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方法論記事

神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

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DOI:

10.3791/52566

⸱

2015年4月27日

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

この記事について

サマリー

このプロトコルは、金ナノロッドの光吸収に伴う一時的な加熱を使用して、ニューロン細胞の分化と細胞内カルシウム活性を刺激する方法を概説しています。これらの結果は、神経補綴物や神経科学の基礎研究における新たな応用の可能性を秘

めています。

要約

最近の研究では、神経組織内の水による赤外線の吸収に伴う一時的な加熱によって、神経がさまざまな方法で刺激されることが示されています。この技術は、刺激の局在化の増加および組織との機械的接触の最小化の可能性があるため、標準的な刺激技術を置き換えたり補完したりする大きな可能性を秘めています。しかし、可視光線が組織の深部まで浸透できないため、光学的アプローチは制限されています。さらに、熱モデリングは、複数の刺激サイトまたは高いレーザー繰り返し率を使用すると、累積的な加熱効果が潜在的に危険である可能性があることを示唆しています。以下に概説するプロトコルは、ニューロン細胞の赤外線刺激に対する強化されたアプローチを説明しています。その根底にあるメカニズムは、金ナノロッドの光吸収に伴う一時的な加熱に基づいており、ニューロン細胞の分化の引き金となり、細胞内カルシウム活性のレベルが上昇する可能性があります。これらの結果は、ナノ粒子吸収体が、水の吸収に基づく赤外線神経刺激のプロセスを強化および/または置き換えることができることを示しており、将来的には神経プロテーゼや細胞治療への応用の可能性を秘めています。

概要

最近の研究では、水（> 1400 nmの波長）で赤外光の吸収に関連する過渡的な加熱が神経組織1及び2心筋細胞の細胞内カルシウムトランジェントに活動電位を誘導するために使用され得ることを実証した。赤外光の使用は、潜在的な細かい空間分解能、組織と直接接触の欠如、刺激アーチファクトの最小化、および必要性の除去に遺伝的に、神経補綴物における用途のために大きな関心を調達している刺激前に細胞を修正する（光遺伝学で必要に応じて）1。これらの利点の全てにもかかわらず、最近開発されたサーマルモデルは、標的組織/細胞は、複数の刺激部位および/ ​​または高繰返し率は3,4使用されている累積的加熱効果によって影響を受ける可能性があることを示唆した。

これらの課題に対応するため、研究者らは、外因absorを使用する可能性を認識している神経刺激のための繊維が組織内のより局所的な加熱効果を生成する。 Huang らは、遠隔高周波磁場5をHEK 293細胞中で温度感受性TRPV1チャネルを活性化するために、超常磁性フェライトナノ粒子を使用してこの原理を実証した。この技術は、より深い浸透（磁場が組織と比較的弱く対話）を可能にすることができるが、応答は、ほんの数秒の周期ではなく、バイオニックデバイス5に必要なミリ秒の期間にわたって記録した。同様に、ファラらは、インビトロにおいて黒色微粒子ラット皮質ニューロンの電気刺激を実証した。これらは、潜在的により速い反復率6を可能μJの範囲でμsでエネルギーの数百のオーダーのパルス持続時間を使用して刺激における細胞レベルの精度を示した。

外因性の吸収剤の使用はまた、誘導するために適用されているin vitroでの形態学的変化。 Ciofani らは、超音波7により励起された圧電窒化ホウ素ナノチューブを用いた神経細胞の伸長で約40％の増加を示した。同様に、PC12細胞におけるエンドサイトーシスされた酸化鉄ナノ粒子は、鉄酸化物8の細胞接着分子の活性化を、用量依存的に神経分化を促進することが報告されている。

