出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

サマリー

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。

要約

このようなリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化などの翻訳後修飾（PTMを）は、多くのタンパク質の細胞機能を調節します。動原体DNAに関連付ける動原体タンパク質のPTMを、ゲノムの安定性を維持するために忠実な染色体分離を媒介します。このような質量分析およびウェスタンブロット分析のような生化学的アプローチは、最も一般的のPTMの同定のために使用されます。ここで、タンパク質精製法は、サッカロミセス·セレビシエに、Ndc10とNdc80、動原体タンパク質のSUMO化及びユビキチン化の両方の検出を可能にすることが記載されています。ポリヒスチジンFlagタグ付きSMT3（HF-SMT3）およびMyc標識Ndc10またはNdc80を発現株を構築し、私たちの研究のために使用しました。 SUMO化の検出のために、我々は、ニッケルビーズを用いて、HisタグSUMO化タンパク質をアフィニティー精製するためのプロトコルを考案し、SUMO化Ndc10 Aを検出するために抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用しましたND Ndc80。ユビキチン化の検出のために、我々はMyc標識タンパク質の免疫沈降のためのプロトコルを考案し、Ndc10とNdc80がユビキチン化されていることを示すために抗Ubの抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用していました。我々の結果は、彼のフラッグで目的のエピトープタグ化タンパク質はSMT3株は、複数のPTMの検出を容易にタグ付けされたことを示しています。今後の研究では、この技術の利用は、特定のPTMに依存しているタンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために許可する必要があります。

概要

それぞれ、標的タンパク質へ;（S.セレビシエ ¹ SMT3 SUMO）ユビキチンとSUMO化は、ユビキチンと小さなユビキチン様修飾剤の結合を可能にします。動原体蛋白質のPTMは、忠実な染色体の分離を確実にするために、異なる細胞周期の段階でそれらの細胞レベルおよびタンパク質 - タンパク質相互作用に影響を与えます。例えば、Cse4 / CENP-Aと外側動原体タンパク質DSN1の細胞レベルは、ゲノムの安定性^2-5を確保するためのユビキチンを介したタンパク質分解によって調節されています。不正な動原体微小管の添付ファイルの不安定化は、直接微小管^6-8と対話DAM1とNdc80複合体をリン酸化するIPL1 /オーロラBキナーゼを必要とします。 70以上の動原体タンパク質の同定にもかかわらず、PTMを、 例えば 、ユビキチンおよびSUMOとのこれらのタンパク質の修飾を調査する非常に少数の研究があります。主な制限は、PTMを維持する能力であります精製およびそのようなSUMO化、リン酸化、メチル化、および他のようなPTMを検出するためのカスタム抗体の不足時にS。 SUMO化動原体タンパク質の特性はNdc10、Cep3は、BIR1、およびNdc80カスタム抗体^9を利用^しました。さらに、Ndc10は、ユビキチン化¹⁰の基質として関与しています。ヒトHec1（S. cerevisiaeにおけるNdc80）も、APC / C-hCdh1 E3リガーゼ¹¹によって規制、ユビキチン化の基質です。したがって、Ndc10とNdc80はSにSUMO化とユビキチン化の両方を検出するためのプロトコルの最適化のための良好な候補でありますセレビシエ 。

SUMO化の識別を容易にするために、我々は、HF-SMT3とMyc標識Ndc10またはNdc80を発現する株を構築しました。エピトープタグ（HF：のHis6フラッグ）の使用は、頻繁に候補タンパク質に対するポリクローナル血清で観察された交差反応性に背景を最小限に抑えることができます。私たちは、親和性のプロトコルを考案しましたHF-SMT3複合体を精製した後、精製SMT3準備にsumolyated Ndc10とNdc80の存在を検出するために、市販の抗フラッグ及び抗Myc抗体を用いました。ユビキチン化のために、我々はmycタグ動原体タンパク質のユビキチン化を保持する修飾された免疫沈降プロトコルを考案し、Ndc10とNdc80のユビキチン化を検出するために、市販の抗Ubの抗体を用いたウエスタンブロット分析を行いました。

プロトコル

酵母細胞の1成長

1. 小さ ​​なフラスコにYPD（ 表1）30mlに酵母細胞を接種します。振とうしながら30℃で一晩インキュベートします。
2. YPD 50mlに600 nmの（OD ₆₀₀ = 0.2）で0.2の光学濃度に細胞を希釈し、振盪しながら30℃でインキュベートします。
3. 600 nmの（OD ₆₀₀ = 1.0）で1.0の光学密度に文化を育てます。
4. 2,000×gで5分間遠心操作し細胞と上清を捨てます。
5. 細胞を洗浄するために2,000×gで5分間、40ミリリットル滅菌水と遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。上清を捨て、-20℃で細胞ペレットを保存します。

