Method Article

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

DOI:

10.3791/52621

⸱

April 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Medical Center, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 3Department of Radiology, George Washington University, 4Department of Pediatrics, George Washington University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、生体機能化されたプルシアンブルーナノ粒子の合成と、それらをマルチモーダルな分子イメージング剤として使用することを説明しています。ナノ粒子は、ナノ粒子コア内のガドリニウムイオンまたはマンガンイオンがMRIコントラストを生成するコアシェル設計をしています。生体機能シェルには、蛍光イメージング用の蛍光色素と分子ターゲティング用のターゲティングリガンドが含まれています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多峰性は、分子イメージングは​​、複数の相補的な画像化技術を使用して、細胞の細胞内および分子レベルの解像度での生物学的プロセスの可視化を可能にする。これらの造影剤は、診断と治療の両方の効果を増強インビボでの経路および機構のリアルタイム評価を容易にする。マルチモーダル、分子イメージングアプリケーションで使用するための薬剤の新規クラス - この記事では、biofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子の合成（PB NPS）のためのプロトコルを提示します。ナノ粒子は、蛍光イメージングおよび磁気共鳴イメージング（MRI）に組み込まれた撮像モダリティは、相補的な特徴を有している。 PB NPは、両方のT 1及びT 2強調シーケンスで、PB格子の格子間の空間内に組み込まれたガドリニウム、マンガンイオンがMRIコントラストを生成するコア-シェル設計を有する。 PBのNPは、静電用いた蛍光アビジンで被覆されている自己としてsembly、蛍光イメージングを可能にする。アビジン被覆ナノ粒子は、ナノ粒子に分子標的化能力を付与し、ビオチン化リガンドで修飾されている。ナノ粒子の安定性および毒性は、そのMRI緩和能、ならびに測定される。これらbiofunctionalized PB NPの多峰性の分子イメージング機能を蛍光イメージングおよびインビトロでの分子MRIのためにそれらを使用することによって実証される。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分子イメージングは、細胞の細胞内および分子レベルでの生物学的プロセスの非侵襲的な標的と可視化1である。分子イメージングは​​、その内因性経路およびメカニズムがリアルタイムで評価されている間、そのネイティブ微小環境のままに標本を許可します。典型的には、分子イメージングは2研究され、可視化対象、関連の生理学的プロセスを追跡する小分子、巨大分子、またはナノ粒子の形態の外因性造影剤の投与を含む。分子イメージングで検討されてきた様々な撮像モダリティは、MRI、CT、PET、SPECT、超音波、光音響、ラマン分光法、生物発光、蛍光、および生体顕微鏡3が含まれています。マルチモーダルイメージングの組み合わせは、様々な生物学的プロセス、イベント4を視覚化し、特徴付けする能力を増強する二つ以上の撮像モダリティを組み合わせたものである。 Multimoda個々の制限3を補償しながらリットルイメージングは、個々の画像化技術の強みを利用する。

マルチモーダル、分子イメージング剤の新規クラス - この記事では、biofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子の合成（PB NPS）のためのプロトコルを提示します。 PBのNPは、蛍光画像および分子MRIのために利用される。 PBは、面心立方ネットワーク鉄（II）、鉄（III）原 ​​子を交互からなる顔料（ 図1）である。 CN - -その三次元ネットワーク5内の電荷のバランスをとるためにカチオンを組み込ん鉄IIIリンケージ PB格子は、鉄IIの直線シアン化物配位子で構成されている。その格子に陽イオンを組み込むためにPBの能力は、別々にMRI造影のためにPBのNPへのガドリニウム及びマンガンイオンをロードすることによって利用される。

MRI造影のためのナノ粒子の設計を追求するための理論的根拠が原因である利点は、この設計は、現在のMRI造影剤と比較しています。 US FDAが承認したMRI造影剤の大部分は、本質的に常磁性であり、スピン格子緩和機構6,7,8正コントラストを提供ガドリニウムキレートである。独自に低い信号強度を提供する単一のガドリニウムキレートと比較して、ナノ粒子のPB格子内の複数のガドリニウムイオンの組み込みは、信号強度（ポジティブコントラスト）3,9が強化されています。さらに、PB格子内の複数のガドリニウムイオンの存在は、それによって、スピン - スピン緩和機構による負のコントラストを生成し、全体的なスピン密度及びその近傍に局所磁場を乱すナノ粒子の常磁性の大きさを増大させる。従ってガドリニウム含有ナノ粒子は、T 1（正）及びT 2（負の）造影剤10,11の両方として機能する。

