方法論記事

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

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DOI：

10.3791/52485

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2015年3月7日

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1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

この記事について

サマリー

成熟した脂肪細胞は、脱分化を通じて幹細胞の豊富な供給源を表している可能性があり、これにより線維芽細胞様細胞の均一な集団が形成されます。コラゲナーゼ消化は、ヒトの脂肪から成熟脂肪細胞を分離するために使用されます。私たちのプロトコルの目標は、ヒトの成熟脂肪細胞から多能性で脱分化した脂肪細胞を取得することです。

要約

成熟脂肪細胞は、天井培養と呼ばれる技術を通じて、in vitroで表現型を線維芽細胞様細胞に逆転させることが示されています。成熟脂肪細胞は、その機能と代謝特性のデポ特異的な特性評価のために、新鮮な脂肪組織から単離することもできます。ここでは、コラゲナーゼ消化法を用いて脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離するための確立されたプロトコールと、その後の天井培養を行うためのステップについて説明します。簡単に説明すると、脂肪組織をコラゲナーゼを含むKrebs-Ringer-Henseleit緩衝液でインキュベートして、組織マトリックスを破壊します。浮遊する成熟脂肪細胞は、バッファーの上面に収集されます。成熟細胞を培地で完全に満たされたT25フラスコに播種し、逆さまにして1週間インキュベートします。別の6ウェルプレート培養アプローチにより、脱分化中の脂肪細胞の特性評価が可能になります。脂肪細胞の形態は、培養の時間とともに急激に変化します。免疫蛍光染色は、FABP4免疫蛍光染色によって実証されるように、6ウェルプレートで培養したスライド上で容易に行うことができます。FABP4タンパク質は成熟脂肪細胞に存在しますが、脂肪細胞の脱分化によってダウンレギュレーションされます。成熟した脂肪細胞の脱分化は、細胞治療と組織工学の新たな道となる可能性があります。

概要

成熟脂肪細胞のin vitro脱分化は、天井培養1と呼ばれる技術によって達成されます。水溶液中に浮遊する自然な傾向のため、単離された成熟脂肪細胞は、培地で完全に満たされた逆フラスコの表面に付着します。数日で、細胞は球状の形態を変化させ、線維芽細胞様細胞になります。得られた細胞は、脱分化脂肪(DFAT)細胞と呼ばれ、多能性です2。脂肪細胞の脱分化、特にヒト細胞に関する研究論文は限られています。しかし、彼らはすでにDFAT細胞の多能性、細胞表現型、および複製能力に関する興味深い情報を提供しています2。さまざまな脂肪コンパートメントに由来する成熟脂肪細胞は、ヒトの内臓および皮下脂肪組織に由来するものを含め、脱分化に成功しています2〜4。これらのデポに加えて、岸本らはバッカルファットパッドから脂肪組織を採取し、脱分化した脂肪細胞をDFAT細胞に採取しました5。松本らは、幅広い年齢層の患者からDFAT皮下細胞を作製することに成功し、大半の細胞は増殖率が高く、培養10継代後でも老化は6%未満でした2。

DFAT細胞は、脂肪形成、骨形成、軟骨形成、神経形成の系統2,3,6を含むいくつかの系統に再分化することに成功しています。これらの細胞は、Nanogや同定された4つの多能性因子Oct4、c-myc、Klf4、Sox23など、いくつかの胚性幹細胞マーカーを発現します。それらはまた、3つの胚芽層7のそれぞれに特異的なマーカーを発現する。さらに、DFAT細胞は、そのエピジェネティックなシグネチャー3に基づいて、骨髄由来間葉系幹細胞(BM由来MSC)と類似しています。DFAT細胞の幹細胞容量を利用して、多くのグループがさまざまな疾患の治療または改善の可能性を調査してきました8,9。心臓組織下部、脊髄損傷、尿道括約筋機能障害などの病的状態の改善は、疾患のラットモデル10-12におけるDFAT細胞注射で観察されています。

