レタスの潜在的な干ばつ耐性のためのセミハイスループットスクリーニング（レタス）遺伝資源のコレクション

サマリー

このプロトコルは、生理学的、分子的、遺伝学的研究で使用するレタスの小さな候補プールを特定するために、葉物野菜レタス(Lactuca sativa L.)の大規模な生殖細胞コレクションの干ばつ耐性をスクリーニングするために開発されました。これは、育種プログラムとともに根底にある干ばつ耐性形質を特定する

ためのものです。

要約

このプロトコルは、葉物野菜レタス(Lactuca sativa L.)の生殖形質の大規模なコレクションが、おそらく干ばつ耐性形質についてスクリーニングされた方法を説明しています。 農業用の淡水の利用可能性は、米国だけでなく世界の多くの地域で懸念が高まっています。短期的な干ばつ現象と、水の利用可能性の規制に対する規制の介入、そして多くの重要な農業地域での降水量の減少につながる可能性のある長期的な気候変動の脅威が迫っていることから、今後数年間で生産を維持または拡大するために、水利用効率の向上に適応した作物の開発を急ぐ必要性が高まっています。 このプロトコルは、レタスの生理学的または分子レベルの干ばつ耐性形質を特定するための段階的なガイドとして意図されたものではなく、数千の異なるレタス品種のスクリーニングを通じて開発および改良された方法です。 このスクリーンの性質は、葉の相対的な水分含有量、萎凋病、干ばつストレス後の植物の成長の違いという3つの水ストレス指標のみに焦点を当てた合理化された測定に一部基づいています。大規模な生殖細胞コレクションを迅速にスクリーニングする目的は、候補プールを絞り込み、より集中的な生理学的、分子的、遺伝的方法を適用して、研究室または野外で特定の干ばつ耐性形質を特定できるようにすることです。 候補者は、干ばつ耐性形質の源として育種プログラムに直接組み込むこともできます。

概要

灌漑のための水の利用可能性は、何十年にもわたって米国の大部分および世界中で懸念事項となってきましたが、他の非生物的ストレスとともに、主に資金不足のために、病気や昆虫抵抗性の領域での研究は、主に産業、学術、および政府レベルで遅れをとっています。農業のための水の利用可能性は、歴史的に政策立案者のレベルでは後回しにされてきました。 最近、米国とオーストラリアの重要な農業生産地域での深刻な干ばつにより、^1,2 淡水の利用可能性が国内および国際レベルの両方で注目を浴び、より多くのリソースが主要な穀物作物の干ばつ耐性品種の開発に関する研究に向けられています。 このように干ばつに強い主要作物の開発に焦点を移すことは有益ですが、植物研究の多くの分野と同様に、特殊作物もほとんど取り残されています。

深刻な干ばつにより、現在、米国で最大のレタス(Lactuca sativa L.)の生産地域であるカリフォルニアでの野菜生産が制限され^{ています3。} これらの短期的な気象パターンは、立法および司法措置、および長期的な気候変動^4,5と相まって、カリフォルニアの最も生産性の高い地域の多くで農業に利用できる水を減らしています。カリフォルニア州のレタス生産は15億ドル規模の産業であり、米国のレタス生産の約80%を占めています³。 葉物野菜は葉の水分含有量が高く、特にレタスは根系が浅い^6,7ため、作物は水ストレスに対して脆弱です。レタスでは、すべての作物と同様に、灌漑用の淡水供給がより制約されるようになるにつれて、干ばつに強い品種の開発がますます重要になります⁸。

このプロトコルは、特定の干ばつ耐性形質を特定するための生理学的、分子的、遺伝的研究で使用する可能性のある干ばつ耐性候補系統のプールを特定するために、レタスの生殖質の大規模なコレクションに対して最初のスクリーニングが行われた方法をレイアウトします。 これらの候補は、商業栽培品種の水利用効率を改善するための育種プログラムにおいて、干ばつ耐性の源として直接使用することもできます。 このプロトコルは、広範な生殖質コレクションのスクリーニングの過程で発生する課題、特にスペースの利用可能性と労働力の問題に対処するために特別に開発されました。 また、提示されたプロトコルはレタスで使用するために開発されましたが、潜在的な干ばつ耐性についてほうれん草(Spinacia oleracea)の生殖細胞コレクションのスクリーニングでの使用にうまく適応されており、単に任意の葉物野菜作物をスクリーニングするために変更することができます。