腎機能障害を有する患者のサブセットでは、ガドリニウムベースの造影剤の投与は、腎性全身性線維症8,12、13の開発に関連している。この観察は、造影剤のような代替の常磁性イオンを使用するために調査を求めているMRI。したがって、ナノ粒子の多用途設計はPB格子内にマンガンイオンを組み込むように適合されている。ガドリニウムキレートと同様に、マンガンキレートはまた、常磁性であり、典型的にはMRI 7,14における正の信号強度を提供するために使用される。ガドリニウム含有PBのNPと同様に、マンガン含有PB NPはまた、（正の）T 1及びT 2（負の）造影剤として機能する。

蛍光イメージング機能を組み込むために、ナノ粒子「コア」は、蛍光標識された糖タンパク質アビジンからなる「生体機能性」シェルは（ 図1で被覆されている）。アビジンは、蛍光イメージングを可能にするだけでなく、特定の細胞や組織をターゲットに、ビオチン化リガンドのドッキングプラットフォームとして機能していないだけ。アビジン-ビオチン結合は、アビジンとビオチン15との間の非常に強い結合親和性によって特徴づけられる最強の既知の、非共有結合の一つです。アビジン被覆PBのNPへのビオチン化リガンドの取り付けは、PBのNPに分子標的の機能を付与する。

これらの画像診断法は、相補的な機能を有しているので、PB NPSを使用して蛍光とMRイメージングを追求するための動機はある。蛍光画像は、最も広く使用されている光学的な分子イメージング技術の一つであり、高感度1,16,17において、複数のオブジェクトを同時に可視化を可能にする。蛍光イメージングは、安全、非侵襲的様式であるが、浸透の深さおよび低い空間解像度1,3,16と関連している。一方、MRIは、高い時間ANを生成し、dの空間解像度、非侵襲的および放射線1,3,16をイオン化する必要がない。しかしMRIは低感度に苦しんでいる。したがって、蛍光画像化およびMRIは、浸透深さ、感度、および空間分解能のそれらの相補的な特徴に起因する分子イメージング技術として選択した。

この記事では、PB NPの合成と生体機能化するためのプロトコルを提示しガドリニウム含有PB NPを（GdPB）、およびマンガン含有PB NPを（MnPB）10,11。以下の方法が記載されている：1）サイズ、電荷の測定、およびナノ粒子の経時安定性、MRI緩和能の3）測定ナノ粒子の細胞毒性の2）評価、および蛍光分子のMRイメージングのためのナノ粒子の4）利用インビトロでの標的細胞の集団。これらの結果は、in vivoでのマルチモーダルの分子イメージング剤として使用するためのNPの可能性を示す。