DFAT細胞の幹細胞特性に加えて、それらは脂肪細胞生理学研究のための新しい細胞モデルを表すかもしれません。3T3-L1細胞株は、脂肪形成刺激13の下でこれらの細胞が接着性の脂質貯蔵脂肪細胞に分化するため、この目的のためによく使用されます。しかし、これらの細胞はマウス胚組織13に由来する。また、このモデルではデポ特異性を調査することはできず、ヒト脂肪細胞の生理学を完全には反映していない可能性があります14。他の研究室では、マウスの脂肪貯蔵庫から単離された脂肪細胞を扱っているが、マウスでは脂肪分布は二形性ではなく、げっ歯類の腹腔の解剖学的配置は、ヒトに直接外挿することを妨げている15。ヒトの肥満の生理病理学の文脈で脂肪細胞を研究するためには、体脂肪分布と脂肪貯蔵庫特有の違いを考慮することが不可欠になっている16。脂肪組織生検サンプルから得られる細胞量や、培養で数回の継代後の老化など、初代前脂肪細胞培養にはいくつかの制限があり、代替モデルの必要性が生まれました。Perriniらは、内臓脂肪と皮下脂肪に由来するDFAT細胞の遺伝子発現におけるデポ特異性を調査し、それらを同じ脂肪デポーの脂肪由来幹細胞(ASC)と比較した。その結果、遺伝子の発現と機能の差は、主に細胞タイプ間よりもデポ間で見られることが示され、DFAT細胞が同じデポのASCに生理学的に近いことが示唆されました。DFAT細胞は、ヒトの肥満の病態生理学における脂肪分布の研究に利用可能なモデルに代わる興味深い選択肢となる可能性があります。さらに、天井培養は、組織工学目的で成体幹細胞を得るための有望な方法です。

ここでは、皮下および/または内臓脂肪サンプル17から成熟脂肪細胞を分離するために広く使用されている技術であるコラゲナーゼ消化と、天井培養を行い、これらの細胞を多能性の線維芽細胞様細胞に脱分化するためのその後のステップについて説明します。

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プロトコル

倫理声明：プロジェクトが前に患者の募集にIUCPQの研究倫理委員会によって承認されています。この記事/ビデオの目的のために、私たちは2人の患者から組織を得た：1）57キロのBMIが50.7キロ/ m 2であり、2）35歳の女性患者のBMIが62歳の男性患者/ m 2である 。実験は、両方の脂肪のコンパートメントで行うことができるが、このビデオの目的のために一種の脂肪区画に限られていた。ビデオの技術的側面は、患者1で行ったとFABP4免疫蛍光は、患者2からの脱分化細胞を用いて行った。

1.サンプル処理

  1. 腹腔鏡肥満手術の時に大網および皮下脂肪区画から脂肪組織を収集するために外科医に依頼。
  2. すぐに室温で実験室に脂肪のサンプルを持ってきて、すぐに処理します。
  3. 非無菌雰囲気の中で、研究室での消化を実行します。ザ·細胞は、最終的には培養室に移し、無菌条件下で培養される。汚染を避けるために、消化の前に蒸留し、濾過水をKRH緩衝液を調製し、濾過（0.22μmのフィルター）をたどる。フラスコとプレートの準備のための細胞培養フード中のエタノールの前に転送で十分にきれいなチューブ。
  4. 事前加重ディッシュとレコード重量に脂肪組織を置きます。パラフィン包埋の前に少なくとも24時間、室温で10％ホルマリン緩衝液中の各組織サンプル（1cm未満2）の小片を固定する。免疫組織化学実験（技術図示せず）のために、この埋め込まれたサンプルを使用してください。
  5. 全体の脂肪組織（ -技術図示していない例えば 、遺伝子発現）上のさらなる研究のために-80℃で保存する前に、液体窒素中で50 mlチューブとフラッシュ凍結に別の作品を配置します。

