繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

サマリー

ここでは、繊維のグラデーション組織とのエレクトロスピンナノファイバー足場を作製し、細胞形態/方向を調節することでアプリケーションを探求するプロトコルを提示する。ナノファイバー足場の物理的および化学的性質に関して勾配が生物医学分野での幅広い用途を提供する。

要約

このプロトコルの目標は、繊維組織のグラデーションを持つナノファイバー足場を生成するための簡単な方法を報告し、細胞の形態/配向を制御するためのそれらの可能なアプリケーションをテストすることです。ナノファイバーの組織化は、足場内の繊維組織を徐々に減少させることを可能にする新しい作製装置によって制御されます。ファイバーのアライメントを変更するには、一軸にアライメントされたファイバーマット上のランダムなエレクトロスピニングファイバーの堆積時間を短縮します。ファイバーデポジションと同じ軸に沿って、コレクターを移動バリア/マスクで覆うことにより、組織構造を簡単に制御できます。組織工学の目的で、脂肪由来の幹細胞をこれらの足場に播種することができます。幹細胞は、さまざまな組織構造上の位置の結果として形態学的変化を受け、その位置に応じて異なる細胞タイプに分化する可能性があります。さらに、繊維の段階的な組織化により、ナノファイバー足場の生体模倣性が向上し、従来の足場と比較して、腱から骨への挿入部位におけるコラーゲンナノファイバーの自然な配向により近くなります。ナノカプセル化により、グラデーション繊維は繊維足場に化学勾配を構築する可能性も提供し、それによって細胞-材料相互作用の迅速なスクリーニングや界面組織再生への応用の可能性をさらに強化します。この技術により、連続的な勾配足場の製造が可能になりますが、移動するバリア/マスクの動きを離散的に制御することにより、離散的なステップで繊維を生成することもできます。

概要

ナノファイバーは、その構造および相対的な大きさ¹で、細胞外マトリックスを模倣する能力の組織工学のための人気のユーティリティである。しかし、このような腱から骨挿入部位のようないくつかの天然の組織界面は、腱に向かって整列して増加し、骨部位^2-5で減少する可変の組織構造を示すコラーゲン線維を含む。そこで、効果的な組織再生のための効果的な構造勾配を模倣し得る足場を作製する必要がある。

以前は、具体的には、ミネラル含有量⁶ファイバー組成が徐々に変化に行われた研究があった。しかし、結合組織の構造成分を再現することは、主に未踏のまま。以前の研究は、ラット頭蓋冠骨芽細胞の増殖に対する表面のシリカ粒子密度の効果を研究することによって、形態学的勾配を調べ、インバーを発見シリカ粒子密度及び細胞増殖⁷とそれの関係。しかし、以前の研究では、細胞増殖を媒介する形態学的変化は、繊維組織変更^7,8を模倣で能力を欠いている粗さを表面主に関連していた。最近の研究では^、9をエレクトロスピニングするための新規なコレクタを使用して、ユニークなコラーゲン繊維の配向を模倣する足場を作製することを試みた。この研究は、両方の整列とランダム繊維と足場を生産することに成功したが、それはネイティブの組織に展示漸進的な変化を模倣することができなかった。また、ランダムな向きに整列からの即時変更で、個別のコンポーネントを製造する際に、この足場の生体力学的特性が大幅に減少した。以前の仕事は、整列とランダムからの繊維配向で連続階調で適用可能なナノファイバー足場を生成することができなかった。我々の最近の研究では、ナノファイバー足場の成功したレクリエーションを示している潜在的に腱·ツー·ボーンの挿入¹⁰で天然コラーゲン組織を模倣することができ、繊維組織内の階調の。この研究は、密接に天然の腱から骨組織界面における繊維組織のそれに似ている構造を有するナノファイバー足場の製造に使用されるプロトコルを提供することを目的とする。