干ばつ耐性のスクリーニングを開始する前に重要な考慮事項は、この方法が何であるか、そして何でないかを理解することです。 このプロトコルは、大規模な生殖質プールを迅速かつ効率的に絞り込み、個々の耐性形質を特定するためのより焦点を絞った徹底的な研究で使用するための、管理可能な数の候補生殖質に絞り込むことができる迅速な方法を表すことを目的としています。 このプロトコルは、野外条件下で観察される、より自然でゆっくりと誘発された中程度の継続的な干ばつストレスとは対照的に、植物を急速に誘発する深刻な水ストレスにさらします。 これら2つのタイプの水ストレス事象(急速な脱水と自然の干ばつ)の間に植物内で誘発される応答のタイプは同一ではなく⁹、これは将来の試験から一部の材料が除外される可能性がある。 これら2つのストレスイベントは重複しないわけではありませんが¹⁰、このプロトコルは、大規模なコレクションに含まれる潜在的に干ばつ耐性のある生殖質を特定する効果的な方法として機能するはずです。 このプロトコルだけでは、野外水ストレス条件下で耐久性のある干ばつ耐性を持つ生殖質を高い確実性で特定するには十分であるとは考えられませんが、潜在的な干ばつ耐性形質のための葉物野菜の迅速なスクリーニングにおける重要な前進を表しています。

プロトコル

1.植栽

1. プラグ土壌ミックスで、（セル3センチの正方形と28のx 54センチメートル5cmの深い128セル）プラグトレーを埋める。細胞の均一な充填を助けるためには、空のプラグトレイを使用して、各トレイに土を圧縮する。
2. 深さの植物レタス種子¼インチセル当たり2-3の種子。干ばつの両方を提供するために、プラント複製されたトレー内のすべての実験的なラインは、干ばつのトライアル用のトレーを強調し、コントロール。
3. 穴のないベーストレイにプラグトレーを置きます。
4. 水トレイ、反転トレイやプラスチックドームでカバー。発芽は、通常は48〜72時間で起こる。発芽後はカバーを取り外し、温室にトレイを移動します。
   注：このプロトコルは、成長チャンバ内で行うことができた。

2.成長と事業所ケア

1. 水のトレイは、発芽後1-4週間後から必要に応じて、通常は、これは下トレイを充填し、土壌が（〜1時間）飽和になるようにすることで、週に2〜3回で長時間座って光線このような水の中では、負に植物の健康および根の発達に影響を与えることができ、干ばつ画面に影響を与え得る。
2. 1.5 TSP /ガロンの割合で混合し、市販の水溶性20-20-20肥料を週1回のトレイを受精。
3. セル1〜2週間ごとに1つのプラントに薄いトレイは、発芽を投稿。

3.開始乾燥ストレス

1. 植物は2つのグループに4週齢の別々のトレイがあるとき。深刻な水ストレスにさらさつのグループ。同様にコントロールを骨抜きに他のトレイを使用してください。実験を通してステップ2.1のように、対照群に水を。乾燥ストレス開始時の実験の残りのためのすべてのトレイを施肥一時停止。
2. 実験的な干ばつ期間は1週間にわたって行われます。乾燥ストレス試験（0日目）の最初の日に、水ですべての下のトレイを記入し、プラグトレイの土壌が、その後完全に飽和状態になるのトレイから水を排出することができます。トンの開始直前に土壌を飽和彼ストレス期間は、プラグトレー内の個々のセル間の土壌水分の任意の変動を最小限に抑えるのに役立ちます。

測定されるべきパラメータを使用した基本的な乾燥ストレス画面を実施4。

注：次の手順は、 表1は、干ばつストレスの試用期間のそれぞれの日に行われた測定のスケジュールを提供しながら、干ばつ画面の過程で記録されます3生理学的な測定値を収集する方法の概要を示します。