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Protocol

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PBのNP、GdPB、およびMnPBの1の合成

ナノ粒子（PBのNP、GdPB、またはMnPB）の合成は、以下に説明する手順を実行することによりワンポット合成スキームを使用して達成される。

  1. 溶液を調製 '脱イオン（DI）水に5 mMのヘキサシアノ鉄（II）を5 mlを含む。 ：PBのNP、GdPB、またはMnPB、次のようにソリューション 'B'を準備する - 合成されたナノ粒子の種類に応じて
    1. のために PBのNP：DI水中の2.5mMの塩化鉄（III）を含有する溶液10mlを調製する。
    2. GdPB NPの場合：2.5 mMのDI水中のガドリニウムの各（III）、硝酸鉄（III）塩化物を含有する溶液10mlを調製
    3. MnPB NPの場合：2.5 mMのDI水中のマンガンのそれぞれの（II）、塩化鉄（III）塩化物を含有する溶液10mlを調製する。
  2. 溶液を丸底フラスコに「B」を追加し、室温（RT）でフラスコ内容物を攪拌し1,000回転。ソリューション ''滴下丸底フラスコ溶液を含む「B」に追加します。約10ml /時間を分配するように設定した蠕動ポンプによって 'B'を解決 'A'を追加するための流量を制御する。
  3. 'B'を解決 'A'の添加が完了した後、さらに30分間室温で1000rpmで攪拌​​し続ける。攪拌しながら停止し、混合物を収集する。
  4. 未反応成分を含まないナノ粒子をすすぐためにマイクロ遠心チューブに混合物のアリコートを転送します。遠心分離により粒子収集を支援するために、各アリコートに、5MのNaCl（0.2ミリリットルのNaCl / mlの反応混合物）を加える。
  5. 遠心分離し、20,000×gで少なくとも10分間のナノ粒子の各アリコート。遠心分離した後、慎重に上清を除去します。
  6. マイクロチップ（超音波処理パルスを用いて超音波処理を介して、1ミリリットルの脱イオン水中の各ナノ粒子のペレットを再懸濁/オフ= 1/1秒に、振幅= 50％、持続時間=5秒、超音波処理器の定格電力= 125 W）は、ペレットを分割する。
  7. 繰り返しは、ナノ粒子は、初期反応の成分および反応副生成物を含まないことを保証するために1.4〜1.6、少なくとも3回繰り返す。最後の遠心分離の後、1ミリリットルのDI水中に粒子を再懸濁する。

PBのNP、GdPB、およびMnPB 2.生体機能化

ナノ粒子の生体機能化は、アビジンナノ粒子「コア」のコーティングを含み、以下に説明するように、ビオチン化リガンドを加える。

  1. 蛍光アビジンとナノ粒子のコーティング
    蛍光アビジンを有するナノ粒子のコーティングは正にアビジン（pIは〜10.5）で帯電した静電気の自己組織化を用いて達成される18を次のように負に荷電ナノ粒子ためにコーティングされている。
    1. 1ミリリットルのDI水中にPBのNP、GdPB、またはMnPBの懸濁液を準備します。アレクサフルオロ488標識アビジンフィルター（A488を、DI水で再構成）10分間14,000×gで0.2μmのナイロンのマイクロフィルターを通す。 ≤0.2MGアビジン/ mgのナノ粒子を追加します。 PBのNP、GdPB、またはMnPBのアリコートに別々にA488の各フィルタ処理アリコートを追加します。
    2. 4℃で穏やかに振盪または回転に2-4時間、A488を有するナノ粒子にお問い合わせください。アルミ箔を用いた光からサンプルを保護します。
      注：PBのNP（PB-A488）、GdPB（GdPB-A488）、及びMnPB（MnPB-A488）をコーティングしたこのステップの収量のA488。
  2. ビオチン化抗体のアタッチメント
    次のようにアビジン被覆ナノ粒子上にビオチン化標的とする抗体の結合は、アビジン - ビオチン相互作用を使用して実現されます。
    1. 1ミリリットルのDI水中にPB-A488、GdPB-A488、およびMnPB-A488 - アビジン被覆ナノ粒子の懸濁液を準備します。 10分間14,000×gで0.2ミクロンのナイロンのマイクロフィルターを介してビオチン化抗体を（製造業者によって供給されるよう）フィルタ。
      注：ここで、本研究では、ビオを使用していますinylated抗神経膠細胞抗原2（ANG2）NG2細胞および中枢神経系の組織との中で過剰発現を標的化抗ヒトエオタキシン-3酸球または好酸球細胞株で過剰発現受容体を標的とする（Eot3）。
    2. アビジン被覆ナノ粒子の分量に別々にビオチン化抗体の各フィルタ処理アリコートを追加します。 ≤0.05mgのビオチン化抗体/ mgのアビジン被覆ナノ粒子を追加します。 4℃で穏やかに振盪または回転に2-4時間、ビオチン化抗体（ANG2またはEot3）でアビジンコーティングされたナノ粒子にお問い合わせください。アルミ箔を用いた光からサンプルを保護します。
      注：この手順の利回り抗体被覆ナノ粒子（ 例えば GdPB-A488-Eot3とMnPB-A488-ANG2）。

