方法論記事

マウスにおける臭気差別と馴化のためのテスト

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DOI：

10.3791/52615

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2015年5月5日

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1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

この記事について

サマリー

この原稿は、げっ歯類の嗅覚系を調べるためのプロトコルを説明しています。嗅覚馴染/嗅覚異常試験により、研究者は、マウスが繰り返し提示される匂いに慣れるかどうか、およびマウスが新しい匂いを嗅いだときに馴染み消すかどうかを判断できます。

要約

このビデオは、マウスで正常に機能している嗅覚系の存在を確立する技術を示しています。このテストは、マウスが非社会的な匂いと社会的な匂いを区別できるかどうか、マウスが繰り返し提示される匂いに慣れるかどうか、およびマウスが新しい匂いを嗅いだときに不慣れを示すかどうかを判断するのに役立ちます。多くの社会的行動試験は、よく知られたマウスや新しいマウスに対する実験動物の反応を測定するため、動物が社会的な匂いを検出して区別できることを立証することで、偽陽性を避けることができます。匂いを使って新しい環境を作り出したり、嗅覚の手がかりを連想刺激として利用したりする恐怖条件付けなど、学習テストでも同様の考慮事項があります。嗅覚系の欠損は、恐怖条件付け中に文脈を区別し、嗅覚の手がかりと関連付けを形成する能力を損なうでしょう。

臭気居住/消臭試験では、マウスは繰り返しいくつかの臭気を呈されます。各臭いは2分間で3回提示されます。研究者は、嗅覚反応の測定として、匂いに向けられた匂いを嗅ぐ時間を記録します。典型的なマウスは、繰り返しの提示(慣れ)で臭いに対する反応が減少します。次に、実験者は、新しい匂いに向かって嗅ぎ分ける増加を誘発する新しい匂いを提示します(不愉快化)。新しい匂いを繰り返し提示した後、動物は再び慣れを示します。このプロトコルは、水、2つ以上の非社会的な匂い、および2つの社会的な匂いの提示を含む。この試験は、実験的な交絡因子を減らすだけでなく、新しいノックアウトマウス、ノックインマウス、および条件付きノックアウトマウス系統の嗅覚系の機能に関する情報を提供することができます。

概要

マウスは、他の個人を認識するため、食品を見つける、新しい環境をナビゲートするための嗅覚に依存していて、性行動1-3。これは、研究者は、実験動物が食物を伴う行動試験、社会的相互作用、またはマウスからの応答を誘発することを目的と任意の臭いを投与する前香りの機能感を持っているかどうかを確立することが不可欠です。行動試験の他のタイプが実行される前に、臭いを検出し、区別するマウスの能​​力を確立すべきであるので、臭覚障害または異なる臭気を区別できないことは、行動パラダイムの多種多様な偽陽性または陰性につながる可能性があります。

嗅覚馴化/脱馴化試験は、最初、1980年代4に記載しました。試験は博士によるマウスでの使用に適合されています。ムーヤンとジャクリーン·クローリー5。これは、研究者はESTAを可能にする、シンプルで安価な試験でありますマウスが検出され、悪臭を区別することができますblish。テストの嗅覚に加えて、この試験は、研究者がマウスの一般的な動作を観察することを可能にし、早期のテスト計画において行われる必要があります。マウスの移動に関する定性的観察は、不安、活動のレベル、および食品の臭いに対する社会的な匂いに対する反応の兆候は、テストを行うことが可能性がある新たな分野をシグナリングすることができます。

この試験では、様々な悪臭に浸した綿棒を3回行のマウスに提示されます。臭気の各繰り返し提示すると、マウスは、その後の各プレゼンテーションでそれを調査するより少ない時間を費やして、綿棒に慣らすます。新たな臭気が提示されると、脱馴化が発生し、典型的なマウスは、現在および以前の臭気5とを区別できることを示し、綿棒を調べる多 ​​くの時間を過ごすことになります。この試験は、一度に1つのマウスに投与し、45分ACCを備えていますlimation期間は、試験の45分が続きます。

この試験は、実施するのが容易であるが、それは、マウスの嗅覚システムに関する高度な問題を調査するために使用することができます。このような埋設食品検査として嗅覚のその他の人気の試験は、単に臭覚障害の有無を確立します。しかし、嗅覚差別と慣れ試験は、研究者がマウスで臭気を検出する能力を持っているが、異なる匂いとを区別することができないだけで判断することができます。馴化と脱馴化のパターンは、新しい変異体が臭気6,7を区別することができることを確立するために使用されています。驚くべき研究では、FadoolとのKv1.3チャネルの遺伝子標的欠失を有するそのマウスを示すために臭いの複雑な混合物を使用した同僚は、マウス8、通常よりも良い非常によく似た匂いを識別することができる「スーパーsmellers」です。

