自動画像処理手法を用いてマウス社交性の実験的評価

サマリー

このプロトコルは、マウスの社交性を定量化する方法について説明します。彼らは移動し、特別なケージで相互作用するように、マウスをビデオテープに録画されています。動画処理は、優れた精度と信頼性と社交性の自動定量を可能にします。

要約

マウスは、社交性を高めるために設計された薬剤を試験するための好ましいモデル生物です。我々は、試験マウスは、標準化された装置及び関連行動に配置されているマウスの社交性を定量化する方法は、（セッションI、II、およびIIIと呼ばれる）は、3つの異なるセッションで評価される示します。

装置は、3つの区画（ 図1を参照）があり、左右の区画（「刺激マウス」と呼ばれる）は、マウスを収容することができる倒立カップが含まれています。

セッションIにおいて、試験マウスをケージ内に配置され、その移動度は、区画間での遷移の数によって特徴付けられます。セッションIIでは、刺激マウスは、逆カップのいずれかの下に置かれ、試験マウスの社交性は、それが空の反転カップ対囲まれた刺激マウスを含むカップの近くに費やす時間の量によって定量化されます。セッションIIIでは、反転カップが削除されます D両方のマウスは自由に相互作用します。セッションIIIでの試験マウスの社交性は、それが刺激マウスに向かって、それが刺激マウスで社会的なアプローチを回避した回数だけ行い、社会的なアプローチの数によって定量化されます。

映画の自動評価は、全ての決意がセッションIおよびII（セッションIIIに、アプローチは自動的に識別が、手動で分類されている）で社交性対策を説明できます試験マウスの鼻を検出します。鼻を見つけるには、空のケージの画像は、デジタル動画の各フレームから減算され、得られた画像は、マウスピクセルを識別するために二値化します。マウス尾は自動的に削除され、残りのマウスの二つの最も遠い点が決定されます。これらは、鼻と尾の付け根に近いです。マウスの動きを分析し、連続引数を使用して、鼻が識別されます。

「図1」SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
3つのセッションの間に社交の図1.アセスメント セッションI（上）：ケージに試験マウスの順化セッションII（中央）：刺激マウスが反転カップで囲まれている間テストマウスはケージ内を自由に移動するセッションIII。 （下）：試験マウスおよび刺激マウスの両方が自由に移動し、互いに相互作用させます。

概要

障害社交性は、自閉症スペクトラム障害（ASDに^）1,2を含む神経発達障害の範囲の主な症状ドメインの1つです。それは深刻な関係を開発する患者の能力を制限し、大幅に患者、家族、介護者^2,3に影響^を与えます。

より良い障害の社交性の根底にあるメカニズムを理解し、治療法を開発するための努力では、いくつかのマウスモデルが^1,4-9を検討されています。そのような株は、BALB / cマウス、ASD5 ^8-12と患者に見られる特徴に似ている、著しく低い社交性を示す近交系です。例えば、BALB / cマウスは、社会的なアプローチやスイスウェブスターコンパレータ株¹⁰よりも刺激マウス（ 例えば、社会的回避）することにより、社会的アプローチとは、通常、否定応答の低い周波数を表示します。

提案された治療がeffectivであるかどうかをテストするには社交性を高めることで、電子は、客観的な対策が必要とされています。広く受け入れられているフレームワークは、3つの区画（ 図1参照 ）を有する標準化された装置で社交性を分析することです。

左右の区画それぞれが社会的に顕著な刺激マウスを収容し、反転ワイヤーカップが含まれています。試験マウスは、3つの10分の間隔（セッションI-III）のための装置中に放出されます。セッションIIとIIIは、試験マウスの社交性の異なる側面を評価しながら、セッションIは、試験マウスの自発運動を評価します。

セッションIでは、試験マウスは、装置に順応することが許可されています。このセッションでは、試験マウスは、異なる区画間なる遷移の数が測定されます。重要なのは、標準3コンパートメント装置で得られた社交性対策は運動活性に依存しており、減少自発運動はSOCIの解釈を混乱させることができます能力データ。