3.サイズ、ゼータ電位、およびナノ粒子の経時安定性

ナノ粒子のサイズ分布は、電荷、および安定性を動的に使用して測定される光散乱（DLS）以下に記載の方法。

  1. ナノ粒子のサイジング
    次のようにナノ粒子のサイズ設定は、動的光散乱を用いて達成される。
    1. 使い捨てのプラスチックキュベット内のDI水990μlに、ナノ粒子のサンプル（1mg / ml）を10μlのを追加します。
      注：これは良いDLS信号の代表値である。
    2. よく混合するキュベットと渦をキャップ。ナノ粒子のサイズを測定するために、粒子サイズを分析するために使用されるシステム内のキュベットを置く。 173°の測定角度で粒子サイズ分析を行う。
  2. ナノ粒子のゼータ電位
    次のようにナノ粒子のゼータ電位は、位相解析光散乱を用いて測定される。
    1. 使い捨てのプラスチック製のキャピラリーセル内のDI水900μlに、ナノ粒子のサンプル（1mg / ml）を100μlのを追加します。この値は、良好なゼータ電位測定のための代表である。
    2. capillarを配置25℃でのデフォルトパラメータを使用してナノ粒子のゼータ電位を測定するために、ゼータ電位を分析するために使用されるシステムのy細胞。
  3. ナノ粒子の経時安定性
    ナノ粒子の経時安定性を以下のように動的光散乱を用いて測定される。
    1. セクション3.1で説明したように脱イオン水中のナノ粒子ならびにダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の大きさを測定することにより、ナノ粒子の安定性を評価する。
    2. 5日間にわたってDI水およびDMEM回/日でサイズ測定を繰り返します。

ナノ粒子の4.細胞毒性

次のようにナノ粒子の細胞毒性は、XTT細胞増殖アッセイを用いて測定される。

  1. シード10,000-15,000細胞/ウェルの各細胞型は、96ウェルプレート中（のNeuro2a、BSG D10、行末-1およびOE21）を研究した。播種した細胞の総容積はメールしないことを確認してくださいXceedの0.2ミリリットル/ウェル。一晩37℃、5％CO 2で播種した細胞をインキュベートする。
  2. 細胞とナノ粒子へのお問い合わせ：
    1. （ - 0.5 mg / mlの0.01）ナノ粒子の様々な濃度で細胞をインキュベートします。 （50μlの）ナノ粒子の量を記述する代表テーブルとして表1を参照してください/ウェル50μlの培地を除去した後、細胞に添加した。
      1. アッセイ中のナノ粒子のいずれかの妨害吸光度を考慮して、ナノ粒子の適切な濃度からなるブランク追加（0-0.5ミリグラム/ mlで、等価中の細胞に添加量に）培地に細胞を含まない。
    2. 37℃で一晩、ナノ粒子で細胞をインキュベートし、5％CO 2。培地を吸引除去し、各ウェルから、リン酸緩衝溶液（PBS）中の5％ウシ胎児血清（FBS）からなる染色緩衝液でリンスした。フェノールレッドを含まない培地を100μl加え、37℃、5％CO 2でインキュベート16〜18時間のために。
  3. 製造業者の仕様に従ってキット成分（XTT試薬とXTTアクティベーター）を混合することにより、XTT細胞増殖アッセイ作業溶液を準備します。井戸から培地を吸引除去し、または研究された細胞タイプに適した培地（/フェノールO +赤10％FBS + 1×ペニシリン - ストレプトマイシンワットRPMI）RPMI100μlのを追加します。各ウェルにXTTワーキング溶液50μlを加え、2〜2.5時間、CO 2を 37℃でインキュベートし、5％。
  4. 指紋や汚れを補正するために630の参照波長で、490nmでの吸光度を測定する。各ウェルに対する補正吸光度を計算する（490 -A 630）との複製のための測定値を平均する。
  5. 最終的な補正吸光度値を計算するために、各ウェルの値からブランク測定値を減算する。ナノ粒子なしで、未処理の細胞のものと最終的な補正吸光度を正規化することにより、各サンプルの生存率を計算します。プロットSUナノ粒子の濃度の関数としてrvivalパーセンテージ。

