この記事では、さまざまな心拍数での圧力/体積分析によるマウスの左心室機能の測定について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
人間の心臓障害を模倣する動物モデルは、潜在的な治療戦略をテストするために作成されています。これらの戦略を評価する重要なコンポーネントは、心機能に及ぼす影響を検討することです。 in vivoでの心臓力学（ 例えば 、心エコー検査、圧力/容積関係など ） を測定するためのいくつかの技術があります。心エコー検査と比較して、カテーテルを介してリアルタイム左心室（LV）の圧力/容積分析は、LV機能を評価する際に、より正確で洞察力です。また、LV圧/ボリューム分析を瞬時に収縮（ 例えば 、βアドレナリン刺激）および病理学的侮辱（ 例えば 、虚血/再灌流傷害）の操作中に変更を記録する機能を提供します。最大に加えて（+ DP / DT）と最小（-dP / dt）はLVの圧力変化の速度、いくつかの負荷に依存しないインデックスを介してLV機能の正確な評価（ 例えば 、収縮末期圧体積関係と予圧補充可能なストローク作業）を得ることができます。心拍数は、心拍数の増加が心拍出量（ すなわち 、バウディッチ効果）を高めるための主要なメカニズムであるように、LV収縮性に大きな影響を与えます。実験群間の血行動態を比較した場合従って、それは同様の心拍数を有することが必要です。さらに、多くの心筋症のモデルの特徴は（ すなわち 、バウディッチ効果を減少させた）収縮準備金の減少です。したがって、重要な情報は、収縮性に心拍数を増加させる効果を決定することによって得ることができます。我々のその他のデータは、神経型一酸化窒素シンターゼ（NOS1）ノックアウトマウスは、収縮を減少させたことを実証しました。ここでは、NOS1ノックアウトマウスモデルを使用して、心拍数の増加に伴ってLV圧力/体積を測定する手順を説明します。
概要
心臓の目的は、生物の代謝要求を満たすために、体全体に血液をポンピングすることです。これらの要求は常に（運動中など 、）変動しているため、心臓は（ すなわち 、心拍出量を増加させる）適応しなければなりません。心はこの偉業を達成するために、多数の経路を考案しました。心臓がこれを達成プライム方法は、心拍数の増加（ すなわち 、バウディッチ効果）1を介してです。つまり、自分の心拍数が増加すると、これは、収縮性の増加および心拍出量の増加をもたらす、あります。したがって、心機能は、心拍数時極めて依存しています。残念ながら、心疾患（ 例えば 、心筋梗塞、肥大など ）、心臓が、その結果、身体の代謝要求を満たすことができなくなるの貧しい心機能をもたらします。心臓病は、西洋社会における罹患率および死亡率の主な原因です。多くのヒトcardiomyを再現動物モデルopathies分子メカニズムを研究し、潜在的な治療法を試験するために使用されます。治療が生存することができる場合は、これらのメカニズムを識別し、決定するために、研究者らは、in vivoでの心機能を評価する必要があります。
しかし、これらのパラメータは後負荷、予圧、および心拍数に大きく依存している日常的駆出率を測定するin vivoでの心機能を評価するためのいくつかの方法（ 例えば 、心エコー検査、MRI など ）、短縮率、心拍出量、 等があります収縮2に加えて。収縮性を測定することは、その天然の環境の中で心の固有の特性を理解することが不可欠です。圧力の開発の最大（DP / dtの最大 ）率は歩近づく収縮性を理解するために私たちをもたらします。残念ながら、DP / dtはまた、心拍数と負荷条件3に依存しています。したがって、技術は、ベルを参照して、負荷（および心拍数を測定するために開発されていますOW）心筋収縮の独立した指標（ すなわち 、収縮末期圧容積関係（ESPVR）とプリロード補充可能なストロークワーク（PRSW））4-6。 ESPVRは、任意のLV容積で心室によって開発することができる最大の圧力を説明しています。 ESPVRの勾配は収縮末期エラスタンス（Eesの）を表します。 PRSWは拡張末期容積とストローク作業（PVループで囲まれた領域）の線形回帰です。これらの手順は、駆出率、心拍出量、およびストローク量などの血行動態パラメータと比較して、収縮性のより正確かつ精密な測定です。 ESPVRとPRSWは下大静脈（IVC）の一時的な遮断を介して得ることができます。 IVCをブロッキング心臓機能に胸腔内圧の変化の影響を避けるために、閉じた胸を行うことができます。
増加の心拍数も収縮と弛緩1を高めます。このように、エクスペリ間に心臓機能を比較した場合L基（ 例えば 、±DP / dt）が、心拍数は、同様にする必要があります。しかし、同様の心拍数は、通常、様々な条件（疾患、研究介入など ）にそれぞれの動物では発生しません。それは、（注射用および吸入）麻酔は心拍数を低下させることに留意すべきです。心拍数が収縮性の主要な決定因子であるように、麻酔がかなり収縮に影響を与えます。このような理由から、私たちは私たちの手順を説明しています。さらに、多くの心筋症の特徴は減少収縮リザーブ（ すなわち 、減少バウディッチ効果）です。したがって、心機能は、心拍数の範囲にわたって測定されるべきです。ここでは、これらの効果を達成するために、（閉じた胸に）刺激を使用する方法について説明します。
