蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

Summary

ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ^1を記述する。

Abstract

ゼブラフィッシュ胚は、器官形成を研究し、人間の遺伝病をモデル化するための扱いやすいモデルを提供しています。その相対的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュ腎臓が開発し、人間とほぼ同じように機能します。ヒト腎臓の建設に大きな違いは、唯一の2があるゼブラフィッシュに比べネフロンの数百万の存在である。しかし、基本的な機能単位にそのような複雑なシステムを簡素化することは、腎臓が開発し、どのように動作するかの理解を助けている。ゼブラフィッシュでは、正中線に位置する糸球体は、排出腔で互いに融合する前に、胚軸上下左右対称に実行するように分岐する2前腎細管への最初の血液濾過を担当しています。前腎 ​​細管は重く最終的に排出腔^2-4を経由して、終了する前に、各種の溶質の交換を可能にする、セグメント化された尿細管に沿って、ろ液の移動を容易に運動性の繊毛が移入されている。 CKD株式会社の責任多くの遺伝子繊毛形成に関連するものをluding、ゼブラフィッシュ⁵に研究されている。しかし、主要なドローバック、遺伝子操作した後にゼブラフィッシュ腎機能を評価するのが困難となっている。ヒトで腎機能障害を測定するための伝統的なアッセイは、主に彼らの水生環境と小型サイズのため、ゼブラフィッシュに非翻訳を証明している。例えば、胚から血液を抽出するために、物理的に不可能であり、それらが小さすぎるように、尿素およびクレアチニン含有量の分析のために魚を上演した。また、ゼブラフィッシュは、多くの場合、最初の患者の検査中に実施されるシンプルな蛋白尿「ディップスティック」、上のテストのための十分な尿を生成しない。我々は、腎機能^1,6-9からの読み出しを与えるように、血管系から出腎臓を介して、経時的に、定量的蛍光色素のクリアランスを監視するためにゼブラフィッシュの光透過性を利用した蛍光アッセイを記載する。

Introduction

ヒト腎臓は、血液からの代謝老廃物を濾過し、細胞の恒常性を維持するために必要な溶質を回収することに重要な役割を果たしている。腎機能障害の原因となるヒトの遺伝疾患がいくつかあります。最も一般的な遺伝性腎疾患は腎炎尿細管内の流体満たされた嚢の開発によって特徴付けられる常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）です。嚢胞形成に起因する損傷は、腎臓機能¹⁰にとって有害である。 1,000 8占める-末期腎不全^（ESRF）11の患者の10％：800から1：ADPKD 1の発生がある。いくつかの遺伝子は約85％と、それぞれ^12,13症例の15％を占め、ポリシスチン1（PKD1）および-2（PKD2）を含む、ADPKDを引き起こすことが関係している。さらに、遺伝子PKD1のための製品と-2は、繊毛に局在し、繊毛形成^14,15の基本である。として知られているヒトの遺伝性疾患の認識の家族は、用意されました繊毛の機能に影響を与え、CKD ¹⁶もたらすciliopathies。

毛様体の発達と機能に影響を与える人間の遺伝性疾患の増加数は、このかつて考えられて残留細胞小器官におけるグローバル関心を集めている。繊毛、毛様細胞性突起は、重要な細胞シグナル伝達事象の伝達に必要な受容体及びイオンチャンネルに濃縮される。繊毛は、一般的に、または一重微小管の中央ペアなしで9放射状に配置された微小管のダブレット....

Protocol

倫理声明：動物のメンテナンス、畜産、および手続きは動物によって定義され、制御されている（科学的処置）法1986年のすべての動物実験は、生物学的に適合して内務大臣（PIL号7892分の70）によって与えられたライセンスの下で実施されましたサービス管理グループと生物サービス倫理委員会、SGUL、ロンドン、英国。すべての努力は、使用される動物の数を減少させ、苦痛を最小にし、福祉を向上させるために、手順および飼育の両方を洗練するために行われた。