5. MRI PB NPの緩和能、GdPB、およびMnPB

MRI緩和度はT 1を用いて測定される-とT 2以下に述べるように、ナノ粒子を含む96ウェルプレートを用いてMRI「ファントム」を調製することによって強調シーケンスを。

  1. ファントムの準備
    1. 適切な濃度で含む各ウェルに100μlのナノ粒子（PBのNP、GdPB、またはMnPB）で96ウェルプレートを準備します。ナノ粒子の種類ごとに0.4 mMの濃度で始まり、2.4×10 -5 Mの濃度（これは、14の希釈および15ウェルを必要とする）に達するまで直列DI水を用いてナノ粒子を2倍に希釈
    2. 各ウェルにDI水内の溶融1％アガロース溶液100μlを加え、よく混ぜる。ゲルは12時間、4℃で固化することを許可する。
      注：これはの連続希釈液を含むファントムを生み出す固化したアガロース中のナノ粒子。
    3. 2％寒天（150 cm 3）での固体ブロックの下に水平の3 T臨床磁石にファントムを配置します。 8チャンネルのHD脳コイルの中心に寒天のファントムとブロックを固定します。 96ウェルプレート11の中間高さで0.5mm厚の冠状スライスを使用して緩和時間を測定する。
  2. T 1 -及びT 2強調シーケンス
    臨床磁石中の配列を取得するための以下の代表的な設定を使用します。
    注：これらの値は、本研究で使用されるナノ粒子のために最適化されています。
    1. Tを買収、次のフレアー法（FLAIR）シーケンスを用いて1強調（T1W）MR画像：電車エコー（ET）= 8、繰り返し時間（TR）= 2300ミリ秒、エコー時間（TE）= 24.4ミリ秒、行列のサイズを= 512×224は、視野（FOV）は、16×16 cm 2程度を =。
    2. 以下の速いrelaxaを使用して、T 2強調（T2W）MR画像を収集る高速スピンエコー（FRFSE）シーケンス：ET = 21。 TR = 3500ミリ秒。 = 104ミリ秒、TE。マトリクスサイズ= 512×224。 FOVは16×16 cm 2とし =。
    3. 以下の反転時間で127メガヘルツ（3 T）でT1WとT2W MR画像を取得する：50、177、432、942、1961、および4000ミリ秒。
  3. MRI緩和能の測定
    1. セクション5.2に記載された配列を使用してT1WとT2W画像を取得した後、その後、今後のメインツールバーにある楕円形の作物のボタンを使用して各ROIを選択することにより、関心領域（ROI）として指定された各ウェル使用してImageJのための信号強度を測定>メジャーを分析し選択する。
      注：ポップアップは、「平均」という欄の下に各ROIの平均信号強度が表示されます。
    2. 各ROIについて、その具体的な反転時間に対して測定された信号強度をプロットします。場合は、必要に応じ、プロットの初めに最初の「バブル」または異常値を生成する反転点（測定値）（下反転回）。
      NOTE：MRIはむしろ19に対して補正/考慮する必要が実際の（負の）値より大きさや画像の絶対値を測定するため、これらの測定値は、低反転時間で生成される。
    3. 5.2節で説明したように反転時間対のROI（SI）（T I）のための信号強度の各プロットのための指数関数フィットを準備します。 x軸上にプロットT I、y軸上のSI。 ɑとΔは回帰によって決定される定数であり、T 1またはT 2は、解決すべき変数である：
      figure-protocol-1
      ここで、tがT 1、T = 2。
    4. 上記の式を使用して、T 1またはT 2について解くと、各ROIに使用されるナノ粒子の濃度に対して計算された値（1 / T 1および1 / T 2）の逆数をプロットする。
    5. 直線状のグラフの傾きを計算している緩和度は1とr 2 r を与える。
      注：プロトコルの次のセクションでは、蛍光標識し、標的細胞中で生成するMRI造影のためのナノ粒子のアプリケーションを記述します。