グラデーションナノ構造は、様々な分野での潜在的に遠大な用途がある。我々はすでに様々な基材^11-14上の組織再生のために利用されている脂肪由来幹細胞（ADSCを）と私たちの足場を組み合わせることにより、腱·ツー·骨挿入部位の組織工学への応用に焦点を当てた。また、ADSCのは多分化の観点から骨髄幹細胞の性質が非常に類似しており、それらのリソースは、単純な脂肪吸引手順^15,16を使用して回収することができる豊富である。さらにぼかしナノファイバー足場にこれらの細胞を播種すると、彼らのTISを強化潜在的に様々な組織に分化できる細胞の分布制御を可能にすることによってエンジニアリングアプリケーションを訴える。幹細胞を播種することに加えて、ナノファイバーは、細胞応答の調節シグナル伝達分子をカプセル化することができる。これらの足場の組織的な勾配とのカップリングナノカプセル化は、細胞挙動または可能なインプラントデザインやコーティングの研究のために可能にする。骨芽細胞分化^15,16を誘発すること^が示された骨形成タンパク質2（BMP2）、のような機能性分子のカプセル化は、さらにこれらの足場¹⁰の組織工学アプリケーションを増強できる。

プロトコル

ソリューションの調製

1. 100 mg / mlのおおよその濃度で、ポリ（εカプロラクトン_{）（PCL）（W} M =8万グラム/モル）の溶液を調製する。 4の比率でのジクロロメタン（DCM）およびN、N-dimethlyformamide（DMF）の混合物中でPCLを溶解：1（v / v）の10％の濃度（w / v）の。
2. 混合を20 mlのガラスチューブ中の溶液を置き。 30分間超音波洗浄器にガラス管を置き、または溶液は半透明になるまで。

2.装置の準備

1. 付属の21ゲージ鈍針で5ミリリットル注射器に準備されたPCL溶液を加える。
2. 図1によれば、垂直電界紡糸位置にシリンジポンプを配置する。
3. 2cmのX整列繊維基材のための5cmのオープンスペースでステンレス鋼ギャップコレクタを使用してください。針の先端からコレクター12センチメートルを置きます。
4. 直流（DC）に高電圧電源を接続し針とコレクタを接地してください。コレクタが個別に他のラボ機器に非接触で接地されていることを確認してください。

3.エレクトロ

1. 取り外したときに、針の先端に形成滴まで1.50ミリリットル/時間に設定したシリンジポンプは、直ちに交換されている。その後、0.50ミリリットル/時に流量を設定。
2. 12 kVのに電圧演算子を回します。
3. エレクトロスピニングは、一軸整列繊維が完全にコレクタ上のギャップをカバーするまで。
4. 小さなガラス板の縁部に接着剤を適用し、ガラス板にギャップコレクタから繊維を転送する。ガラスプレートと同じ大きさを有しており、接地されたアルミニウム箔片の上にガラス板を置き。
5. 図3に係る第2のシリンジコレクターを配置します。
6. 第2のシリンジポンプにプラスチック製のマスクを取り付け、2ミリメートルコレクタの上にそれを配置する。
7. （w / w）のPCLソリューション-IF NaNに1％のクマリン6を追加します。oencapsulationはdesired-あり、溶液が半透明になるまで混ぜる。
8. ブラント21ゲージ針で5ミリリットルの針にPCLまたはPCL /クマリン6溶液をロードします。 9ミリリットル/時間で、または1ミリメートル/分のおおよその速度で引っ張って0.50ミリリットル/時、水平垂直ポンプを設定します。
9. エレクトロスピニングは、マスクまでほぼ完全にコレクタオフ、それでもマスクの下のエッジ領域に移動した。

4.ファイバー特性評価

1. 両面導電性テープと場所サンプル40ミリアンペアでスパッタコーターを使用して40秒間白金と金属スタッドとを被覆する。
   1. 私たちのこれまでの研究^17,18に係る走査型電子顕微鏡（SEM）を介して繊維を調べます。
   2. 加速電圧15kVで画像を収集します。
2. 繊維配向を測定するために別々の繊維試料に高速フーリエ変換（FFT）解析を行う。 FFTにより、繊維アラインメントを測定に関する詳細情報は、Tを参照することができますこれまでの研究^19,20 O。