2.コラゲナーゼ消化

  1. 50ミリリットルtuの中の残りの脂肪組織片を置き消化のためにも。
  2. 消化管中の試料のグラム当たりのコラゲナーゼ（350 U / ml）を補充したKRH-WBを4mlを加える。
  3. はさみで脂肪組織をみじん切りに。
  4. 45分のインキュベーション（最大1時間）のために、シェーカーで37℃、90回転数の最大値を、みじん切り脂肪組織懸濁液を置きます。

脂肪細胞および前脂肪細胞の精製

  1. プラスチック製のビーカーにメッシュ400のナイロンを通して脂肪の少ないチャンクと半透明のソリューションを注ぐ。
  2. ピンセットで、ナイロンメッシュ上の細胞調製をこするとKRH-WBの5ミリリットルで洗浄する。
  3. 微妙にその中にプラスチック管および管端に取り付けられた60ccのシリンジで50ミリリットルチューブに濾過し、細胞懸濁液を転送します。
  4. 成熟脂肪細胞との懸濁液を、細胞が浮遊することによって、バッファの先頭に到達することを可能にする、約10分間放置する。
  5. ゆっくりと60ccのsyrinを使用して、チューブの底にバッファを吸引GE吸引。
  6. 洗ってKRH-WBの20ミリリットルを追加します。 2追加の洗浄のためのステップ3.4から繰り返します。
  7. 細胞の量に応じて、5または10 mlの最終容積に脂肪細胞の懸濁液をもたらすためにバッファを集める。セクション5のステップで追求しています。
  8. 所望であれば、さらに、初代細胞培養の遠心分離によって60ccのシリンジ（3000回転、RT、5分）で集めバッファから間質 - 血管画分を回収し（技術が示されていない）。

4.成熟脂肪細胞細胞数

  1. 負荷の計数室（血球計）で穏やかに振盪脂肪細胞懸濁液10μl。四重に細胞数を実行します。
  2. 孤立した成熟細胞の数を計算します。

T-25フラスコに5.成熟脂肪細胞脱分化

  1. DMEM / F12-20％ウシ血清でボリュームの3/4に25cm 2の組織培養フラスコを埋める。
  2. 細胞数に応じて、フラスコに50万成熟細胞を注ぐ。
  3. 培地で50ミリリットルチューブを使用して完全にフラスコを記入し、できるだけ多くの気泡を除去。
  4. フラスコ上の未換気キャップをねじ込みます。
  5. 汚染を避けるためにインキュベーションの前にエタノールでフラスコを清掃してください。
  6. 細胞接着が中断される場合があり文化の動きを避けるために、それに触れることなく、週に逆さまにフラスコをインキュベートする。
  7. 反転した培養7日目に、フラスコを逆にする前に、静かにフラスコを操作し、突然の動きを避け、吸引によりフラスコ内のすべてのメディアを削除します。
  8. DMEM-F12-20％ウシ血清の12ミリリットルを追加し、標準的な技術を用いて細胞を養う。ろ過、ベントキャップフラスコに添加してもよい。

6ウェルプレートに6成熟脂肪細胞脱分化

  1. 6ウェルプレートの各ウェルの底にカバースリップを置き
  2. 各カバースリップの上に½ "プラスチックブッシングを追加します。
  3. 20％のウシ血清DMEM培地の8ミリリットルで井戸を埋める。
  4. 各プラスチックブッシングにカバースリップを置く。
  5. スライドとスライドの下で細胞を注入するチューブ（ウェル当たり50,000細胞）との間にピペットチップを挿入します。
  6. 週5％CO 2、37℃で標準的な細胞培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
  7. 20％のウシ血清を補充した培地の各ウェルを含む2ミリリットル中に付着した細胞を用いた逆カバースリップと文化を追求する。
  8. 免疫蛍光（技術が示されていない）を含むいくつかの目的のために脱分化を受けている細胞でカバーガラスを使用してください。

