リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。 ここでは、感染した動物におけるL.単球遺伝子の心臓細胞浸潤および心臓コロニー形成を評価する方法を説明するプロトコルを提示する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
リステリア単球遺伝子は、免疫不全患者、高齢者、および妊婦に重篤な侵襲感染を引き起こす可能性のあるグラム陽性の栄養性細胞内病原体である。 ヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状には、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶が含まれる。 侵襲的なL.単球遺伝子感染の有意だが、はるかに文書化された後遺症は、心臓を含む。 心臓病による死亡率は治療にもかかわらず最大35%までであり得るが、心臓組織のL.単球遺伝子コロニー形成およびその結果として生じる病理に関してはほとんど知られていない。 さらに、最近では、L.モノサイト遺伝子の亜集団が心臓組織内に侵入し、成長する能力が強化されたことが明らかになりました。 このプロトコルは、L.単球遺伝子分離株の心肺を評価するために使用することができるインビトロおよびインビボ法で詳細に記述する。 組織培養におけるH9c2ラット心筋芽細胞の感染、ならびに感染したマウスの心臓の細菌コロニー形成の決定のための方法が提示される。 これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定するのに有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理学の変化を促進するのに役立つ細菌遺伝子産物の同定を促進する可能性がある。 これらの方法はまた、複数のL.単球遺伝子株間の心筋症の直接比較を提供する。
概要
リステリア単球遺伝子は、高齢者、妊婦、HIV/AIDSを有する人、および化学療法を受けている人を含む、感受性の高い集団において重篤な疾患を引き起こすことができるグラム陽性細胞内病原体である。これらの集団における感染は、汚染された食品を摂取した結果が多く、ほとんどの感染症は大規模な食物媒介性の流行2,3に関連している。ヒトおよび他の哺乳動物において、L.単球遺伝子は小腸の上皮境界を越えて転位することが可能であり、その後肝臓4,5に輸送される。動物モデルは、摂取した細菌が腸絨毛内で複製し、門脈静脈を通って肝臓に移動したり、腸間膜リンパ節を介して血流に広がったりし、肝臓および脾臓への血中血球播種化につながることを示唆している。肝臓および脾臓において、細菌は、プロの食細胞と常駐的なパレンキマル細胞の両方への取り込みを媒介することができ、これらの器官内の感染を迅速に確立する。細菌の負荷が増加するにつれて、多数の細菌が血液中に分散され、中枢神経系および胎盤(存在する場合)を含む感受性の組織をさらに植民地化することができる。これらの部位のコロニー形成は、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶を含むヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状を妨げる2。
選択されたL.単球遺伝子の亜集団は、最近、心臓組織8内に侵入し、複....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. L. 単球遺伝子 株の保存と培養条件
- 脳心注入寒天(BHI)をオートクレーブし、溶融培地をシャートリプレートに注ぐことで固体培地を準備する。プレートを室温で一晩乾燥させ、その後37°Cで再び一晩乾燥させます。
- 滅菌ループを使用して、以前に作られた冷凍庫のストック(BHI液体培地中の20%グリセロールに懸濁した細菌、-80°Cで保存された細菌)または以前に単離のために打たれたコロニーを含む寒天プレートから 、L.モノサイトゲネス の小さなサンプルを得る。
- 無菌技術を使用して、単一コロニー分離のためのサンプルをストリークする。クロスストリーク間のループを殺菌して過剰な持ち越しを防止し、評価される株の個々のコロニーの分離を確実にしてください。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- 滅菌ループを使用して、14mlポリスチレンチューブで分離物のコロニーを1つ取り除き、2mlのBHIブロス(寒天なし)を接種します。
- アッセイおよび感染症の場合、37°Cインキュベーターで一晩(振盪せずに)静かな(振盪せずに)スープ培養液をインキュベートする。培養した分離株のストッキングのために、180〜200rpmで一晩振盪して37°Cで培養したスープをインキュベートする。培養物は、グリセロールを20%の最終濃度に加え、-80°Cで密閉管を無期限に保存することによって貯蔵することができる。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
