用ネジのその後の挿入のための頭蓋骨の3小（直径1mm）穴、ガイドカニューレのための1の穴、刺激電極のための1の穴と、1ホールを作るために定位ドリルを使用して、乗りました。
    5. 側坐核コア中の記録のために、1.2ミリメートルの前部とブレグマへ横1.4ミリメートルでガイドカニューレを配置します。プラスチックベースが頭蓋骨と同じ高さになるまで、カニューレ装置を下げます。
    6. ガイドカニューレに半球反対で滅菌参照電極を配置します。約2mmの硬膜下の基準を下げます。
    7. 5.2ミリメートルの後部とブレグマに1.0ミリメートル、横に刺激電極を配置し、腹側被蓋野（VTA）を標的とするために硬膜下の8.0ミリメートルを下げました。
    8. 頭蓋骨にネジを固定するために滅菌小さな手術用ドライバーを使用します。次に、電極を刺激する、参照電極を挿入し、カニューレを導きます。最後に、cranioplasticセメントを使用してすべてのコンポーネントを固定します。
    9. 術後ケアの最初の48時間については、皮下注射（5ミリグラム/ kg）をすることにより、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、カルプロフェンを投与します。前voltamを実行する完全な外科的回復のために、少なくとも1週間を許可メトリ記録。
      1. 術後のケアの間、毎日の水で洗い流し経口カテーテル。咀嚼や食事に動物を助けるために2日間水に飽和食品を提供します。 （5ミリグラム/ kgで防腐剤の局所投与、流体の投与を含む、およびまたはNSAIDカルプロフェン投与）（これは、軽度の感染症や脱水症状に）痛みのストレスの潜在的な徴候について毎日モニタリングを提供し、必要に応じて適切な介入を提供します。

覚醒中3）ボルタンメトリーレコーディング、自由に動くラット

  1. 電極を下げ、DAのトレーニングセットを取得します。
    1. 実験の日に、水200μlを注入し、口腔顔面の応答を観察することにより、口腔カニューレの開通性を確認する（ラットが水を試飲していることを確認するため）。
    2. 双極刺激電極cannuに（ヘッドステージ上の）刺激電極を挿入することにより、ラットにFSCVのヘッドステージを取り付けラ（ラット上）。このように、ヘッドステージ（小型化、電流 - 電圧変換器）は、双極刺激電極に直接接続します。
    3. カニューレ装置からダミーカニューレを取り外し、カニューレに50％ヘパリン溶液2滴を適用します。そして静かに続いて、実験中に挿入される炭素繊維電極が壊れます発生した可能性のある血餅またはグリア瘢痕を、クリアする（以前に削除されたダミーカニューレがいることを少し長い）ダミーカニューレを挿入します。頭蓋骨下の血栓3〜4ミリメートル（記録部位より少なくとも2ミリメートル）をクリアするために使用されるカニューレを拡張します。
    4. ガイドカニューレに、電極を、マイクロマニピュレーターを挿入し、「ロック」位置にオメガリングを配置します。
    5. 適切なピンにヘッドステージから基準電極線を接続します。そして、ヘッドステージ上の適切な配線にマイクロマニピュレーターから作用電極線を接続します。
    6. ELECを下げ頭蓋骨の下約4〜4.5ミリメートルにtrode。
    7. 三角波（400 V /秒、-0.4 1.3 V）を適用するためにポテンショスタットを使用してください。その後の実験記録は10 Hzに波形アプリケーション周波数を変更する、少なくとも10分間、60 Hzで電極に波形を適用します。
      注：60Hzの波形塗布工程は、安定した炭素繊維の表面を生成し、電気的なドリフトを防止するために役立ちます
    8. DA放出およびpHの異なる濃度を呼び起こすために、全ての2ミリ秒/位相のパルス幅で様々な周波数（10〜60ヘルツ）パルス（10〜30パルス）と電流（50〜150μA）を使用して、VTAに電気刺激を適用します移行します。 DA放出の少なくとも5つの異なる濃度および異なるpH 5シフトを取得します。水疱リロード[14]を可能にするために、刺激の間 - （3分間の最小2）を待ちます。
      注：これは、後続の中に収集される全範囲にわたってDA濃度を生成する刺激を得ることが重要です彼らは主成分分析（セクシ​​ョン5.1を参照）のためのトレーニングセットとして使用されますので、実験。
    9. 側坐核コア（硬膜に6.3ミリメートル腹側）に電極を下げます。一過性のDAリリースイベントは毎分1以上の周波数で観察されるまで、その後のNACコア内の100ミクロン単位で電極を下げます。
    10. シリンジポンプに取り付けられた20ミリリットルの注射器にチューブ（内径1/32 "、外径3/32"）を接続します。チューブのもう一方の端には、ラットのカニューレにチューブを接続するために面取り23 G針を使用しています。チューブは、所望の味物質で完全に充填されていることを確認し、気泡がチューブ内に存在しないことを確認します。
      注意：一般的に、前の記録のための最初の注入は、完全な注入量ではなく、チューブ内の残留水や空気を提供することを確実にするために記録にラットの口の中に味物質を少量投与します。また、これは、動物が、いくつかの経験ウィットを持つことができH小説味物質、でも食欲ものは、、その目新しさに最初は嫌悪することができるので、味物質。
    11. データ収集のために、味物質の200μlの（ポンプ、前述のチューブを使用して、6.5秒）を注入します。味物質ごとに1-3分を注入。味物質あたり25回の合計を注入。各注入は、溶液200μlを提供します。
    12. 複数の味物質は、1回の実験で配信されている場合は、1味物質のデータを収集した後に水で経口カテーテルをフラッシュし、新しい味物質を注入する前に、少なくとも20分待ってください。
    13. DA記録セッションの後、記録部位の小さな病変を作成することで、組織学的検証のために準備します。その後のキャリブレーション用の炭素繊維電極を保持するには、第一の電極を撤回し、マイクロマニピュレーターを削除します。次に、元のカーボンfとして（硬膜下）と同じ深さに（ガラスチップを越えて100ミクロンを拡張する）ガラス微小電極とタングステン線で新しいマイクロマニピュレーターを使用iber微小電極。
    14. 10 Vの設定に達するまで組織学的検証については、タングステンワイヤで3 Vを印加し、1 V単位、10秒毎の電圧を増加させることにより、小さな病変を作成します。
    15. 標準濃度曲線は、既に複数の炭素繊維電極を使用して作成されている場合は、直接炭素繊維電極の電位を印加することにより、（3.1.14）上記病変のステップを実行します。
      注：この病変方法は、炭素繊維を損傷し、その特定の電極と、その後のキャリブレーションを防ぐことができます。
    16. 致死注射をペントバルビタール（150mgの/ kg、腹腔内）を用いて動物を安楽死させます。
    17. ヘッドキャップに直接上向きに引っ張ることによりプライヤーを使用して、カニューレとヘッドキャップを取り除きます。これは、脳への不必要な損傷を引き起こし、組織学中に電極の位置を特定することが難しくなりますので、ヘッドキャップをねじったりしないでください。
      1. 30％suコマンドが続く3日間の4％ホルマリンで脳と場所を削除します1週間crose。 、クライオスタットを用いて、30μmの切片を作成し、炭素繊維やタングステン病変の位置を特定するために、光学顕微鏡下でスライスをカバースリップ上にマウントして調べます。
        注：灌流は3.1.17のためのオプションです。