タンパク質の2抽出

1. またはNi-NTAスーパーフロービーズを用いたプルダウンアッセイの氷冷グアニジン緩衝液（表1）0.5mlに再懸濁細胞を、免疫沈降した（ 表1）をバッファ。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。
2. 2メートルへの転送Lスクリューキャップチューブ。
3. ガラスビーズの同じ容量（ 材料表）を追加します。
4. 2-3分間氷上に置く、その後、室温で2分間のミニビーズビーター（材料表）で細胞をビーズ破りました。この3回繰り返します。
5. 30〜60分間、4℃で高速の渦。細胞が溶解されていることを確認するために顕微鏡下で可視化して細胞を確認してください。
   注：溶解した細胞は、暗い幽霊が表示され、境界または規定された形状を欠くであろう。最適細胞の少なくとも80％が溶解されるべきです。
6. 15ミリリットルコニカルチューブ（スクリューキャップが緩んでなければならない）コレクションに押しピンと場所を使用して、チューブの底に穴を穿刺。
7. 溶解物を収集するために1分間1000×gで遠心分離します。
8. マイクロ遠心チューブにライセートを移します。
9. 4°Cで30分間15,000×gで遠心分離は、抽出されたタンパク質を回収します。
10. タンパク質ASSAを用いて抽出されたタンパク質の濃度を測定しますYキット（ 材料の表）と同量のタンパク質を含有するすべての抽出物を正規化します。適切な緩衝液で1ミリリットルの全容量を持参してください。
    注：総タンパク質の約5 mgを50 OD ₆₀₀細胞から得られます。
11. 全細胞抽出物（WCE）として（ステップ2.10から抽出した全タンパク質は、5mgである場合に250μgタンパク質）50μLを保存します。 2×Laemmliサンプルバッファー（ 表1）の50μlを添加して、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。負荷ウエスタンブロット分析（第5節：ウェスタンブロット分析）のためのSDS-PAGEゲルの各サンプルを10μl。

HF-SMT3コンジュゲートの3精製

1. 1分間低速遠心（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりのビーズを100μl）のために必要なのNi-NTAスーパービーズ（ 材料表）を取得します。上清を取り除きます。
2. 反転トップオーバー：洗浄ビーズを1mlのPBS（材料表）で5倍底ビーズを再懸濁されるまで、低速遠心分離によりビーズを収集し、上清を除去します。
3. グアニジン緩衝液（ 表1）1mlのビーズを中断し、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によりビーズを集め、上清を除去します。トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。
   注：トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。
4. のNi-NTAスーパービーズ100μlに：各サンプルについて、（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。
5. 少なくとも4時間、または4℃で一晩、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。
6. 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。
7. 上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルにおける負荷10μlの各サンプルを（セクション5：ウェスタンブロット肛門ysis）。
8. ロッキングプラットフォーム上で5〜10分間、グアニジン緩衝液1mlで一回ビーズを洗浄します。
9. 洗浄ビーズをロッキングプラットフォーム上で5〜10分間のバッファ（ 表1）を破る1mlの5倍。
10. 2×Laemmliサンプルバッファー90μlの再懸濁ビーズ。
11. 1 Mイミダゾールの10μlを添加します。
    注：イミダゾールは、イミダゾールとビーズとの間の相互作用を競合に起因したNi-NTAビーズからのHisタグ化タンパク質を解離するのに役立ちます。
12. 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。
13. ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。
14. ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。
    注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。

Myc標識動原体タンパク質の4免疫沈降

1. 抗c-Mycのアガロースアフ​​ィニティーゲルANを取得tibody（ 材料表）低速遠心分離（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりの樹脂の25μl）をするために必要な。上清を取り除きます。
2. 緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
3. 緩衝液A 1mlの樹脂をサスペンドし、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
   注：トップオーバー底を反転させて十分に樹脂を混ぜます。
4. 樹脂の25μlに：（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。
5. 一晩4℃でロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。
6. 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。
7. 上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ローウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルの10μlの広告。
8. 緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
9. SUMEBサンプル緩衝液（ 表1）100μlの中に樹脂を再懸濁します。
   注：SUMEBサンプル緩衝液を8 M尿素および1％SDS（強い変性条件）を含みます。
10. 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。
11. ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。
12. ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。
    注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。

