水域のためのユスリカ（双翅目）簡易生物調査プロトコルとして表面フローティング蛹脱皮殻の使用

サマリー

水質の監視と評価には、底生大型無脊椎動物を使用した迅速なバイオアセスメントプロトコルがよく使われます。効率的なプロトコルには、ユスリカ科の表面浮遊蛹exuviae(SFPE)の収集が含まれます。ここでは、フィールド収集、実験室での処理、スライドの取り付け、およびユスリカ科SFPEの同定の技術について説明します。

要約

底生大型無脊椎動物の集合体を使用して、簡易生物調査プロトコルが正常に水質に人間の影響を評価するために使用されています。残念ながら、そのようなディップネットなどの伝統的な底生幼虫のサンプリング方法は、時間がかかり、高価です。代替プロトコルは、ユスリカ表面フローティング蛹脱皮殻（SFPE）のコレクションを含みます。ユスリカは、未成熟の段階、通常、水生生息地で発生するハエ（双翅目）の種が豊富なファミリーです。大人ユスリカは、水から出てくる水の表面に浮い、彼らの蛹皮、または脱皮殻を残します。脱皮殻は、多くの場合、銀行に沿って、または、彼らはユスリカの多様性と豊かさを評価するために収集することができ、風や水流の作用によって、障害物の後ろに蓄積します。一部の種は他のものより汚染に対してより耐性があるので、ユスリカは、重要な生物学的指標として使用することができます。そのため、収集されたSFPEの相対量と種組成に反映します水質の変化。ここでは、フィールドコレクション、実験室処理、スライドマウントおよびユスリカSFPEの識別に関連する方法が詳細に記載されています。 SFPE方法の利点は、サンプリング領域、効率的かつ経済的なサンプル収集と研究室の処理、識別を容易に、ほぼすべての水生環境での適用性、および生態系のストレスの潜在的に、より高感度の尺度で最小の乱れがあります。この制限は、成人男性に関連付けられていない場合は種に蛹脱皮殻を識別するために、幼虫の生息の使用とできないことを決定することができないことがあります。

概要

環境の健康を評価するための生物を使用し生物学的モニタリングプログラムは、多くの場合、水の品質を評価または生態系復元プログラムの成功を監視するために使用されます。底生大型無脊椎動物の集合体を使用して、簡易生物調査プロトコル（RBP）は1989年¹ので、状態の水資源機関の間で人気となっている。このようなディップネット、Surberサンプラー、およびヘスサンプラ²としてRBPsために底生大型無脊椎動物をサンプリングする従来の方法、タイムすることができます高価な、消費、および、特定のマイクロハビタット³から集合体を測定することができます。特に水の体の生体情報を生成するための効率的な、代替RBPはユスリカ表面フローティング蛹脱皮殻^（SFPE）3のコレクションを含みます。

ユスリカ（昆虫：双翅目）、一般的に非痛烈ユスリカとして知られているが、一般的に大人として浮上する前に、水生環境で発生する完全変態のハエです 60;水の表面に。ユスリカファミリは、世界中に説明約5,000種と、種が豊富です。しかし、20,000人の種が^4存在すると推定されます。ユスリカは、高い多様性と可変汚染許容レベル⁵の多くの水生生態系に水と生息環境の質を文書化するのに有用です。さらに、それらは一般的に、コミュニティ^5,6で種の50％以上を占め、多くの場合、水系で最も豊富かつ広範底生大型無脊椎動物です。地上大人の出現に続いて、蛹脱皮殻（蛹皮膚をキャスト）は、水の表面に浮いたまま（ 図1）。蛹脱皮殻は、風や水流の作用を介して、銀行に沿って、または障害物の後ろに蓄積し、容易かつ迅速に前の24〜48時間の⁷時に登場したユスリカ種の総合的なサンプルを与えるために収集することができます。

ntent ">相対存在し、収集SFPEの分類学的組成物は他の人が⁵非常に敏感でありながら、いくつかの種は、非常に汚染寛容であることを考慮して、水質を反映SFPE法を含む従来の幼虫ユスリカサンプリング技術よりも多くの利点があります：（1）最小限の（2）サンプルは、生物を収集することに焦点を当てるのではなく、非生物肌なので、社会動態の軌跡には影響しませんしません;属〜（3）の識別、およびもしあれば、生息地の乱れがサンプリング領域で発生します多くの場合、種は、適切なキーおよび説明³与えられた比較的容易である;（4）の収集、処理、およびサンプルの識別は、従来のサンプリング方法^3,8,9と比較して、効率的かつ経済的である;（5）累積脱皮殻から発信された分類群を表します微細環境¹⁰の広い範囲が、（6）の方法は、小川や河川、河口、LAK含め、ほぼすべての水生環境でも適用可能ですES、池、岩のプール、および湿地;彼らはすべての未成熟の段階を完了し、正常成人¹¹として浮上している個人を表すので、（7）SFPEは多分生態系の健全性のより敏感な指標です。