セッションIIでは、試験マウスを自由に移動していると刺激マウスを反転カップ（相殺）のいずれかの下に置かれています。刺激マウスは、4週齢の非近交系の雄ICRマウス、年齢および性別をマッチさせた試験マウスにあります。刺激マウスは、社会的な区画として指定された側に反転したカップ内に封入されており、空の反転カップが非社会的コンパートメントとして指定された側に配置されています。セッションIIでは、試験マウスの社交性は、それが「社会」に反転、それは「非社会的」に反転カップの近くに費やす時間対カップ（2cm未満の距離）、および時間により近くに費やす時間を比較することによって定量化されますそれは非社会的コンパートメントに費やす時間対社会的なコンパートメントに費やしています。スイスウェブスターコンパレータマウスは、社会的なコンパートメントにし、社会のために有意な好みを示さないBALB / cマウスに比べて社会的な反転カップの近くにかなり多くの時間を費やしますカップや社会コンパートメント^12を反転。

セッションIIIでは、テストと刺激マウス（反転カップが削除されている）を自由に相互作用することが許可されています。社交性の対策は、区画間の常同行動と遷移が確実にテストと刺激マウスとの間の自由な相互作用の第三の10分のセッションで得られたと分析されます。ように刺激マウスに向けて社会的なアプローチが前方に移動することと定義されて、それが刺激マウスに向かって行い、社会的なアプローチの1）数、（鼻最初）：この報告書では、試験マウスの社交性は、2つの指標を介して定量化されます鼻が2cm未満離れて刺激マウスからです。 2）刺激マウスの社会的アプローチのavoidancesの数。それがオンまたは刺激マウスから離れる、または、それが一時的に刺激マウスの後に（「すくみ行動」）の移動が停止した場合、試験マウスに近づいた場合に試験マウスは、アプローチを回避していると考えられます。 BALB /cマウスは、スイスウェブスターコンパレータ株¹⁰に比べて刺激マウスと刺激マウスの社会的なアプローチに対する否定応答の数の増加に向けた社会的なアプローチの数の減少を示します。

行動映画の評価は伝統的に（おそらく減少した速度で）慎重に映画を見て、マウスが特定のコンパートメント内または逆カップ¹⁰の1近くに費やす時間をストップウォッチを活性化することにより、 すなわち 、手動で行われてきました。この方法は、繰り返し映画の視聴必要とし、従って、非常に時間がかかります。また、精度はストップウォッチ計測、マウスが反転カップ2cmの範囲内にあるかどうかを知覚する能力のための評価者の反応時間によって制限されます。最近の研究では、二つの化合物、（D-セリンおよびD-サイクロセリン）は、BALB / cマウス^9,10,12-で社交性を回復するのに有効であることが証明されています。これは、両成分がMODUことが知られています社会的行動^2,12において中心的な役割を果たしていることが知られている後半NMDA受容体、。化合物の大規模な配列は、明確に定義された様々な方法でNMDA受容体活性を調節することが知られており、ASD治療における画期的な可能性は、これらの化合物の優先順位と非常に望ましい評価のための高速自動方法の迅速な評価を行っています。

以下に説明するが、マウス社交性の評価のために開発された自動分析手順です。これは、マウスやマウスの位置を特定するために、マウスのムービーのすべてのフレームの画像処理方法を使用しています。 IとIIのセッションでは、さらに、鼻の位置を検出し、社交性の尺度を計算するためにそれを使用します。セッションIIIでは、それは自動的にすべてのアプローチを検出したが、マニュアル分類（社会的アプローチ、社会的回避、または他の）が必要です。

プロトコル

1）実験手順および2）自動分析：説明を容易にするためのプロトコルは、2つの部分に分割されています。全ての動物は、実験動物の管理と使用¹⁵用のガイドに従って処理し、すべての手順は、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.実験手順