ナノ粒子を用いた標的細胞の6.蛍光標識 - 共焦点顕微鏡

注：ナノ粒子（PBのNP、GdPB、およびMnPB）は次のように、蛍光（共焦点顕微鏡によって監視）対象とする細胞の集団を標識するために使用することができます：

  1. 蛍光ナノ粒子の合成
    1. セクション1と2で説明する手順に従うことによって、標的細胞の集団を蛍光標識するためGdPB-A488、GdPB-A488-Eot3、MnPB-A488、MnPB-A488-ANG2を合成する。
  2. 蛍光標的とするための細胞の調製
    1. コー​​トなし。 0.002％のポリ（L-リジン）90分間臭化水素酸塩の溶液にそれらを浸漬することによって1.5マイクロカバーガラス。溶液からカバーガラスを取り外し、それらを24時間乾燥させます。
    2. 少なくとも16時間、種子を6ウェルプレートにコーティングしたカバーガラス上の細胞（ 例えば行末-1、BSG D10、SUDIPG1）、37℃でインキュベートし、5％CO 2。 1×PBS溶液で細胞をすすぎ、（オプション）15分間の中性緩衝液中で10％のホルムアルデヒドで固定します。 30分間37℃でPBS中5μM赤橙色の細胞浸透性色素で染色細胞。その後、PBSで細胞をすすいでください。
  3. >標的細胞の蛍光標識
    1. 細胞上の非特異的結合を最小にし、1時間37℃でインキュベートした細胞を、1％ウシ血清アルブミン（DI水中のBSA）を加える。
    2. 1時間、1％BSA中のナノ粒子で細胞をインキュベートする。行末-1の場合：0.2 mg / mlのGdPB-A488またはGdPB-A488-Eot3でインキュベート。 BSGのD10とSUDIPG1の場合：0.2 mg / mlのMnPB-A488またはMnPB-A488-ANG2でインキュベートする。 unbouを削除するには、PBS、3×で細胞をすすぐNDナノ粒子。
    3. 慎重にトラップされた気泡がないことを保証する、顕微鏡スライド上に（細胞およびナノ粒子を含む）カバーガラスを反転させる。慎重に明確なマニキュアを適用することにより、カバーガラスと顕微鏡スライドの間のエッジをシール。画像を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞。

ナノ粒子を用いた標的細胞の7.蛍光標識 - フローサイトメトリー

ナノ粒子（PBのNP、GdPB、およびMnPB）は次のように、蛍光（フローサイトメトリーでモニターした）標的細胞の個体群を標識するために使用することができます：

  1. PBS中に標的にされた細胞の懸濁液を準備します。純粋培養研究のために、懸濁液は、単一の細胞型（ 例えば、BSGのD10）から成る。 （合計10ml）に100,000細胞/ mlでPBSにおけるBSGのD10細胞の細胞ペレットを再懸濁する。混合培養研究のために、懸濁液は、少なくとも2つの細胞型（ 例えば、行末-1およびOEから成り21）; BSG D10と同様、100,000細胞/ mlの各（10ミリリットルの合計）でPBS中で行末-1およびOE21の細胞ペレットを再懸濁します。
    1. 行末-1の様々な比率の準備：OE21を1：0（2ミリリットル行末-1）、3：1（1.5ミリリットル行末-1 0.5mlをOE21）、1：1（1ミリリットル行末-1およびOE21のそれぞれ） 1：3（行末-1 0.5ミリリットル、1.5ミリリットルOE21）、0：1（2ミリリットルOE21）。
  2. 非特異的結合を最小にするために、5％BSA、2 mlのナノ粒子によって標的とされる細胞（純粋および混合懸濁液）をブロックする。
  3. 細胞を、1ミリリットル（1mg / ml）を、ナノ粒子を添加し、1時間インキュベートする。 BSG D10の場合は、MnPB-A488、MnPB-A488-ABC（コントロール抗体）、またはMnPB-A488-ANG2）で細胞を培養する。行末-1およびOE21の混合物について、GdPB-A488-Eot3の固定量との混合物をインキュベートする。
  4. 未結合の粒子を除去するために5分間1,000×gで、少なくとも3回のサンプルをスピンダウンすることにより、結合していないナノ粒子の自由な細胞をすすぐ。 1mlのPBS中に細胞を再懸濁し、PBS中10％ホルムアルデヒドで固定する。 10μg/ mlのでインキュベートすることにより染色細胞氷上で30分間、PBS中の7 Aminoactinomytcin D。その後、フローサイトメーターを使用して、各サンプルから万ゲート細胞を分析し、PBSですすいでください。