1. 日0,2、裁判の4葉の相対水分量（RWC）を測定します。
   1. トレイからレタス植物をクリップし、2葉を取り除く。
   2. ＃9コルクボーラー（〜直径1.6cm）を使用して、各葉から3ディスクをパンチ。 1サンプルとして葉のパンチを結合します。
   3. リーフディスクを量り、これはRWC計算に用いる新鮮重量（FW）値であり、その後ペトリプレートにディスクを配置します。
   4. すべてのプレートにちょうど十分な蒸留水を追加します。OWすべてのリーフディスクをフロートする。これは、完全RWC分析用の腫れ上がった重みを収集するために、葉ディスクを水和することです。葉ディスクを室温で24時間、フロートすることを許可する。
   5. プレートから完全に水和した葉ディスクを外し、静かにディスクを計量する前にペーパータオルで葉ディスクの外側を乾燥させます。 RWC計算に腫れ上がった重量（TW）として、これらの重みを記録します。
   6. 紙のラボに置きリーフディスクを24時間55℃のインキュベーター内でワイプまたはオープンペトリ皿にろ紙ディスクとドライ。
      注：紙は乾燥中に、シャーレに付着するのリーフディスクを防ぐことができます。
   7. ドライリーフディスクを秤量し、RWC計算のためにとして乾燥重量（DW）を記録。
   8. スマートとビンガム^11,12によって記載されているようRWCはWeatherleyの式を用いて計算します。
      RWC =（FW-DW / TW- DW）* 100
      FW =生体重、TW =腫れ上がった重量、DW =乾燥重量
   9. 裁判における各遺伝資源及び治療のために手順を繰り返し4.1。
2. 乾燥ストレス試験の1日目に一日一回初め萎凋や植物の100％が正常に4日または5、しおれているときに終了する植物を記録します。
3. 回復期と成長差
   1. 6日目に、干ばつストレス期間を締結し、ストレスを受けた植物は裁判の回復期に入る。水と下のトレイを記入し、干ばつストレストレイはコントロールトレーとして、標準散水スケジュール、ステップ2.1を再開する前に24時間浸漬することができます。
   2. すべての植物が10日間回復できるようにします。
   3. 10日目に、干ばつストレスを投稿各植物の地上部の上方全体を収穫し、新鮮な重量を記録します。

結果

このプロトコル干ばつストレス応答の場合には、所望の実験的な特色によって集団を分離するために、大画面を行う場合には、それに応じて非常に異なっても、生成されるデータは、おそらく干ばつ耐性との間のすべての点に対して感受性強調する。 図1は、このプロトコルが期待できる結果の種類を示すグラフを含む。三つの異なるレタスタイプ（ロメインレタス（COS）、crisphead、およびバター）の代表的な品種は、示されたデータに含まれています。唯一の3レタスの種類を表すデータがここに示されているが、このプロトコルは、ほとんどのタイプ間レタスとほうれん草遺伝資源の何千ものスクリーニングの間に開発されました。レタスの3つのタイプに加えて、以前にこのプロトコルが正常に赤と緑の葉を選別し、密接に関連したレタスserriola種からの遺伝資源だけでなく、関係のないルと一緒に型レタスを食い止めるために利用された言及AFY緑の野菜のほうれん草。著者らは、実地試験のための200レタス品種の候補プールに4,000以上のレタスコレクションを狭めるためにこのプロトコルを使用して生成されたデータを使用する。

ディスカッション

スクリーンのためのサンプル数の考慮事項。

必要なサンプル数は、この画面からのデータの所望の用途に基づくべきである。出版品質の結果が必要な場合には、各ラインから3個々の植物（3生物学的複製）を収穫し、品質統計分析のために十分なポイントを与えるために2実験の繰り返しの最小を実行することをお勧めします。所望の結果は、単に迅速に、より厳格なまたは複雑な水ストレス実験を行うために、候補遺伝資源の大きなプールを狭くする場合、以下のサンプル及び又は複製を必要とすることができる。必要なサンプル数は、植え付けの時に決定されなければならない。

トレイに土壌乾燥のレイアウトと考慮事項を植える。

1つの非常に重要な考慮事項は、プラグトレイの端にある細胞内の土壌は、内部細胞や介護よりも急速に乾燥することです唯一のトレイ内部（ 図2）から植物を収穫することにより、結果の偏りを避けるために注意す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラグトレイ 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	どのブランドのプラグトレイでも動作しますが、すべての試験で同じスタイルのトレイを使用してください。
下トレイ (ディスプレイトレイ)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	このプロトコルを別の作物に適合させる場合は、別のミックスで代用する必要があるかもしれません。 サンシャインミックス#4は、ほうれん草の試験で使用されました。
肥料 (20-20-20)	Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International	07-5915-1	任意の肥料を使用でき、このプロトコルを特定の需要に適合させるために必要に応じてタイプを調整します。