1. 非社会的、社会的、中立中央の区画（ 図1）：黒無反射プレキシガラス長方形のボックス3つの区画に分かれて（52×25×23センチメートル^3）でケージを、設定します。セッションIおよびII（後述）中にエンド区画のそれぞれで反転ワイヤーカップを置き、セッションIIの間に刺激マウスを収容します。
2. ケージが視野を埋めるようにカメラを設定します。照明は、マウスの動作を妨害することができるので、より間接的な光から来て、ケージの中にせいぜい3.5ルクスの明るさを維持白熱電球と上方向にケージの床で測定。また、マウスが感知することはできませんが、カメラが検出できる赤外光源を、使用しています。 720×480の標準的な定義ですべてのムービーを記録します。
3. （「基準フレーム」と呼ばれる）は、後の画像処理のための空のケージの単一のフレームを記録し、グレースケール画像として保存します。
4. セッションI：（自動解析を比較）セッションの開始を示す、ケージの上にケージと波の手に試験マウスを紹介​​します。 10分間の録音ムービー。 10分の終わりには、元のケージに戻し、マウスを置きます。
5. セッションII：反転カップ（相殺）のうちの1つの下での刺激マウスを置きます。
6. 刺激マウスが左に、右に反転カップで反転カップ内にあるかどうかを選択するために、「社会が左」または「ソーシャル右」ボタンを使用します。
   注：刺激マウスで反転カップは、他の一方で、「社会的なカップ」と呼ばれていますカップ「非社会的カップ」。社会カップが置かれているコンパートメントは非社会的カップ付きコンパートメントが非社会的コンパートメントで、中央のコンパートメントは「中立コンパートメント」で、社会的なコンパートメントと呼ばれています。
7. ケージに試験マウスをご紹介します。セッションの開始を示すために、ケージの上に波の手。 10分間の録音ムービー。重要なことは、第3セッションを開始するために、反転カップを取り外す前に、社交性の装置でマウスを保持します。
8. セッションIII：、反転カップを取り外し、両方のマウスを解放し、テストと刺激マウスはお互いに自由に対話することを可能にします。セッションの開始を示すために、ケージの上に波の手。 10分間の録音ムービー。 10分の終わりに、バックそれぞれのケージに両方のマウスを置きます。

2.自動解析

注：セクション2のコマンドは、グラフィカル・ユーザ・インタフェースを介して発行されます（ 図2を参照）、そのコン私たちのソフトウェアをントロール。ここでは、当社のソフトウェアが可能にするステップバイステップの処理を説明します。ソフトウェアはまた、ユーザ入力なしにバッチモードで分析を行うことができます。