SFPE方法はユスリカのコミュニティについての情報を収集するための新しいアプローチではありません。 SFPEの使用は、最初の1900年代初頭にティーネマン¹²によって示唆されました。様々な研究は、分類学上の調査（ 例えば^{、13〜15）、}生物多様性と生態系の研究（ 例えば ^{7,16-19）、}および生物学的評価（ 例えば^{、20〜22）}のためにSFPEを使用しています。さらに、いくつかの研究は、サンプルデザイン、サンプルサイズ、及び種または属の様々な検出レベルを達成するために必要なサンプルのイベント（ 例えば^、8,9,23）の数のさまざまな側面に対処しています。これらの研究は、種または属の比較的高い割合が緩やかefforで検出できることを示していますサンプル処理に関連したTまたは費用。例えば、アンダーソンとFerrington ^8は 100カウントのサブサンプルに基づいて^、1/3以下の時間がサンプルネットを浸漬するために比較SFPEサンプルを選択するために必要と判断しました。別の研究では、3-4 SFPEサンプルがソートされ、すべてのディップネットサンプルについてと種の豊富は^、3の増加としてSFPEサンプルが検出種でディップネットのサンプルよりも効率的であったことが確認できたと判断しました。 SFPEサンプルは97.8％で、効率的な³であった例えば、15〜16種の種の豊かさの値を持つサイトで、平均ディップ正味効率は、45.7パーセントでした。

重要なことに、SFPE方法は生態学的評価のために、欧州連合^24（ユスリカ蛹の脱皮殻法（CPET）として知られている）と北米²⁵で標準化されているが、この方法は、詳細に記載されていません。 SFPE方法論の一つの用途は、 ら Ferrington、によって記述されました。 3アップ。しかし、その研究の主な焦点は、SFPE方法の効率性、有効性、および経済性を評価することでした。この作業の目的は、サンプル収集、研究室処理、スライドマウントおよび属の識別を含む、詳細にSFPE方法のすべてのステップを記述することです。対象読者は、彼らの研​​究に伝統的な水質モニタリングの取り組みを拡大するに興味大学院生、研究者、専門家が含まれています。

プロトコル

フィールドコレクション用品の調製

1. 研究デザインに基づいて収集し、各サンプルの1サンプル瓶（ 例えば、60ミリリットル）を取得する必要がありますSFPEサンプルの数を決定します。
2. 各サンプルジャーのための2つの日付と局所性のラベルを準備します。内側に1を配置し、瓶の外側に他を貼付。国、州、郡、市、水本体、GPS座標、日付、人の名前（複数可）のサンプルを収集：各日付および局所ラベルは、以下の情報が含まれていることを確認。
3. 他の具体的な資機材を（特定の材料/機器の表を参照）収集します。

2.フィールドコレクション

1. 片手に幼虫トレイとその他でふるいを保持します。 SFPEが蓄積水に幼虫トレイを浸し（ 例えば、フォームの蓄積、思わぬ障害、緊急植生、バック破片、渦、銀行縁に沿って）（ 図2A）は 、ワットを許可しますえー、脱皮殻、および破片幼虫トレイを入力して、ふるいを通して、この材料を注ぎます。流水のシステムでのサンプリングは、サンプル範囲の下流端から始まり、（ 図2B）を上流作業する場合。静水システムでサンプリングした場合は、風下の海岸線から始まります。
   1. 各事前定義されたサンプルリーチ（一般的に100〜200のストリームから採取したサンプルのためのMが、水生監視サイトの全体の面積に依存する）内に10分間（又はそうでなければ特定のサンプリング政権に対して定義された）を繰り返し、ステップ2.1。適宜SFPE蓄積領域間を移動。
2. サンプルサイトからの水で満たされた噴出ボトルを使用して、ふるいの一つの領域にゴミを濃縮し、慎重に鉗子の援助と噴霧ボトルからのエタノールの流れで前標識されたサンプル瓶にSFPEサンプルを転送します。エタノールでサンプル瓶を埋めます。
3. 繰り返しは、すべてのサンプルについて2.1 2.2を繰り返します。

3.サンプル·ピッキング

注：このプロトコルの残りは300 SFPEのサブサンプルに関係し、他のサブサンプルのサイズに変更する必要があるかもしれません。勉強-具体的な目標とリソースを満たすためにSFPE方法を調整するためブシャールとFerringtonの⁹サブサンプリングとサンプリング周波数のガイドラインを参照してください。