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結果

主な形態学的変化は、脱分化（ 図1）の間に脂肪細胞を成熟起こる。 図2に示すように、脱分化を受けている細胞は、蛍光分析のために抗FABP4抗体で染色した。線維芽細胞様細胞の大部分はしなかったのに対し、丸い形態を有する細胞は、FABP4タンパク質を発現した。脱分化した後、DFAT細胞は数回の継代のための標準的な手順で培養することができる。我々は、ヒト大網および皮下DFAT細胞株のための15以上の継代に到達することができた（データは示さず）。

figure-results-1
培養12日目に7日間および（C）で4日間（B）の時刻（A）上に成熟脂肪細胞の脱分化の図1形態。写真は、位相差microscopを用いたインキュベーションの間の異なる時点で採取したE。

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ディスカッション

天井培養技術と成熟脂肪細胞の脱分化は、天然の脂肪組織の小サンプルから脂肪幹細胞を得るための新たなアプローチである。我々の経験など2のそれに基づいて、組織の1グラムを25cm 2のフラスコにプレートし、均質性がPoloni及び共同研究者3によって実証されているDFAT細胞の集団を得るために十分である。脂肪細胞の脱分化は、独立して自分の年齢、性別、その他の特徴の、いずれかのドナーからの細胞では可能と思われる。 DFATの得られる集団得なかで、完全に脱分化しなかったいくつかのラウンドにまたは部分的に細長い細胞が残っている。彼らはトリプシンメディアミックスのfloatとしてこれらの細胞は、通常、培養通路を通って廃棄される。

これらの細胞の多能性を確立し、細胞療法2,3のためのそれらの使用をサポートしている。それらの高い増殖能力はまた、報告されている私幹細胞のアプリケーション2のための細胞培養のSA貴重な側面。ヒトDFAT細胞を用いた研究は、彼らの複製および分化能力18

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会ディスカバリー助成金（371697-2011, AT）の支援を受けました。著者は、肥満外科医のS.ビロン博士、F-S.の助けに感謝したいと思います。IUCPQティッシュバンクのHould、S. Lebel、O. Lescelleur、P. Marceau、Christine Racine、Caroline Gagnon。IUCPQのオーディオビジュアルサービスのジャック・カドレット氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミンΣA7906
アデノシンΣA4036
アスコルビン酸ΣA0278
NaCl任意のブランドが使用可能
KCl任意のブランドが使用可能
CaCl2任意のブランドが使用可能
MgCl2任意のブランドが使用可能
KH2PO4任意のブランドが使用可能
HEPES任意のブランドが使用可能
グルコースブランドが使用可能
I型コラゲナーゼWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12,HEPES、フェノールレッドなしGibco-Life Technologies11039-021培地に加える : 20% 子牛血清、ゲンタマイシン (50 & micro;g / ml)およびfungizone(2.5µg/ml)
子牛血清、鉄分、粉ミルクで育てられた子牛からSigmaC8056-500 ml
1/2 プラスチックブッシングIberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
液体窒素Linde
ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%SIGMAHT501128
滅菌ピンセット
滅菌はさみ
60 cc シリンジBD シリンジ
プラスチックチューブ
クレブス-リンガー-ヘンセライト ストックバッファー (KRH)ストックバッファーを次のように準備します: 25 mM HEPES pH 7.6、125 mM NaCl、3.73 mM KCl、5 mM CaCl2.2H2O、2.5 mM MgCl2.6H2O、 1 mM K2HPO4.pHを7.4に調整します。
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)KRHバッファーに次の成分を新たに追加します:4%ウシ血清アルブミン、5 mMグルコース、0.1 & micro;Mアデノシン、560 µMアスコルビン酸
KRH-WBにI型コラゲナーゼ350 U/mlのタイプIコラゲーゼ
T25 アンベントキャップ組織培養フラスコSarstedまたは他のブランドの
6ウェル組織培養プレートBDファルコンまたは他のブランドの
顕微鏡カバーガラス 22x22フィッシャーブランド12-542-B
滅菌ビーカー
任意のを添加

参考文献

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