楽器、麻酔剤、蛍光色素の調製

1. （フィラメントなしで）マイクロピペットプラーとホウケイ標準壁毛細血管を使用して、マイクロインジェクション（ 図1A）のための適切な長さの針を引っ張る。
2. 心膜（ 図1B）への容易な注射のための胚の向きのためにアガロースの金型を作成します。のり約10ガラス顕微鏡SL一緒のIDEオフセットスライドの「階段」を形成する。最良の結果を得るには、各スライドの中央に急速なセットエポキシ樹脂接着剤のドロップを使用。
3. ブンゼンバーナー加熱されたメスを用いてプラスチック製のピペット2 10ミリリットルを通じて長さを半で約78ミリメートルのセクションを切り取り、ピペットは、必要に応じて終了し削除します。金型90のペトリ皿中に浸漬することを可能にするために安定性を提供するために、積み重ねられたガラススライドにピペッ....

Results

全世界で16万人^16：バルデ-ビードル症候群（BBS）は約1に影響を与える稀な異質ciliopathyです。多嚢胞腎臓を含む関連する問題の数が存在する患者は、その後の患者は頻繁に腎臓透析や移植が^24を必要とする。 ESRFはCKD ^16を開発^した患者の約30％で、BBSの死亡の最も一般的な原因である。現在、20の非関連遺伝子が公表遺伝子型 - 表現型関連でBBSに関与している。 BBSタンパク質は、患者の特性特性とともに、ciliopathy診断を推測、繊毛と基底ボディ内の共通タンパク質局在化ドメインを共有しています。 BBS9が一緒に他のBBS（BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8）タンパク質とParathyoidホルモン応答B1（PTHB1）タンパク質をコードするコアは一次繊毛²⁴の形成に関与する複雑なBBSome形成する。 BBS cの6％のためのBBS9アカウントの変異のAS ^24。また、PTHはゼブラフィッシュにおけるbbs9機能の喪失は、.......

Discussion

ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病をモデル化するための貴重なツールを提供し、in vivoでの研究のための科学的な楽器としてのそれらの使用は、腎臓を含む多くの生物学的システムの遺伝内訳の詳細な研究を可能にしてきた。多くは今ゼブラフィッシュ腎臓の発達や機能方法について理解されている。病気の原因遺伝子と人間の腎形成と相同性に印象的な類似点^21は、ゼブラフィッシュは、腎疾患の病理に遺伝子機能のリードでどのような欠陥を理解する上で基本となっているかを解説しました。確かに、遺伝子操作が楽に、アンチセンスモルホリノノックダウン技術や、TALENSまたはCRISPRなど、より高度な目標とゲノム編集ツールを使用して、ゼブラフィッシュで達成することができる。疑われる腎疾患の原因遺伝子についてのノックダウンまたは変異体のモデルを作成すると、疾患発現への関与を理解する上で最初のステップです。これを行うには、腎機能の信頼できるアッセイが求められている候補遺伝子は、おそらく患者において観察病理の原因であるかどうかを示す。

腎機能検査は一般的に血液や尿中に存在する溶質のレ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER フレーミング/ブラウンタイプマイクロピペットプーラー	Intracel	P-97
ホウケイ酸標準壁毛細血管	ハーバード装置	30-0017
ガラス顕微鏡スライド	VWR International	631-0109
エポキシ樹脂接着剤	Evo-Stik
ローダミンB 10,000 MW ラベル付きデキストラン	ライフテクノロジー	D-1824
N-フェニルチオ尿素	シグマ・アルドリッチ	P7629
メチレンブルー	Sigma-Aldrich	M9140
エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩	Sigma-Aldrich	A5040
メチルセルロース	Sigma-Aldrich	M0512
エアコンプレッサ	ジュンエア	OF302-15
ピコスプリッツァーIII.	パーカー・インスツルメンツ	051-0500-900
小型3軸制御マイクロマニピュレーター	マルツハウ	ザーMM33
解剖実体顕微鏡	ニコン	SMZ1000
マイクロローダーチップ	エッペンドルフ	5242956003
デュモン #5 鉗子	Sigma-Aldrich	F6521
ステージマイクロメータ	パイザー- SGI	02A00404