1. 各SFPEサンプルの1ドラムバイアルを割り当てます。各バイアルの内側に配置し、エタノールで完全バイアルを¾記入する日付と局所ラベルを準備します。
2. 対応するサンプル瓶から蓋を外し、添付の蛹脱皮殻をチェック。静かエタノールを充填した噴出ボトルを使用して、ペトリ皿に蓋オフ内容をすすぎます。探して、ピンセットを使用してサンプル瓶の内側からラベルを削除し、優しくペトリ皿の上にラベルから内​​容をすすぎます。脇のラベルを設定します。
3. 何SFPEは、サンプル瓶に残ってないことを確認するためにエタノールですすぎ、幼虫トレイにサンプル瓶の内容を転送します。蛹脱皮殻の一部を転送し、RESIペトリ皿のトレイから起因し、エタノール。サンプルをエタノールに覆われていることを確認してください。
4. 実体顕微鏡下でペトリ皿を置きます。体系蛹脱皮殻のためのペトリ皿の内容をスキャンします。ピンセットを用いて皿からすべての蛹脱皮殻を選択し、バイアル中に配置します。壊れている標本を選択しないで、乾燥させ、以降の識別の問題を回避するために圧縮（ すなわち、頭胸部と腹部の少なくとも半分を持っていません）。
   注：いくつかのケースでは、属レベルの同定は、部分標本で可能かもしれませんが種を同定は、多くの場合、試料全体が存在することが必要です。
   1. 渦巻き皿と最初に検出されていない可能性があります皿の側面に貼り付けることができ、そのいずれかを含む追加の蛹脱皮殻、ならびに、任意の小さな半透明の試料をスキャンします。二つの連続スキャンが追加の蛹脱皮殻を明らかにしなくなるまで繰り返します。
5. 繰り返しは、手順3.3と全部または300蛹脱皮殻まで3.4を拾ってきました。 300蛹脱皮殻を取り上げてきたとき、幼虫のトレイにペトリ皿から残渣を返し、エタノールでペトリ皿をすすぎます。そして、空のサンプル瓶に幼虫トレイから残留物を転送した日付と局所性のラベルを追加し、瓶の蓋を置きます。保持またはプロジェクト固有のプロトコルに応じて、残留​​物を処分します。

4.サンプルソート

1. すべてがちょうど標本をカバーするのに十分なエタノールで満たされたペトリ皿に標識されたバイアルから蛹脱皮殻を選んだ注ぎます。
2. 実体顕微鏡下で、独立した試験片の異なる形態学的基（ すなわち、morphotaxa）に、別々に標識されたバイアルに各morphotaxonを置くには、エタノールで完全^番目の 3/4を満たしました。
   1. ユスリカmorphotaxaを分離するために、外部形態的特徴を利用しています。例えば、頭胸部から、存在、大きさ、形状の違いを使用し、かつ頭結節、正面いぼ、正面毛、および胸部ホーンの着色。腹部から、morphotaxa分離（ 図4A）のための肛門ローブに加えて、棘、hookrows、シャグリーン、毛、および腹部のセグメントのスプリアスを使用します。追加の説明および形態学的特徴の数値のFerrington ら ^{5、Sæther26、}ピンダーとReissの^27を参照してください。
   2. 試験片を乾燥し始める場合は、追加のエタノールを使用してください。

取り付け5.スライド

1. 95％エタノールで各morphotaxonためのマルチウェルプレートの1つのウェルを埋めます。
   1. プレートの個々のウェルに取り付けられたスライドであることを各morphotaxonの複数の表現（ 例えば、全体の25％）を配置します。標本が十分に脱水するために、少なくとも10分間、十分に座ってできるようにします。
2. 適切なサイト、コレクション、および識別informatiとラベルスライド（ 図3）に。
3. 実体顕微鏡のスライドを置きます。
   注：ステージにテープで貼り付けたスライドのテンプレートは、一貫性のある配置のために有用です。
4. スライド上のEuparalの低下を置き、それはカバースリップのサイズを近似するようEuparalを広げます。 Euparalで作業する場合、適切な換気を使用してください。
   注：Euparalで作業する場合、適切な換気を使用してください。
5. ピンセットを用いてEuparalに最初morphotaxonからの代表を埋め込みます。
   注：試料から過剰のエタノールを無効にするには、ピンセットを用いて、穏やかに研究室に検体をタップ前Euparalでそれを埋め込むに拭き取ります。
6. 先の細いピンセットおよび/ ​​または解剖プローブ（ 図4A）を用いて、腹部から頭胸部を分離します。
   1. ecdysial縫合糸（ 図4B）に沿って頭胸部を分割し、縫合糸の端が反対側（ 図4C）にあるように、頭胸部を開きます。
   2. オリエントCephalothorax腹側（ 図4C）が上を向いているように。
   3. 腹部背側を配置し、すぐに頭胸部（ 図4C）の下に配置します。
7. 試料上のカバーガラスを配置します。一方のエッジがスライドに触れると、角度でカバーガラスを保持し、その後徐々に低くし、気泡の形成を減少させるためにカバースリップをドロップします。試料を平らにカバースリップ上で軽く押し。
8. 繰り返して、すべての脱水の試料のために5.7を介して5.3を繰り返します。