1. すべての映画のために、以下の処理ステップを実行します。
   1. ロードムービー（Loadボタンをクリックします）。
   2. 解析プログラムにケージの境界、区画境界、およびカップの場所の位置を指示するケージの設定を、選択します。 4保存された構成のいずれかを選択するか、手動ですべての座標を調整します。
      注：構成は、通常、一つの実験から次へと変更されないため、再利用することができます。
   3. 動画の各フレームについて、次の処理ステップ（2.1.3.1-2.1.3.6）を行います。
      1. 「グレースケール」ボタンをクリックしてグレースケールにフレームに変換します。
      2. デジタル「引く」ボタンをクリックして（ステップ1.3を参照）、グレースケール参照フレームを引きます。注：このステップの目標は、ピクセルVAを作ることですマウスの位置を除いてどこでもゼロに非常に近いフレームの梅毒。
      3. 黒に一定の閾値レベル以下のすべてのピクセルを設定することにより、フレームを2値化、白にそのレベル以上のすべてのピクセルは、（「2値化」ボタンをクリックします）。
         注：アイデアは、マウス画素は一般に残りの画素よりも高い値を有するので、マウスの画素が白と他のすべての画素の黒になることです。最適な閾値レベルは、照明条件に依存し、映画全体マウス形状を評価することによって決定することができます。閾値が低すぎる選択された場合、マウスが大きすぎて表示され、マウスに属していないピクセルが白色に着色することができます。閾値が高すぎると、マウスは小さくなり、切断された小片に崩壊することができます。撮影した動画では、最適なしきい値は20と35の間（0〜255のスケールで）常にありました。
      4. ¹³値化画像電子時間を侵食し、その後EROその後^、13 2eの時間を拡張デ再び電子回、ボタン「EROD /ディル」を押すことによって。
         注：この手順の目的は、尾を除去することです。使用された解像度（720×480）の場合は、E = 3は、すべての状況で働いていました。
         注：ソフトウェアは、画像における手の存在を自動的にチェックします（動画の撮影中に、手はセッションの開始を示すために、絵を通して手を振っています）。手が存在する場合は、手がマウスよりもはるかに大きいので、二値化フレームに異常に多くの白画素が存在することになります。手の存在のための条件は、二値化フレームで10,000人以上の白画素があるということです。ソフトウェアは、手の動きが発生したフレームの範囲を検出することにより、セッションI、II、およびIIIの始まりを決定します。
2. 次のようにセッションではIおよびII、継続：
   1. 白画素の集合の最大の連結成分を検出（「LCOMP」をクリックしてください）​​。注：汎用Oをこの工程FセッションIIで刺激マウスの動きによって引き起こされる、 例えば 、マウスに属していない白画素を排除することです。最大の連結成分は、ほぼすべてのフレームのマウスです。
   2. 「エンドを探す」をクリックする（マウスの「端」と呼ばれる）は、2つの最も離れた白画素を決定します。
      注：このソフトウェアは、両端の連続性を確立し、 すなわち 、それらが属する後続のフレーム内のどのへの両端の最初のフレームにおける端部の各々のために。一般的な考え方は、フレームが高速で記録されているので、端部が次の1つのフレームから遠くに移動することができないので、それは、次の1つのフレームから端部の正しい継続のための距離の和を最小化するものであること端部が移動します。詳細についての議論を参照してください。
   3. 鼻であるマウスの終了を決定します。
      1. 方向を決定する中で観察することによって、マウスの移動方法重心（COG）フレームからフレームへの変更（COGの動きがすべてのマウスのピクセルの合計の動きです）。
         注：画素P ₁の組のCOGは、···、座標P _{nは 1、...、X nは} 、によって定義され、X。
         
         マウスは、通常（ すなわち 、鼻に向かって）前進します。百数フレームのセクションでは、ヘッド/テール検出において非常に高い信頼性が常にあります。
         注：ソフトウェアが自動的にマウスが移動している終了検出のどちらの方に決定します。この最後は鼻と識別され、映画の中の赤い丸でマークされています。検出されたノーズは、すべてのフレームで赤い丸でマークされている場合、ユーザは、検出の品質を確認することができます。
3. 次のようにセッションIIIでは、継続：
   1. 白画素の二大成分を検出。
      1. 両方は、AM用の許容可能なサイズである場合ウーズと重力のそれらの中心（COGS）は、前フレームのマウスCOGSと互換性があり、これらの2成分2匹のマウスを検討してください。
      2. 彼らは、以前のフレームから20％以上変化し、その差は、マウスがフレーム間の時間で走行可能な距離よりも大きくない場合には互換性があると2つの連続するフレームのコグを考慮していない場合は、許容可能なマウスの大きさを考慮して（この距離は、以下のいくつかの個々のマウスの動きを解析することにより、実験系の調製物の一部として決定することができる最大のマウス速度から（I及びIIのセッションのように）。
         注：二大成分はマウス用の許容できない大きさであり、または歯が前のフレームのものとあまりに異なる場合、二大成分が許容可能な大きさになるまで、ソフトウェアは自動的に2値化閾値を増加させ、それらの歯はと互換性があります前のフレームのもの。
   2. で試験マウスをクリックしてください最初のフレーム。セッションIIIのすべてのフレームにテストと刺激マウスの両方を識別するために、2.3.1に分析を使用してください。
   3. 1マウスは社会的に他に近づくセッションIII内のフレームを識別します。注：このソフトウェアは自動的に（私たちは2センチメートルを使用）マウスとの間の距離は、マウスの典型的な相互作用距離未満であることを確認することで、この手順を実装しています。
   4. ソフトウェアは、ユーザに検出アプローチで映画の短いセグメントを再生すると、このアプローチは、試験マウス、またはどちらによって試験マウス、社会的回避の社会的なアプローチとしての資格かどうかを示すために、ボタンをクリックします。
      注：試験マウスであるマウスが知られている場合はステップ2.3.4自動化することができます。マウスは、お互いに近づきすぎる（または互いの上に登る）する際に、この情報は失われますので、我々はまだ私達のソフトウェアによって確実に検出ANDんすることができますようにマウスを標識する方法を発見していないので、彼らの行動に影響を与えていない、我々はに戻ってきました今の手動分類。
4. 読み込み]ボタンを使用して処理映画、ロードムービーを評価します。
   1. セッション1の最初のフレームを表示するには、[スタートセッション1をクリックします（またはセッション2の最初のフレームを表示するには、セッション2を起動します）。
   2. ムービーを再生し、停止するには再生/停止をクリックします。
      注：処理された映画は、異なる色の丸の付いた頭と尾でマウスが表示されます。すべての社交性対策は、画面上に表示され、ムービーの再生時に更新されます。
   3. 「エクスポート」をクリックして、Excel形式でエクスポート社交性は、データ。
   4. 単一のExcelファイルにフォルダ内のすべての映画のすべてのデータをコンパイルするために、「コンパイルデータ」をクリックします。