ナノ粒子を用いた標的細胞8.生成MRI造影

以下のように、標的細胞の集団中-ナノ粒子（PBのNP、GdPB、およびMnPB）は（及びT 2強調配列の両方T 1）MRIコントラストを生成するために使用することができる

  1. ファントムの準備
    1. 〜80％のコンフルエンスまでT75フラスコ中の細胞（ 例えば BSGのD10）を成長。適切な増殖培地および条件を使用してください。 BSGのD10のために、37℃で、DMEM + 10％FBS + 1×ペニシリン-ストレプトマイシン中で細胞を増殖し、5％CO 2。
    2. 5ミリリットルのPBSで媒体の空き細胞をリンスし、非特異的結合を最小にするために1時間、PBS中の5ミリリットルの1％BSAで細胞をブロックする。細胞に5ミリリットル（0.5 mg / ml）でナノ粒子を追加します。 BSG D10の場合は、MnPB-A488、MnPB-A488-ABC（コントロール抗体）、およびのMnPで細胞をインキュベートB-A488-ANG2 1時間。
    3. 未結合のナノ粒子を除去するために細胞を5 mlのPBSで3回洗浄します。ファントム調製用フラスコからそれらを分離するために37℃、5％CO 2で2ミリリットルのトリプシンEDTA、0.25％溶液で5分間1回、細胞をインキュベートすることによって細胞をトリプシン処理。細胞のトリプシン処理をクエンチするDMEMの8ミリリットルを追加します。
    4. 5分間1,000×gで、それらを遠心分離して細胞を回収。上清を吸引除去する。 1mlのPBS中に細胞を再懸濁し、細胞を固定し、PBS 1mlの10％ホルムアルデヒドを加える。 96ウェルプレートの別々のウェルに各サンプルを100μlを追加。
    5. 各ウェルにDI水内の溶融1％アガロース溶液100μlを加え、ピペッティングによりよく混ぜる。ゲルは12時間、4℃で固化することを許可する。
      注：これは固化したアガロースで添付ナノ粒子と細胞を含むファントムを生み出す。
    6. 2％寒天（150センチ固体ブロックに次の水平3 T臨床磁石にファントムを配置11の中間高さ0.5ミリメートル厚の冠状スライスを使用して緩和時間を測定する。
  2. T 1 -及びT 2強調シーケンス
    臨床MRI磁石中の配列を取得するための次の設定を使用します。
    1. 以下のスピンエコーシーケンスを用いてT1W MR画像を収集：電車エコー（ET）= 1、繰り返し時間（TR）= 650ミリ秒、エコー時間（TE）= 11ミリ秒、マトリクスサイズ= 320×256、視野（FOV） = 10×10 cm 2である 。
    2. 以下FRFSEシーケンスを用いてT2W MR画像を収集：ET = 28。 TR = 3000ミリ秒。 = 101ミリ秒、TE。マトリクスサイズ= 384×288。 FOV = 10×10 cm 2である 。
  3. ポスト取得処理
    1. グレースケールに画像を変換するために、選択画像>種類> 8ビット：読みやすいように、ImageJのを用いたカラースケール画像に元のグレースケール画像に変換する。
    2. アガロース溶液からの信号寄与を差し引いた後、各サンプルの正規化強度を計算します。