最近では、神経刺激を支援するための外因性吸収材への関心も、金ナノ粒子（金NPS）を使用することに焦点を当ててきた。 AuのNPは、効率的に、プラズモンピークのレーザ光 ​​を吸収すると熱9の形で周囲の環境へと放散する能力を有する。 10 -利用可能な粒子形状のすべての中で、金ナノロッド（金のNR）の光吸収が便利に（NIR、750-1,400の間の波長近赤外線）生体組織の治療の窓に一致する。また、続きで神経刺激のextは、金のNRの使用は比較的良好な生体適合性と表面機能オプション11の広い範囲を提供します。最近の研究は、分化刺激効果は、NG108-15神経細胞12中のAuのNRの連続レーザ曝露後に誘導できることを示した。同様に、細胞内カルシウムトランジェントは、可変周波数およびパルスで変調されたレーザ照射13を長後のAuのNRで培養した神経細胞で記録した。細胞膜の脱分極はまた、らせん神経節ニューロン14の初代培養中のAuのNRの近赤外レーザー照射後に記録した。照射された金のNRとのin vivoでのアプリケーションの最初のは、つい最近実証されている。オムらは彼らのプラズモンピーク時金のNRを露出し、複合神経活動電位（CNAPS）の振幅の6倍に増加し、ラットの坐骨神経における刺激閾値で3倍の減少を記録した。 ENhanced応答はNRプラズモンピーク15の励起に起因する局所的な加熱効果に起因するものであった。

本論文では、金のNRを用いて培養しNG108-15神経細胞におけるレーザー刺激の効果を調査するためのプロトコルが指定されている。これらのメソッドは、標準的な生物学的技術および材料を用いてインビトロで細胞集団を照射する、シンプルでありながら強力な方法を提供します。プロトコルは、安全な操作で再現性のアライメントを可能にするファイバ結合レーザダイオード（LD）に基づいている。 AuのNRサンプル調製およびレーザー照射方法は、さらに、特定の合成および培養プロトコールはそれぞれ、よく知られている場合に、異なる粒子形状および神経細胞培養物に拡張することができる。

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プロトコル

1.金のNRの準備

注：金のNRはレシピ16の数によって合成、または商業ベンダーから購入することができます。

  1. UV-Vis分光法を介して、0.5ナノメートルの解像度で300から1000nmまでの吸収値を記録することによって、金NR溶液の初期光学密度（OD）を測定する。利用可能なキュベットで使用される溶液の体積を変化させる。
  2. 適切な技術17（ 例えば、UV-Vis分光法、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析法、透過型電子顕微鏡）による最初のNPモル濃度を評価するか、ベンダーによって提供される濃度値を使用する。
  3. 最良の再現性についてはOD = 1に到達するために、初期のAu NRサンプルを希釈する5 mlのストック溶液を調製し、試験した試料のすべてについてODを一定に保つ。希釈溶媒の組成のための商業ベンダーのプロトコルに従ってください。よくわからなければ、脱イオン水を使用しています。
  4. 二回15分間のAu NR溶液1mlを7800×gで遠心分離した溶液からの任意の化学的過剰を除去する。遠心分離サイクルは、力と時間（ 例えば 20分で5600×g）が18に変化することができる。
  5. 上清を除去し、脱イオン水でのNRを再懸濁。再懸濁粒子が溶液中で凝集体を形成するかもしれないので、最良の結果を持っているために毎日それらを準備。また、1週間以上、もはや用の冷蔵庫で保管してください。凍結しないでください。
  6. 細胞培養条件下で使用する前に、5分間のAu NR液を超音波処理した後、（UV照射強度以上400mWのがmに∙-2 254nmで）30分間、UV光で滅菌する。