結果

図3は、空のケージでの行動映画の色のフレームを示しています。マウスはまだケージの中に導入されていません。 （社会的および非社会的）カップ、および区画の境界の位置が重畳されています。 図4に示され、参照フレームとして使用される空のケージのカラーフレームは8ビットグレースケールに変換されます。参照フレームがキャプチャ動画のすべての他のフレームから減算されます。

図5は、重畳された区画の境界とカップ位置で再度、セッションI中の映画からのフレームのうちの1つを示しています。参照フレームが差分フレームと呼ばれる、サンプル・フレームと結果から減算され、 図6に示されています。

図7は、差分フレームの二値化されたバージョンです。 （セクション2.1.3.3を参照）。図はまた、鼻（赤い円）の位置とTaのベースを示していますイル（灰色の円...

ディスカッション

ビデオテープに録画したマウスと自動映画の分析を組み合わせることで、私たちは手頃な価格、信頼性の高いハイスループットスクリーニング技術を作成しました。

自動分析の精度は100以上の映画の手動分析の結果と比較しました。フレームのフレームの圧倒的多数（> 99％）で、マウスの鼻は、良好な精度で識別されます。映画の約80％が何らかの修正を必要としないように（数）誤検出のほとんどは、社交性対策には影響しません。

誤検出が含まれていませんそれらの映画では、これまでで最も一般的な問題は、頭と尾は混乱しているということですので、我々は、ソフトウェアでは、動画のセグメントに頭と尾を切り替えるための簡単​​な方法が含まれています。ムービーをチェックし、すべての誤検出を修正するために見ている場合でも、評価時間が非常に短いままであるように、このチェックは、約3倍のリアルタイム速度で行うことができます。映画のセクションここでマウスは、シリンダの1に近くない場合であっても、より高速に表示することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プレキシガラスのおり	Norvaのプラスチック、ノーフォーク、VA	の注文は	原稿に記載されている次元そしてレイアウトを、 needs. イメージ処理を促進するためにのための非反射プレキシガラスを使用する
ワイヤーカップ	キッチンプラス	315	刺激のマウス、1つの空の
ビデオカメラ		ソニーHDR-PJ790	を収容するために1つを使用します任意のカメラで交換できます 同等の仕様
OpenCV (画像処理ライブラリ)	Willow Garage	N/A	最新の画像処理ライブラリ を使用できます。