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Results

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ワンポット合成スキームを使用して、PB NPのナノ粒子（直径78.8 nmの多分散指数（PDI）= 0.230を意味し、動的光散乱装置で計算して）、GdPB、またはMnPB（直径の164.2ナノメートル、PDI = 0.102を意味する）（直径122.4 nmの、PDI = 0.124）の平均（DLSにより測定）単分散であることを一貫して（ 図2A）を合成することができる。合成されたナノ粒子の測定ゼータ電位は、表面電荷に基づく粒子の適度な安定性を示し未満-30 mVに（ 図2B）である。その一貫したサイズ（; 図2C流体力学的直径）によって示されるように合成されたナノ粒子は、5日間にわたって十分な経時安定性を示す。

細胞と共インキュベートした場合、ナノ粒子（PBのNP、GdPB、およびMnPB）が特定の閾値濃度（ 図3）下のセルにごくわずかな細胞毒性を示す。細胞毒性STU0.67×10 -6 MG /セル（ 図...

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Discussion

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この記事では、biofunctionalizedプルシアンブルーのナノ粒子に基づくマルチモーダル、分子イメージング剤の新規クラスの合成方法を提示した。ナノ粒子に組み込まれた分子イメージングモダリティは、その補完的な特徴を、蛍光イメージングと分子MRIである。 biofunctionalizedプルシアンブルーのナノ粒子は、コア - シェル設計を有する。これらのナノ粒子の合成における重要なステップは次のとおりです。プルシアンブルーナノ粒子（PB NPS）で構成されているコアをもたらす1）ワンポット合成、ガドリニウム含有プルシアンブルーナノ粒子（GdPB）、またはマンガン含有プルシアンブルーナノ粒子（MnPB）静電自己組織化により、蛍光アビジンを使用してナノ粒子、2）生体機能化、堅牢なアビジン - ビオチン相互作用を使用して、ナノ粒子に、ビオチン化リガンド（抗体）の3）アタッチメント。蛍光アビジンとビオチン化リガンドは両方とも、bioF遺伝子を構成するナノ粒子のunctionalシェル。

T 1及びT 2 MRI用造影剤の両方として機能する...

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この作業は、Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation（RACアワード#30000174および30001489）の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ヘキサシアノ鉄酸カリウム(II)三水和物(K4Fe(CN)6·3H2O)Sigma-AldrichP9387
マンガン(II)四水和物(MnCl2·4H2O)Sigma-Aldrich221279
硝酸ガドリニウム (III) 六水和物 (Gd(NO3)3·6H2O)Sigma-Aldrich211591
塩化鉄 (III) 塩化物六水和物 (FeCl3·6H2O)Sigma-Aldrich236489
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS9888
抗NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ビオチン標識抗体ミリポアAB5320
ビオチン化抗ヒトエオタキシン-3Peprotech500-P156GBT
Neuro-2a細胞株ATCCCCL-131
BSG D10 Cell LineLab stock---
OE21 Cell LineSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Poly(L-lysine) HydrobromideSigma-AldrichP1399
ホルムアルデヒドSigma-AldrichF8775
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA2153
アミノアクチノマイシン DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Calcein Red-Orange, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
遠心分離機エッペンドルフ5424
蠕動ポンプInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
ホットプレート/マグネチックスターラーVWR97042-642
クリーンアルミホイルVWR89107-732
テックスミキサーVWR58816-121
1.7 ml円錐形微量遠心チューブVWR87003-295
15 ml円錐形遠心分離管VWR21008-918
チューブホルダーVWR82024-342
使い捨てプラスチックキュベットVWR7000-590 (/586)
ゼータサイザー毛細血管細胞VWRDTS1070
遠心フィルター、0.2マイクロメートルスピンカラムVWR82031-356
96ウェル細胞培養トレイVWR29442-056
トリプシンEDTA 0.25%溶液 1xJR Scientific82702
Cell Culture Grade PBS (1x)Life Technologies10010023
XTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4891-025-K
T75 Flask89092-700VWR
Dulbecco's Modified Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 共焦点レーザー走査顕微鏡OlympusFV1200
チャンバー顕微鏡スライドThermo Scientific154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5VWR48366-227
Microscope SlidesVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
アガロースシグマ-アルドリッチA9539 
FACSCalibur Flow CytometerBD Biosciences
3 T Clinical MRI MagnetGE Healthcare
100 ml 丸底フラスコ
塩化ウルトラボル

References

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