5.幹細胞を播種する。

1. 2時間、70％エタノール溶液に浸漬することによって繊維試料を滅菌する。その後、任意の汚染物質を除去するために蒸留水で繊維を洗浄する。
2. 95％空気/ 5％CO ₂の雰囲気中、37℃で、25cm ²のフラスコ中に人間のADSC培養細胞を得る。一日おきに¹⁰細胞培養培地を変更します。
3. 細胞をトリプシン処理し、細胞数をカウントします。具体的には、細胞培養フラスコから全ての培地を除去し、二リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄する。その後、細胞単層を覆い、2~3分間、細胞培養インキュベーター中でフラスコをインキュベートする（37℃の水浴中で前加温）、0.25％トリプシン-EDTA溶液1のm ^{リットルを}加える。 4ミリリットル培地を追加し、全面にメディアをピペッティングすることにより、表面からすべてのセルを洗い流す。細胞懸濁液を遠心し、再分散番目培養培地中の電子の細胞ペレット。血球計を介して細胞を数える。ナノファイバー足場に1×10 ^4個の細胞の周りの種子は、35ミリメートルの-culture皿に置かれ、3と7日間インキュベートする。
4. フルオレセインジアセテート（アセトン中5mg / ml）の（FDA）、画像、蛍光顕微鏡を用いて試料を用いて染色細胞。具体的には、培養皿にFDA溶液100μlを添加し、30分間インキュベートする。三回蛍光イメージング前にPBSで細胞を洗浄。私たちのこれまでの研究¹⁰に基づいてカスタマイズされたマット·ラボプログラムによってセルの向きを分析します。

結果

このプロトコルを使用して、組織的な勾配を有する繊維マットを形成した。 図3は、ナノファイバー足場上の様々な位置で撮影したSEM像を示す。定性的には、これは6mmで（ 図3D）でのランダム繊維品揃え0ミリメートル（ 図3A）で一軸整列した繊維からの進行があると判断することができる。 FFTは繊維配列に定量値を与え、定量的なプロセスに関する詳細はこちらを¹⁹詳述されている。 0ミリメートル呈する繊維アライメントを示し、6 mmにFFTパターンがランダムな配向を意味FFTにおける繊維。ますますランダム繊維堆積（ - C図3B）に整列繊維組織からSEM像の明確な進行（ 図3）があります。

ADSCをナノファイバー足場内の位置に基づいて形態学的変化を受けた。 図4 図4E - H）

ディスカッション

プロトコルの最も重要な部分は、勾配足場の生成です。コレクターを覆うマスクが一定の速度で移動し、ファイバー足場内で段階的な変化が起こるようにすることが不可欠です。エレクトロスピニングを確実に成功させるには、PCL 溶液を正しく調製することも重要です。エレクトロスピニングの前に繊維の形態をチェックすることが推奨され、特にクマリン-6のカプセル化後は、エレクトロスピンを正しく行うためにより高い電圧が必要になる場合があります。

さらに、このプロトコルにより、ファイバー組織における離散的なグラデーションの製造が可能になります。ただし、このプロトコルでは足場全体の厚さが変化するため、機械的用途が制限される可能性があります。ランダムな繊維堆積が増加した領域は、整列した領域よりも厚くなります。このプロトコルは、腱から骨への挿入部位での化学組成の再現にも拡張されません。挿入部位で天然の鉱物含有量をうまく再現するには、鉱物勾配の構築が必要です。ミネラル組成と組織構造の勾配を持つ繊維足場の製造は、腱から骨への界面組織における完全な天然環境をよりよく再現するためにさらに調査されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリカプロラクトン	Sigma-Aldrich	440744
N,N-ジメチルホルムアミド	フィッシャーケミカル	D-119-1
ジクロロメタン	フィッシャーケミカル	AC61093-1000
クマリン6	シグマ-アルドリッチ	546283
脂肪由来幹細胞	細胞工学技術	HMSC.AD-100
ウシ胎児血清	Life Technologies	26140-111
フルオレセインジアセテート	Sigma-Aldrich	F7378
エタノール	Sigma-Aldrich	E7023
トリプシン-EDTA	Invitrogen	25300-054
&-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	A10490-01
アセトン	フィッシャーサイエンティフィック	s25120a
リン酸塩緩衝生理食塩水	Invitrogen	10010023
ガラススライド	VWRインターナショナル、
シリンジポンプ	フィッシャーサイエンティフィック	14-831-200	シングルシリンジ
超音波クリーナーブラン	ソン	1510
高電圧DC電源	ガンマ高電圧研究	ES30
走査型電子顕微鏡	FEI	Nova 2300
蛍光顕微鏡	Zeiss	Axio Imager 2

LLC101412-842