新しいノックアウトマウスモデルを調べるときには、establisに便利です時間の基本的な感覚​​のタスクの正常な動作の存在。テスト計画の初期に行われた場合、臭気差別や慣れテストが調査員に異常な行動を観察する機会を与えてくれます。これらの観​​察結果は、変異体の特性を交絡に起因するその後の検査で偽陽性または陰性の結果を防ぐことができます。研究者は、社会的行動を調査し続けている基本的な嗅覚機能を確認する必要性は、ますます重要になります。変異株における嗅覚を調べることに加えて、この試験は、すべての匂い刺激に対する薬理学的治療は、特に社会的な匂い刺激に対する動物の応答を増加させるかどうかなど、またはそれらの応答が増加した場合、特定の問題に対処するために使用することができます。

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プロトコル

以下の実験で使用した成体雄マウスを作製し、暗14時間の光と10時間（20時6:00時間）概日周期で、22℃の周囲温度でベイラー大学で飼育しました。マウスは、食物および水を自由に摂取アクセスを与えました。マウスへのすべての手順は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドラインの国立研究所を遵守していたし、動物プロトコルは、ベイラー大学動物実験委員会によって承認されました。マウスは、昼前/午後で試験しました。研究者の下にあるすべての手順については臭いを除去し、汚染を防ぐために手袋を着用しなければなりません。

非社会的な臭気の調製

  1. 新鮮な非社会的な匂いにテストの毎日を準備します。
    注：研究者は臭いを準備するために手袋を使用する必要があります。
    1. 水各10mlで3遠心管を埋めます。
    2. ピペット15ミリリットル＆＃にバナナエキス100μlの160; 1秒15ミリリットルコニカルチューブに円錐管とアーモンドエキス100μlの：100希釈。
      注：第15ミリリットル管が水のみが含まれます。

社会においの調製

  1. 発生する朝のテストに新たな社会的臭気を準備します。少なくとも3日間洗浄し、マウスの同じ番号が含まれていなかった2つのケージから社会匂いを取得します。試験対象と同じ性別のマウスからの社会的臭気を取得します。
    注：これらは、室温で保存すると、強力で一貫性のある臭いを維持するために4~6時間以内に使用すべきです。
    1. 決定どのように多くの社会的な臭気綿棒を作成する必要があります。テストされている各マウスは、社会臭い1、および社会的臭気2から3からの3つの綿棒が表示されます。
    2. 汚れたケージの下部にジグザグ状に綿棒を拭くことによって社会的な臭いを準備します。先端にしがみついて、余分な寝具を振り払います。
    3. 蓋付きまたはパラフィルムで覆われたビーカー内の大きなガラスの瓶に保管スワブ。社会臭1と社会臭い2秒ごとに1つのコンテナを指定します。
  2. 実験的な試験室の外に臭気源ケージを維持します。

試験マウスの3順化

  1. 手袋の上に置き、試験しようとするマウスを計量し、上にワイヤ蓋と除去された水のボトルとクリーンケージに個別に配置します。
  2. マウスは試験室以外の部屋で45分間、新しいケージに順応することを可能にします。部屋には異常な臭いや騒音がないことを確認します。
  3. テストは約45分かかりますので、現在のマウスをテストする前に権利を順応さクリーンケージにテストされるべき次のマウスを置くことによって順化時間をずらします。

テストルームの4準備

  1. 新鮮な綿棒、実験用テープ、社会的な臭気スワブを含むボトル、n個のチューブを入れます試験室で蓋付きの社会的な臭気、マイクロピペット、2タイマ、および廃液ボトル。
  2. 試験室は、臭気、騒音、明るい光の適度に自由であることを確認してください。香りのコロンまたはローションを着用しないでください。
    注：観察者は、試験期間中にガムや飴を噛むされるべきではないと強い臭気食品への露出を制限するようにしてください。