2. NG108-15神経細胞ラインの文化と分化

  1. 細胞培養培地は、無菌のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlの10％（w / v）のウシ胎児血清（FCS）、L-グルタミン（w / vの）1％、1％の準備（w / v）のペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.5％（w / v）のアンホテリシンB
    注：サプリメントは、-20℃で保存し、等分し、必要な日に培地に添加することができる。細胞培養培地は、1ヶ月の最大のために無菌状態で冷蔵することができる。
  2. 細胞分化培地は、1％を含む滅菌DMEMを50mlを調製L-グルタミン、1％（w / v）のペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.5％（w / v）のアンホテリシンB（w / v）の
  3. （37℃、5％CO 2）で加湿雰囲気のインキュベーター中でポリスチレン製のT75フラスコに細胞培養培地10ml中NG108-15神経細胞を成長させる。通常は、3〜4日で準備ができて、各フラスコに1.5〜2×10 5細胞を播種。 2日毎に細胞培養培地を変える。
    注：遺伝的ドリフトまたは変動を防ぐために、実験のために通路21より古い細胞を使用しないでください。
  4. 培養液中の場合には70〜80％コンフルエント、暖かい新鮮な細胞培養培地に培地を変更します。機械的に優しく石油公社によって細胞を切り離す王コンフルエントのフラスコの底に。トリプシンを使用しないでください。
  5. 遠心分離機600×gで5分間、細胞懸濁液と温かい細胞分化培地2mlで再懸濁細胞ペレット。
  6. 種子細胞分化培地200μlで組織培養ポリスチレン96ウェルプレート中で2×10 4細胞/ cm 2。 5％CO 2/37℃で1日の実験をインキュベートする。
  7. 3.2×10 9の間で-4.2×1 0 10日2上のAu NR液の粒子/ mlを追加し、さらに24時間のためにそれをインキュベートする。対照実験用粒子を追加しないでください。
    注：別の対照として、高分化型のピーク吸収波長のAu NPは、比較目的の14のために使用することができる。より一貫性の細胞の挙動については、一定の細胞密度を維持し、細胞播種前のウェル表面を変更しないでください。

3.神経突起伸長強化

  1. カップルシングルモード光ファイバ（開口数= 0.13）を有するレーザとファイバコネクタ（FCコネクタが便利で一般に入手可能である）でそれを終了する。標準的な電力計で出力レーザパワーを測定する。最も効果的な結果を得るために、NRののプラズモン共鳴ピークのレーザーのピーク波長に一致する。
  2. NRのインキュベーション後の3日目に、ウェルにFCコネクタを修正。異なるレーザパワーのために、連続波で1分間RTでサンプルとコントロールを照射する。培養は、5％CO 2/37℃で3追加日間進行できるようにします。 3つの独立した測定値の最低レーザー照射を繰り返します。
    注：異なる照射時間とパルス周波数は、用途に応じて、選択することができる。
  3. （W∙cm -2で）ビーム径とレーザ放射の観点からレーザーを特徴付ける。
    1. 標準のシングルモードファイバの場合は、NA = N∙罪θを使用するnが使用されている媒体の屈折率であり、θは 、ファイバを出る光の円錐の半角である（ 図1Aを参照）。 rはビーム半径である三角法で、r =日焼けθ∙d及びdからの繊維とサンプルとの間の距離である。 FCコネクタは、したがって、距離dにおけるサンプル= 2.70±0.20ミリメートルを照らす、ウェルの直径と一致する。ライトは、r =日焼け（SIN-1（NA / n）を ）を与える、水に繊維を抜けた（n = 1.33）dは ∙。
    2. 後者の式を使用して、ターゲットにレーザービーム半径、対応するビーム面積と平均レーザー放射照度（ビーム面積で割ったレーザパワー）を計算する（ 図1Bの例のグラフを参照）。これらの値は、照射された領域での平均放射照度を表す。
    3. エラー伝播の一般理論と測定のためのエラーを評価します。
      注：距離between FCコネクタおよびサンプルは、適切なソフトウェア（ImageJの）を使用して、画像の実験装置と後処理の写真により測定することができる。
  4. 5日目に、実験から細胞分化培地を除去し、3.7％10分間（v / v）のホルムアルデヒド溶液で試料を固定し、その後0.1％20分間（v / v）のトリトンX-100で細胞を透過。
  5. 結合部位は、未反応のタンパク質をブロックするために60分間サンプルに3％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を加える。 4℃で（PBS中5μg/ mlのBSAの1％を補足した）抗βIIIチューブリン一晩のための試料にラベルを付けます。
  6. PBS中の1％BSAで0.4〜2μg/ mlの濃度を使用して（ 例えば、TRITC結合抗マウスIgG抗体）は、適切な二次抗体を用いて、暗所で90分間、細胞をインキュベートする。 10分間DAPI（0.1 / mlの中で脱イオン水）で細胞核にラベルを付けます。
    （注）抗体共役および濃度MIGhtは、会社のプロトコルに従って変化する。各染色段階後5分間二回PBSで洗浄サンプル。
    figure-protocol-1
  7. 少なくとも20×対物レンズを使用して落射蛍光または共焦点顕微鏡による画像サンプル。顕微鏡を選択して、二次抗体に応じてフィルタリングします。 DAPIフィルターを選択（λEX = 358 nmのを、λEMは 488 nmの=）を細胞核を可視化する。
  8. 評価することにより、画像を分析した：i）最大の神経突起の長さ（レコード細胞体の最初に神経突起の先端からの長さ）と、ii）神経細胞あたりの神経突起の数（）は、細胞当たりの神経突起のすべてを総括およびiii）神経突起を有する細胞のパーセンテージ（陽性に染色された核を有する細胞の総数）19によってβIIIチューブリンを発現する細胞の総数を分割する。