4）電極のキャリブレーション

  1. 現在の濃度変換係数を作成するために、フローセルを使用します。
    1. 電極の感度を決定するために、フロー「T細胞」装置を用いて、各実験後に電極を較正します。トリス緩衝液、pH溶液、またはDAの溶液（2 ml /分の速度で）電極表面上に洗浄している間に「T細胞」に電極を下げます。緩衝液およびpHまたはDA溶液との間で前後に切り替えることが6位エアソレノイドアクチュエータを使用してください。
    2. 各キャリブレーションのために、20秒のAに続いて、pHまたはDA溶液を5秒間適用続いトリス緩衝液（ベースライン）の5秒の塗布中ボルタンメトリーデータを収集しますトリス緩衝液（30秒全ファイル）のpplication。各校正標準濃度、各標準の異なる濃度間の釣り合いのためにそれぞれの実行を3回繰り返します。
    3. 各サンプル採取のために、ピークDAまたはpH誘発電流を測定します。ピーク電流の関係対濃度を得るために各試験全体でピーク電流を平均化します。詳細な手順は、[12]と[13]を参照してください。

5）データ解析

  1. 主成分分析（PCA）に設定されたトレーニングの使用
    注：ボルタンメトリー実験中に、出力は、ドーパミンの酸化と還元はpHシフト、および電気化学ノイズの結果である、現在のように製造されます。一つは所望の成分（DAおよびpH）を分離し、（より詳細な説明については、15、16参照）は、所望の信号を歪ませる可能性のある追加の成分を除去することができるように、PCAは、これらの要素を分離することができます。
    1. 目に校正係数を割り当てE出力電流PCA後（約5-10 NA /μM）は、分析物の濃度値を決定することができるようにします。
    2. "電車" PCAモデルはDA、pH、およびその他の要因を分離するための実験中に得られたトレーニングセットを使用してください。 PCAは、（セクション3.1.8に回収）トレーニングセットサイクリックボルタモグラムを取り、ボルタモグラムの本質的な特徴は、インビボボルタンメトリーの録音中に収集された各検体を識別するために使用することができるかを決定します。
    3. 維持するために主成分の数を決定するために、マリノフスキーF検定を使用しています。典型的には、通常、データの分散の約95から99までパーセントを説明するのみ2または3の主成分を保持します。マリノフスキーF検定を実施する上で詳細な説明については、17を参照してください。
      注：部品の数が決定されると、PCA分析を効果的に保持されている主成分にDAおよびpHトレーニングセットから測定されたボルタモグラムを投影します。結果だけDA（またはpH）のデータようにフィルタリングされたデータセットである（期待される出力のための代表的な結果を参照してください）​​のままであり、DAまたはpHに似ていない残存データが削除されます。ボルタンメトリー分析のためにPCAを使用するためのステップの指示によってさらに詳細な説明とステップのための材料のシートと16、17を参照してください。