心拍数に加えて、一酸化窒素（NO）は、収縮7の重要な調節因子です。 NOは、NOシンターゼ（NOS）と呼ばない酵素によって生成されます。我々と他の人は、神経NOS（NOS1のノックアウトでそのマウスを示しましたアップ）筋細胞の収縮およびin vivo心血行動態8,9 に鈍化しています。このマウスは、様々な心拍数で行うLV圧力/容積解析手順により、左心室の収縮性の測定値を示すために使用されます。
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プロトコル
注：この動物プロトコルは、オハイオ州立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。この手順では、頸動脈の内径は、カテーテルを挿入するのに十分な大きさである、任意のマウスに使用することができます。 16グラム（〜2カ月以上経過）を超えているマウスを使用してください。
1.カテーテルのためにマウスを準備
- 滅菌袋にすべての手術器具や消耗品を密封します。オートクレーブ機で袋を滅菌します。手順を通して無菌領域を維持し、滅菌手袋を着用してください。
- 腹腔内注射によりケタミン（55 mgの/ kg）をプラスキシラジン（15ミリグラム/ kg）でマウスを麻酔。
注：全体の手順は、様々な心拍数で両方の圧力/体積を測定し、ESPRV未満20分かかります。追加の時間（ すなわち 、30分以上）が必要な場合、麻酔のさらなる¼用量ごとに30分を与えます。 - 前方Rに髪を削除脱毛ローション（ 例えば 、Nairさん）を使用して、首と胸の領域のegionと発泡プラットフォームにマウスの四肢をテープで固定します。つま先のピンチによって深麻酔の状態を確認してください。
- 体温（37±1℃）を監視するために、直腸プローブを挿入し、（外科用ドレープとプラットフォームとの間に位置する）、熱調節加熱パッドを使用して維持します。
- 4-0縫合糸（約10センチ）の長さを用意してください。プラットフォームにループ上顎切歯の周りに縫合糸とテープ。これは首をまっすぐに維持します。
- ベタジンおよび75％アルコールで3回領域をスワブにより手術領域を滅菌します。
2.カテーテル
- 湿った生物学的環境のために、圧力センサダイアフラムを順応させ、圧力信号のドリフトを防止するために、（製造業者の指示に従って）使用前および負の少なくとも30分間、食塩水または蒸留水（37℃）でチップを予備浸漬することによってカテーテルを準備します圧力記録。
- 前頸部における下顎と胸骨の間の長手方向0.8センチメートル切開を行います。細かいハサミで、stemohyoideus筋の下にあり、気管を露出させるために、皮膚、筋肉、結合組織を分離します。
- 右頸動脈を露出するように湾曲した鉗子で気管の右側に脂肪と筋肉組織を分離します。
注：頸動脈は首の前方領域で最大の動脈で、鮮血が含まれていて、拍動です。頸動脈と平行に走る頸静脈と混同しないでください。頚静脈は暗赤色と非拍動です。また、頸動脈の単離の間に、ユーザが迷走神経を損傷することはないに注意する必要があります。 - 湾曲鉗子で右頚動脈から脂肪を除去します。この運用手法を妨げます血管の分岐が存在する場合は、頸動脈を解離するためにボビー焼灼でそれらをカット。湾曲したピンセットを用いて頸動脈の下で可能な限り組織の多くを分離します。
- 2 5センチメートル6-0絹糸をカットします。右頸動脈の下に各絹糸を渡します。
- 動脈の遠位部に近い近位部および他の近くに位置つのスレッド。先端部でのスレッドでタイトな結び目を作る、と近位部にスレッド上で緩い結び目を作ります。
- 小さな止血剤、血管クランプを使用して、動脈の近位部をクランプすることによって血流を遮断（近位のスレッド下記のクランプを置きます）。動脈の密封された領域は、血液が、それは簡単なステップ2.8を実行することで満たされます。
- 26 G針を持つ2つのスレッド（ただし、遠位スレッドに近い）との間の右頸動脈に小さな穴を穿刺。頸動脈にカテーテルを挿入します。わずかな場所に保つためにカテーテルに頸動脈の近位部に緩い結び目を締めます。
注：使用しては針穿刺が好ましい比較はさみ切開します。最初の動脈の遠位部にタイトな結び目を作る、その後、近位部をクランプすることにより、動脈が完全に血液で満たされます。これは、血管を通って突くすることが非常に容易になります。また、注射針（26 G）の大きさがうまくカテーテルのサイズに合う穴動脈を穿刺。はさみ切開法を用いる場合には、切開の大きさを制御することはより困難でした。しかし、選択された方法は、外科医がでより快適に感じる1に依存する必要があります。 - ステップ3のように圧力信号の記録を開始。