4.細胞内Ca 2+イメージングをレーザ誘起

  1. 無水ジメチルスルホキシド（DMSO）10ml中の溶質2gを溶解することによりプルロニックF-127の20％（w / v）のストック溶液を調製する。溶解性を増加させるために、約20分間40℃でプルロニックF-127の溶液を加熱する。 RTで保存した場合、事前に準備をします。
  2. NRインキュベーション後3日目に、平衡塩類溶液（BSS; 135ミリモルのNaCl、4.5のKCl、1.5のCaCl 2、0.5のMgCl 2、5.6 mMグルコース、および10mM HEPES、pH7.4）で調製し、5でそれを補ったDMSO中のFluo-4 AMおよび0.1％のμM（w / v）のプルロニックF-127の溶液。
    注：BSS溶液を予め調製し、1ヶ月の最大冷蔵することができる。実験の日にサプリメント（のFluo-4 AMとプルロニックF-127）を追加します。
  3. 細胞分化培地を除去し、補足しBSSソリューションと交換してください。倒立共焦点顕微鏡で最良の結果を得るためには、ウェルのマイクロスライドで細胞を培養する。
  4. 負荷のFluo-4 AMとNG108-15細胞5％CO 2/37℃、暗所で30分間インキュベートした。インキュベーション時間の後、すべての細胞外のアンロードされた蛍光団を削除するには、BSSで二回のサンプルを洗う。
  5. カップルレーザーシングルモード光ファイバとし、標準的な技術を用いて、先端を切断する。 （ すなわち先端が顕微鏡検査の際に繊維軸に垂直と平らにしてください）高品質な表面を確保するために、光学顕微鏡下で生じた先端を観察します。
    1. 標準的な電力計で出力レーザパワーを測定する。光ファイバホルダに光送出ファイバを挿入し、マイクロポジショナーにそれを貼り付けます。光ファイバの準備とポジショニングの詳細については、Brown ら 20を参照してください。
      注意：（ たとえば、他のラボのユーザーに迷光の露出を防ぐ、取り扱い時にレーザー安全ゴーグルを着用し、レーザー光を直視しないでください）レーザパワーの測定中にレーザーの安全のための一般的なルールに従ってください<。/ LI>
  6. 光変調を監視するために携帯用のレーザーにオシロスコープを接続します。可変周波数（0.5〜2ヘルツ）とパルス長（20〜100ミリ秒）でバイナリ信号を使用してください。 Paviolo ら 13に示す設定に従って、顕微鏡用トランジスタ-トランジスタロジック（TTL）などの変調信号を用いてレーザ入力を接続する。
    1. 倒立共焦点顕微鏡下で細胞を置き、250±50ミクロン離れて透過照明モードでの標的細胞からの光送出ファイバを配置。この距離では、ターゲットでのビーム半径を計算するために3.3.1で提示の式を使用しています。
  7. 内部化のFluo-4 AM色素を励起するアルゴンイオンレーザー（488 nm）を使用します（λEX = 494nmで、λEMは 516ナノメートル=）とエンドサイトーシスのNRの励起のための同期化されたLDを。時系列スキャンを収集することにより、少なくとも40倍の対物レンズを用いて試料および対照のRTでの撮像を行う256×256ピクセル/少なくとも4ヘルツの周波数で往復モードのフレームの解像度を持つ。任意のアルゴンイオンレーザー干渉（ベースラインノイズ）を識別するための、LD励起せずに記録を行う。
  8. 適応的に加重処罰最小二乗アルゴリズム21を使用してデータから背景を削除します。時間の関数として誘発されたCa 2+の変化をプロットします。レベルのベースラインノイズ（3σ）の標準偏差の3倍を閾値化することにより画像後処理ソフトウェアを使用して蛍光強度の過渡的なピークを分析する。