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結果

口腔内カテーテル注入と組み合わせFSCVはどのようにスクロース、食欲味物質を試験するために使用した、側坐核コア内の相性DA放出を調節します。以前は味物質の点滴に、電気刺激（150μA、60ヘルツ、24パルス、赤いバーで示される）VTAのは、側坐核における相性DA放出（ 図1）において強い増加を生成図1上の電位のカラープロットを示します。 z軸上のy軸、x軸上の時間と、現在の（偽色として表されます）。カラープロットの下に時間トレース対DAの濃度です。時間に対する濃度は、ドーパミンの酸化電位における電流対時間のトレースを使用して測定した電極のポスト較正以下の濃度に変換した（破線の白線で示します）。時間トレースに対するこのDA濃度は、PCAのトレーニングセットの一部として使用されました。

スクロースのトレーニングセットを取得した後、25点滴（10％、注入あたり200μl）を、すべての1-3分を与えました。相性DA放出のスクロース変調の例としては、 図2および図3に示されている。

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ディスカッション

FSCVと組み合わせた口腔内味物質の送達は、経口香味料に「リアルタイム」DA応答の分析を可能にします。成功したDAの測定のために必要とされるプロトコルにおける3つの重要なステップがあります。まず、経口カテーテルの適切な注入は、風味剤を送達するために重要です。カテーテルは、第一大臼歯の後ろに挿入し、所定の位置にくさび止めされていることを保証することは開通性を失うことから、カテーテルを防止し、動物によって偶発的な脱落を防止します。回復後の最初の数日の間にカテーテルをフラッシュすると、最初の2、3日中に動物に与えられるソフト食べ物は手術後、カテーテルを詰まらせる可能性があるので、また重要です。第二に、電極の品質を自由に移動するラットにおける信号対雑音比を増加させるために重要です。いくつかの例では、視覚的に高品質と良好な状態であるように思われる電極は、まだノイズの多い信号を与えることができます。この問題を解決する一つの方法は、（d）に、ベースラインの記録を取ることですorsal線条体（硬膜下の4ミリメートル）。電極は、あまりにも多くのノイズを生成する場合、電極を取り出し、前のNACコア記録部位に（硬膜下6〜7ミリメートル）の実験を行うに新しい...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この出版物で報告された研究は、NSF大学院研究員(RJW)と国立衛生研究所の国立薬物乱用研究所、およびFDAタバコ製品センター(CTP)の賞番号P50DA036151（EJNおよびNAA)によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
刺激電極PlasticsOneMS303/2-A/SPC注文時に、台座から下に22 mmの切断を依頼してください。
電極用カニューレバイオアナリティカルシステムズMD-2251
ガラス製キャピラリーA-M システムズ624503
カーボンファイバーソルネルT650
電極引抜器ナリシゲインターナショナルPE-22
神経刺激絶縁装置figure-materials-1 Digitimer Ltd.DS4
ヒートシリンク3MFP-301
電極用絶縁電線スカイアーズ電子カスタムL 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
マイクロマニピュレーターイリノイ大学シカゴ校、エンジニアリング機械工作所
エポキシITW デブコン142505分間硬化型エポキシ接着剤
パーフルオロ-3,6-ジオキサ-4-メチル-7-オクテンスルホン酸およびテトラフルオロエチレンの共重合体イオンパワーLQ-1105すなわち、 ナフィオン
銀ペーストGCエレクトロニクス22-023
電源装置BK Precision9110
口腔内カテーテル用チューブイントラメディック427426PE 100、内径 = 0.86 mm；外径 = 1.52 mm
経口内灌流用チューブフィッシャー・サイエンティフィック02-587-1A内径 1/32インチ；外径 3/32インチ
フローセル用シリンジポンプPump Systems Inc.NE 1000
外科用セメントDentsply Caulk675571 および 675572
空気転圧シリンダVICIA606ポジションデジタルバルブインターフェース
デジタルバルブインターフェースVICIDVI230 VAC
クアッドヘッドステージノースカロライナ大学、電子施設
UEI電源装置ノースカロライナ大学、電子施設
UEIブレイクアウトボックスノースカロライナ大学、電子施設
呈味剤用シリンジポンプ電源Med AssociatesSG-504
味物質用シリンジポンプMed AssociatesPHM-107
タングステン微小電極マイクロプローブWE30030.5A3
AgClを被覆した銀線参照電極インビボメトリクスE255A
ショ糖シグマ80497
塩化マグネシウムシグマM8266
塩化ナトリウムシグマS7653
過塩素酸シグマ244252
塩酸（4 M）シグマ54435
水酸化ソディウムシグマ306576
過酸化水素シグマH1009
ドパミン塩酸塩シグマH8502
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参考文献

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Formal Correction: Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

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