5.テスト手順

  1. 試験室に、そのケージに順応させたマウスを持参し、着席しながら閲覧するための快適な高さにカウンターの上にケージを置きます。
  2. 2分毎にのために行の各臭気を3回提示します。 表1に見ることができる提示順序を使用してください。
    1. 綿棒、再キャップ臭気源の先端までに試験される香りで、付臭剤のピペットを50μl。ケージのワイヤー上部を持ち上げ、水のボトル口に綿棒の無香料、木製の端を挿入し、pushinGトップへのワイヤの下側から貫通長さ。臭気汚染が回避されるように、指を含め、何にも綿の先端に触れないようにしてください。
    2. 綿の終了の約1インチをケージに垂れ下がるまで水ボトル開口部を介して綿棒を描き続けています。ラボのテープを使用して、ケージの側面に綿棒の木の端を貼り付けます。
      注：蓋が戻ってケージの上に落下させないように注意して、試験マウスを乱す大きな音を発生させます。
    3. すぐに2分間のタイミングを開始します。 2分間のプレゼンテーションを時間を計るために1つのタイマーを使用してください。 2分間の試験中に香りをスニッフィング費やした累積時間を記録します。独立したストップウォッチを使用して、動物のスニッフィングの行動をカウントします。動物の鼻が鼻〜2センチメートルまたは先端に近いと綿の先端に向かって配向されたときにアクティブな盗聴が定義されています。
    4. 各試験の終了後、ワイヤカバーを上げ、国連を通じて下方に引いて、綿棒を削除蓋のderside（これはワイヤーに触れ綿棒を防止することによって臭気汚染を回避します）。 500ミリリットル廃棄ボトルで使用されるスワブを密封します。
    5. 準備し、次の綿棒を挿入し、タイミングを開始します。各試行間間隔の間に約1分を許可します。各香りは2分毎にのために、3回連続で提示されるまで操作を続行します。
  3. マウスはすべての試験を完了した後は、試験室の外のゴミ箱に使用綿棒を含む廃棄ボトルを空にすることができます。そのホームケージにマウスを返します。

6.分析

  1. ANOVAは、ニューマン·クールズ続いて、双方向または重大な馴化を決定するために、同様の事後検定（連​​続した同じ匂いスニッフィング少ない時間）、およびdishabitutation（より多くの時間の新しい香りをスニッフィング）を用いた匂い条件ごとに各グループのデータを分析します。

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結果

記載されたプロトコルに続いて、結果は10成人（生後90〜120）の雄のC57BL / 6Jマウスと8つの雄FVB混合背景株（生後50〜70）を使用して記録しました。試験は、複数日にわたって単一の研究者によって行われました。グラフ上の各点は、臭気を調査費やした平均時間を表します。

水に浸した綿棒が最初に導入された場合、マウスはこの新規オブジェクト（：最初の3つのデータ点図1）を調査する多くの時間を費やしています。それぞれの連続した​​プレゼンテーションでは、短い時間では、馴化を示し、綿棒を調査に費やされています。新たな臭気が導入されると、時間の上昇は、マウスが新しい臭いと前の（：アーモンドデータポイント図1）とを区別できることを示し、綿棒を調査費やしあります。この場合も、それぞれの連続した​​プレゼンテーションで、より少ない時間が臭気を調査に費やされます。マウスはかなりのDを示します3件の試験F（2,18）= 3.8の上に水の綿棒をスニッフィング時間でecrease、P <0....

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ディスカッション

本論文で得られた結果は、マウスに最適です。マウスはすぐに慣れ、その後、新規の臭いに強い反応を示しています。この方法における重要なステップの一つは、悪臭の製造です。研究者は、汚染を防止するために、互いから臭気を分離するために細心の注意を取る必要があります。もう一つの重要な側面は、綿棒の提示です。研究者はマウスが先端を調査することができるように綿の先端の最高のロケーションを解決する必要があるが、先端に裂けていません。試験の重要な成分は、悪臭の選択です。我々は3つの非社会的臭気を提示し、それは追加の匂いを含めることは困難ではないであろう。一つの注意点は、互いに著しく異なる匂いを選択することです。似た匂いが順次提示されている場合は、1つは、「床効果」を観察することができます。さらに、マウスは、あまりにも多くの新たな臭気を提示するときの応答を低減するために始めることができます。研究者は含めることを希望する場合dditional臭いは、彼/彼女はテストの別の日を含めることができます。これは、各マウスをテストするのに約1時間かかります。また、1は実験条件としてそれらを含める前に、対照マウスにおける臭いの選択のトラブルシューティングを行う必要があります...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、ベイラー大学研究評議会の助成金とてんかん財団からの研究助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マウスケージアレンタウン標準マウスケージ
ワイヤー蓋アレンタウンBCUマウス WBL 2500
寝具ハーラン7090 サニチップス
綿棒VWR89031-2706 インチ 木製ハンドル
バナナエキスマコーミック
アーモンドエキスマコーミック
実験室用テープVWR89098-062
ストップウォッチVWR62374-000
ニトリル手袋VWR82026
タイミング装置VWR61161-350
15 ml 円錐管VWR89003-294
2 L ビーカー パイレックス1003
パラフィルムパラフィルムPM-9924 "x 250'
キャップ付き1LボトルVWR89000-240

参考文献

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