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結果

ここで説明するプロトコル1,2、および3を用いて、分化刺激効果は、AuのNPと共に培養NG108-15神経細胞で観察されたレーザー後（金NRは、ポリ（スチレンスルホン酸）のAuのNRおよびシリカ被覆金のNRをコーティングさ） 1.25と7.5 Wとのエクスポージャー·cm -2で。 rhodamineB標識金のNRの共焦点画像は、粒子が、インキュベーション12の1日目から内部移行したことを示した。局在化は主に摂取の好ましい機構は、細胞体膜12を介してであったことを示し、細胞質で観察された。 NG108-15神経細胞に分化誘導後に検出された主な形態学的変化は、増殖の停止、βIIIチューブリンタンパク質の発現と最大長さと数22の条件で分析した神経突起の伸長であった。

のNRを用いて培養した試料は、レーザirradiにおける神経突起の長さの増加を示したここで測定ンスレベル（1.25と7.5 Wの間·cm -2で）。 （NPをなしで培養し、同じレーザパワーで照射した細胞）コントロー...

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ディスカッション

このプレゼンテーションで概説プロトコルは文化に、差別化と光学的に外因性の吸収を使用して神経細胞を刺激する方法を説明します。 NR特性（ 例えば、寸法、形状、プラズモン共鳴波長および表面化学）及び（ 等波長、パルス長、繰り返し率、等）、レーザー刺激パラメータは、異なる実験的なニーズに合うように変えることができる。細胞の挙動に対する効果は、標準的な生物学的アッセイおよび材料を用いてモニターすることができる。全体的なアプローチは、 インビトロで細胞集団を照射するためのシンプルかつ強力な、方法を提供し、一次細胞、組織試料およびインビボ研究に拡張することができる。

金のNRの生物学的用途のために使用することが満たす必要がある主な要件は、安定性（化学的および物理的の両方）および生体適合性である。後者により、カチオン性界面活性剤（一般的に存在するため、特に重要である金の表面上のLY CTAB）。 CTABは、インビトロ28およびインビボ29の両方で

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開示事項

著者には開示すべき競合する利益はありません。

謝辞

著者は、部分的に撮影中に彼女の助けのためにシェフィールドさんとJaimeeメインの大学でこの研究を主催したための旅行資金援助と教授ジョン·ヘイコック用NanoVenturesオーストラリアを承認したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
au NRSigma Aldrich716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-グルタミンSigmaAldrich G7513
ペニシリン/ストレプトマイシンLife Technologies15140122
アムホテリシン BLife Technologies15290018
ホルムアルデヒドSigma AldrichF8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-βIII-チューブリンプロメガG7121
TRITC標識抗マウスIgG抗体Sigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis分光器Varian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
Mini遠心分離機EppendorfMini Spin
Sonic bathUnisonics AustraliaFPX 10D
細胞培養インキュベーターKendroHera Cell 150
細胞培養遠心分離機HettichRotofix 32A
レーザーダイオードOptotech780 nm シングルモードファイバー - 結合LD
光ファイバーThorlabs780 HP
パワーメーターコヒーレントレーザー チェック
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
落射蛍光顕微鏡Axon InstrumentsImageX-press 5000A
μ-slide well同上80826
倒立共焦点顕微鏡カールツァイス顕微鏡株式会社LSM 510 メタ共焦点顕微鏡
オシロスコープテクトロニクスTDS210

参考文献

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