- 止血クランプを緩め、左心室に前進カテーテルを挿入し続けます。いくつかの抵抗を経験している場合は、カテーテルを進めた場合に、ゆっくりと引いて、再び前進してみてください。 〜18〜25グラムの重さのマウスの場合は、挿入されたカテーテルの推定長さが18ミリメートルです。
NOTE：動脈圧信号は、70〜120ミリメートル水銀から変動します。 Tかつて彼カテーテルは、左心室の圧力信号の変化の形であり、圧力は、0から（ 図1に示す）120 mmHgまで変動します。心機能は、カテーテルを挿入した後、2〜3分以内に安定します。 - 連続体温、麻酔レベル、および呼吸数を監視します。
3.データ集録
- LabChartPro 7ソフトウェア（または類似のソフトウェア）を使用します。 PVループLabChartモジュールのワークフローオプションを使用します。このモジュールを使用して、圧力およびボリュームループのデフォルト設定を選択します。
- セットアップ3つのチャネル：圧力のための1つのチャンネル、ボリュームごとに1つのチャネル、および心拍数のための1つのチャネルを。 0〜150ミリメートルHgの、それぞれ0〜100μLおよび0〜800拍/分、上記のようにパラメータの設定スケールの範囲です。
- を押して、レコードのキーを起動します。
4.バウディッチ効果
- 胸骨柄に前胸部領域並列に1cmの切開を行います。筋肉とEXPの層をカットはさみを使用して肋間OSE。
- 、2 Vの電圧を2ミリ秒の持続時間、およびリピートモードを有効にします。正方形のパルス刺激を使用して、次のパラメータを設定します。
- ピンセットで負極を持ち、心臓の先端領域に第四肋間を介して挿入します。ピンセットで正極を持ち、心臓の右心房の領域への第2肋間腔を介して挿入します。
- 刺激をオンにして、10ヘルツ（600拍/分）までの4ヘルツ（240拍/分）から心臓をペーシングするために周波数を変更してください。新しい各心拍において、データ収集の前に1分間、心臓を刺激します。
5. ESPVRとPRSWの生成
- はさみで腹部領域における胸骨柄に垂直に皮膚や筋肉組織を切断。 enterocoeliaを開き、肝臓を露出させます。
- 金属トラクションを使用してヘッドに向かって弓costarumをドラッグします。
- ゆっくりと下方に肝臓をプッシュ綿棒。胸腔に影響を与えるためにあまりにも多くをプッシュしないように注意してください。これは、心臓の機能を変更します。
- 肝上下大静脈（IVC）を露出するようにはさみで肝臓の鎌状靭帯を切りました。
- 急速に右心房への血液の戻りをブロックするために5秒間IVCを圧迫する湾曲したピンセットを使用してください。左心室圧と容積は、心臓に減少流入に分類されます。これらの値を生成する際に、60ミリメートルHgの下のループを使用しないでください。 60ミリメートルHgのは、収縮期血圧に関連してあります。
注：これはかなり冠動脈灌流を減少させ、収縮に影響を与える灌流圧の有意な低下の原因となりますので、この値は、60ミリメートルHgで設定されています。
前記体積較正
- 腹腔内注射によって（通常の生理食塩水で希釈）5,000ヘパリン溶液：1 0.1 mlのマウスをヘパリンで治療します。
- 頸動脈からカテーテルを取り外します。カテーテルは、FRを引くと頸動脈OM、ヘパリン添加血液は、カテーテルが挿入された穴から浸透します。
- 1mlシリンジを使用してボリュームキャリブレーションのために、この血液を収集します。キャリブレーションキュベット中で各ウェルを埋めます。
- 失血を経由して、マウスを安楽死させるために、心臓を削除します。
- 各ウェル内のカテーテルの位置を調整し、安定相対体積単位（RVU）の値を取得します。各ウェルからの各種標準ボリュームとRVUの値を使用して標準曲線を生成します。
- μlに記録されたRVUを変換します。
7.データ処理
- ボーディッチ効果を調べるために、それぞれの心拍数から定常状態の圧力/容積トレースを選択します。データを取得するために、ベースラインの分析をクリックします。
- ESPVRとPRSWデータの場合、最初の〜15の圧力/容積トレースを選択し、ESPVR（拡張末期容積でLVによって開発された圧力の傾き）とPRSW（ストローク作業の線形回帰を生成するために、ソフトウェアで閉塞分析]をクリックします拡張末期とボリューム）斜面。
- ループの形状に注意を払います。ループがない、角度点やひねりで閉じていることを確認してください。これは、不適切なカテーテル留置又は過剰ノイズのサインです。定期的に適切な圧力とボリュームデータが生成されていることを確認するために実験中のループを確認してください。
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結果
左心室へのカテーテルの適切な挿入は、適切な圧力と体積の値を達成するための重要なステップです。カテーテルが心室に動脈からにつれてプロLabChart 7を用いて、 図1に示すように、圧力波形（形状および値）の変化です。