5.ウェスタンブロット分析

1. 4~12％のBis-Trisゲル（材料の表）とPERFにタンパク質抽出物をロードORM電気泳動は、90分間120 Vで（ランニング緩衝液： 材料の表）。
2. 90分（： 材料の表転送バッファ）、30 Vで転写装置を用いてニトロセルロース膜（ 材料表）にゲルからタンパク質を転送します。
3. 室温で1時間の5％ミルク/ 1×TBST（ 表1）で膜をブロックします。
4. 4℃で一晩、5％ミルク/ 1×TBST中で一次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。千（抗Flagおよび抗Ubの抗体）または1：5,000（抗Myc抗体）一次抗体は、1の希釈を使用しています。
5. 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。
6. 室温で1時間、5％ミルク/ 1×TBSTで二次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。二次抗体の希釈5,000：1を使用してください。
7. 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。
8. ECL workiで膜をインキュベートngの溶液（ 材料表）5分間。
9. 青感性X線フィルムに膜（ 材料表）を公開し、自動現像機（ 材料表）を使用して開発しています。

結果

以前^9,12に記載されているように動原体タンパク質Ndc80とNdc10のSUMO化を検出するために、HF-SMT3とMyc標識動原体タンパク質（Ndc80またはNdc10）を有する株は、（ 表2）を構築しました。 HF-SMT3結合体は、親和性のNi-NTAビーズを用いて精製しました。 HF-SMT3（ 図1A及び図1Bに示すように 、左パネル）を含まない対照株には存在しなかったSUMO基質のSUMO化形態の抗Flag抗体検出を可能と精製HF-SMT3のウエスタンブロット分析。予想されるように、SUMO基質の複数の形態は、HF-SMT3株で検出されました。 Ndc80とNdc10は抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を行うことにより、精製されたHF-SMT3複合体中に存在している場合我々は、次を決定しました。 Ndc80またはNdc10より高い分子量のものであった複数のバンドがはっきりと（ 図1Aおよび図1B、

ディスカッション

そのようなHA、Mycの、フラグ、GSTなどのエピトープタグは、広くタンパク質の生化学的分析のために使用されます。 HF-SMT3などNdc10やNdc80としてMyc標識動原体タンパク質、を有する株の構築は、SUMO化およびユビキチン化などのPTMの検出を容易にしています。 HF-SMT3アッセイをプルダウンNdc10とNdc80（ 図1）、SUMO化動原体タンパク質の検出を可能にします。修飾タンパク質は、HF-SMT3ない対照株では検出されなかったように抗Flag抗体を用いたアフィニティー精製プロトコルおよびウェスタンブロット分析は、HF-SMT3と標的タンパク質との間の相互作用の特異性を確立します。タンパク質基質上のMycタグの使用は、HF-SMT3複合体におけるSUMO化Ndc10とNdc80の存在を検証します。また、Ndc10とNdc80両方のSUMO化は、ノコダゾール処理細胞（ 図1Cおよび1D）に減少しました。ノコダゾールtreatmenに応じてNdc10のSUMO化の減少Tが、Ndc80は、以前Montpetit

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラスビーズ	BioSpec Products	11079105	直径0.5 mm
ミニビーズビーター	BioSpec Products	#693	8細胞攪乱器
Ni-NTA スーパーフロー	Qiagen	30430	100 ml
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc アガロース アフィニティ ゲル アントボディ ウサギで生産	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
モノクローナル抗フラグ M2 抗体 マウスで産生	Sigma-Aldrich	F1804	一次抗体、希釈 1:1,000
c-Myc 抗体 (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	一次抗体、希釈 1:5,000
マウス抗体モノクローナル 9E10	コーヴァンス	MMS-150P	一次抗体、希釈 1:5,000
ユビキチン (P4G7)モノクローナル抗体	コーヴァンス	MMS-258R	一次抗体、希釈率 1:1,000
ECL Rabbit IgG、HRP 結合全抗体	GE GE ライフサイエンス	NA934V	二次抗体、希釈 1:5,000
ECL マウス IgG、HRP 結合全抗体	GE GE ライフサイエンス	NA931V	二次抗体、希釈率 1:5,000
DC タンパク質アッセイ	バイオ・ラッド	500-0116
ニトロセルロースメンブレン	Novex	LC2001	0.45 mm 孔径
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
青色感受性 X 線フィルム	Dbio	DBOF30003
自動現像液	コダック	M35AX-OMAT
ノコダゾール	シグマ-アルドリッチ	M1404	50 mg
MG-132	セレック ケミカルズ	S2619	25 mg