6.属の識別

1. 複合顕微鏡を用いてスライドに取り付けられた試験片の属を決定します。 ら 、Wiederholm 28とFerringtonでキーと診断を使用して属に検体を特定します^。5。必要に応じて、 ら 、Ferringtonを使用して家族レベルの識別を確認する^。5。注：Wiederholm ²⁸とFerringtonので、多数の一般的な説明と改訂が行われています、ら ^5は 、したがって、これらのキーと診断は不完全であり、主要な文献で ​​補充する必要があります。

結果

図1は、ユスリカのライフサイクルを示す図です。未成熟の段階（卵、幼虫、さなぎ）は、典型的に起こり、または密接に水生環境に関連します。幼虫ライフステージが完了すると、幼虫は、チューブ状のシェルターを構築し、周囲の基板にシルクの分泌物で自身を添付して蛹化が発生します。開発大人が成熟した後、蛹は、自分自身を解放し、大人が蛹脱皮殻から出てくることができ、水の表面に泳ぎます。脱皮殻は、空気で満たされ、細菌はワックス層を分解し始めるまで、キューティクルの外側の蝋質層によって、それが水面に浮いたままです。

図2（a）に示すような河岸植生や倒木が水面に接触する場所として蓄積の分野、に蛹脱皮殻浮動水流や風濃厚。幼虫トレイ篩は蛹とを収集するために使用することができこれらの天然の蓄積領域から図2（b）に示すように、微細環境の広いスペクトルからユスリカの出現を評価し、＃160。特定の用途のためには、比較は、所与のサンプル部位でのいくつかのサンプルサイト間または経時的にすることができるように、一貫性のあ...

ディスカッション

成功SFPEサンプル採取、スライドを取り付け、ピッキング並べ替え、および識別のための最も重要なステップは次のとおりです。（1）フィールドコレクション（ 図2A）の間、研究領域内の高SFPEの蓄積領域の位置を特定します。 （2）ゆっくりとサンプル中のすべてのピッキングSFPEの検出のためのペトリ皿の内容をスキャンします。 （3）（ 図4A）を取り付け、スライド中腹部から頭胸部を切開するために必要な手先の器用さを開発します。と（4）が正しく属に識別するための脱皮殻ユスリカ蛹のキー形態学的特徴を認識します。

高SFPE蓄積（ 図2A）の領域を検出することに成功しSFPEサンプル採取の中で最も重要なステップです。蛹脱皮殻は、水生植物やボートランプのような人間の構造に巻き込まれ、波はオフショア^{「windrows」30}に材料を浮遊集中することができます。水の大きな体のために、蓄積の自然地域の同定は、風のパターンに基づいて、調査地の位置を特定するか、蛹脱皮殻が集結しているア...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	S25309B	70-95%
プラスチック洗浄ボトル	フィッシャーサイエンティフィック	0340923B
サンプルジャー	フィッシャーサイエンティフィック	0333510B	ガラスまたはプラスチック、60mL推奨
試験用ふるい	アドバンテック	120SS12F	125ミクロンメッシュサイズ
幼虫トレイ	バイオクイップ	5524	ホワイト
ステレオ顕微鏡
ガラスシェルバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	0333926B	1ドラムサイズ
プラスチックスポイト	サーモサイエンティフィック	1371110	30〜35滴/mL
ファインフォーセプス	バイオクイップ	4524	#5
ペトリ皿	カロライナ	741158	ガラスまたはプラスチック
マルチウェルプレート	サーモサイエンティフィック	144530	ガラスまたはプラスチック
ガラスマイクロスライド	サーモ科学	3010002	3 x 1 インチ
ガラスカバースリップ	Thermo Scientific	12-519-21G	円形または正方形
のユーパラル封入剤	BioQuip	6372B
ピグマペン	BioQuip	1154F	ブラック
プローブ	BioQuip	4751
Kimwipes	キンバリークラークプロフェッショナル&貿易;	34120