左心室へのカテーテルの適切な挿入後、圧力（P）および容積（V）を、PVループを生成するために使用され得られた値は、（ 図2に示します）。
これらの圧力値を使用して、収縮性を変化させるメカニズムを調べることができます。 図3に示される心拍数の増加に伴ってどのように圧力と容積変化の一例です。拡張期および収縮期LV容積が減少し、この例では、300〜600拍の心拍数を増加/分、LV圧力は、80から100 mmHgまで増加しました。 図4に示される心拍数であります圧力開発（DP / dt）は、最大及び最小速度の依存性。心拍数が増加するにつれて、圧力開発の最大値と最小速度を行いま...
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ディスカッション
収縮性の信頼性の高い測定値を取得するには、この技術のための重要なステップは、LVに適切なカテーテル留置あります。カテーテルが正しく配置されていない場合、LVが壁を収縮する際、不規則な形状のPVループを引き起こして非常に高く、かつ生理的ではない、圧力値が得られたカテーテルに接触することができます。必要に応じて、カテーテルが正しい配置を達成するように回転させることができます。この技術のためのもう一つの重要なステップは、マウスが適切な麻酔を受けたことを確認することです。マウスを麻酔した上にある場合、これは非常に心機能を低下させます。心拍数を有するマウス未満〜250拍未満/分、麻酔かけて考えることができます。さらに、マウスの心臓がポンプの血液の量は、それが困難な正確なボリュームを取得することに小さいです。これは、各マウスのボリュームを校正することが重要です。体積較正のために、我々は、キュベットのキャリブレーション技術が記載されています。ボリューム（ すなわち較正するためにも使用される付加的な方法があり、下行胸部大動脈）10のフロープローブを用いたストローク量算出。
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開示事項
競合する金銭的利益はありません。
謝辞
この研究は、NIHの助成金HL091986（JPD）およびHL094692）MTZ）の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Xlyzine 100 mg/ml | アナセド | 4821 | |
| カタミン 50 mg / ml | タラー | 310006 | |
| ヘパリン | APP医薬品 | 6003922 | |
| 4-0絹糸 | 外科専門 | SP102 | |
| 6-0絹糸 | 外科専門 | MBKF270 | |
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11251-10 | |
| カーブ鉗子 | ファインサイエンスツール | 11274-20 | |
| はさみ | ファインサイエンスツール | 14090-09 | |
| 血管クランプ | ファインサイエンスツール | 18555-03 | |
| 顕微鏡 | 世界の精密機器 | PZM-3 | |
| 圧力カテーテル | ミラー機器 | SPR-839 | |
| 圧力および体積システム | ミラー機器 | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD機器 | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD機器 | ||
| 温度コントローラー | CWE | TC-1000 | |
| 刺激装置 | グラス | SD-5 | |
| 滅菌手袋 | マイクロタッチ | 1305018821 | |
| 脱毛ローション | ナイール | ||
| ベタジン 手術用スクラブ | 獣医 | NDC 6761815401 | |
| アルコール | デコン研究所 | 2801 | |
| Bovie焼灼 | Bovie | AA29 | |
| 1 mlシリンジ(26 Gニードル) | BD | 8017299 |
参考文献
- Janssen, P. M. Myocardial contraction-relaxation coupling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1741-H1749 (2010).
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C. dP/dt(max)--a measure of 'baroinometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 66, 63-65 (2012).
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
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