選択した単球遺伝子の単離株は、細胞培養およびマウス感染モデルにおける心臓細胞の侵入を増強する。図1は、細菌コロニーが寒天培地上の懸濁液のスポットめっき後にどのように現れるかの例を示す。この方法により、多数の寒天メディアプレートを使用することなく、サンプル内のCFUsを正確に評価できます。図2は、株07PF0776の株と心臓細胞に侵入する株10403Sの能力を比較する組織培養ベースのアッセイの一例を示す。10403Sに感染した細胞と比較して、ゲンタマイシン治療後の感染したH9c2心臓細胞から2倍以上の07PF0776細菌CFUを回収することができる。このアッセイを用いた心性向きの株に対しては、2~4倍の違いが日常的に観察される。図3は、感染後3日での肝臓、脾臓、および感染したマウスの心臓からの細菌の回復の例を示す。心性異性器株07PF0776または株10403Sを有するマウスの感染は、感染したマウスの肝臓および脾臓から同じ数の細菌を生じるが、07PF0776に感染したマウスは、心臓から検出可能な数の細菌を生じさせ、この器.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
L. 単球遺伝子 は、広範囲に及び、よく特徴づけられるヒト病原体であり、多くの異なる疾患症状を引き起こすことができる15。細菌は、中枢神経系に到達し、植民地化し、胎児を発達させるために、血液脳関門や胎盤胎児障壁などの障壁を越えて移動する能力について以前に説明されています。これらの組織を植民地化する生物の 生体内 能力は、多くの場合、標的となる器官を構成する培養中の代表的な細胞に侵入する インビトロ 能力によって補完される。例えば、脈絡叢における上皮細胞の侵入は、CNS16を植民地化する生物の能力と関連している。絨毛性トロホブラストの外植物は、母体胎児の障壁17を表すために使用されてきた。本プロトコルでは、培養中の心臓細胞の細菌浸潤を評価する場合や、肝臓および脾臓のコロニー形成に対する個々の分離株に対する心臓の細菌コロニー形成の比較に有用である方法が記載されている。
このプロトコルには多くの重要なステップが含まれていますが、最も重要なものの中には、カバーリップで増殖.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、競合する財政的利益を報告していない。
謝辞
この研究は、公衆衛生サービスがAI41816およびAI099339(N.E.F.)を付与し、NiAIDからF31AII094886-01(P.D.M.)によって支援されました。 内容は著者の責任であり、必ずしも資金調達源の公式見解を表すものではありません。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2 kg of Brain Heart Infusion Powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2 kg of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% |
| Agar in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| フィッシャー | グラスカバースリップ | 12-545-80 | 12 mm ガラスカバースリップ |
| ファルコン | 24 ウェル組織培養プレート | 35-3047 | 24 ウェル、プラズマ処理組織培養プレート |
| ファルコン | 14mL ポリスチレンチューブ | 352051 | 14 ml ポリスチレンチューブ |
| ファルコン | 96 ウェル U 底プレート | 35-3077 | 非組織培養処理 96 ウェルプレート |
| コーニング | 0.05% トリプシン、0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | 組織培養用トリプシンEDTAの原液 |
| コーニング | DMEM(高グルコース、高ピルビン酸) | 15-013-CU | DMEM培地 FBS、グルタミン、抗生物質を含まない |
| コーニング | ペン/連鎖球菌/グルート液 | 30-009-CI | ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミンの組織培養用原料混合物 |
| コーニング | ゲンタマイシン | 30-005-CR | 50 mg/ml 組織培養用ゲンタマイシンの原液 |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | 抗生物質を含まないL-グルタミン原液 |
| デンビル | 75cm^2 フラスコ | T1225 | 75 cm2 組織培養処理フラスコ |
| デンビル | 1.5mL 微量遠心チューブ | 2013004 | 1.5ml 微量遠心チューブ |
| ATCC | H9c2 心臓筋芽細胞 | CRL-1446 | ラット心臓筋芽細胞Hyclone |
| ウシ胎児血清 | SH30070.63 | シ胎児血清 |
参考文献
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
