小分子変調分化とその後のグルコース飢餓を用いたヒト人工多能性幹細胞からの高度に精製された心筋細胞の導出

サマリー

ここでは、低分子調節心分化とグルコース欠乏媒介心筋細胞精製を組み合わせたヒト心筋細胞誘導のための堅牢なプロトコルについて説明し、心血管疾患のモデリングと薬物スクリーニングの目的で精製された心筋細胞の生産を可能にします。

要約

人間の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CMS）は基礎研究および翻訳アプリケーションで利用初代心筋細胞の不足に対処するための重要な細胞源となっている。心筋細胞へhiPSCsを区別するために、胚様体（EB）ベースの分化および増殖因子の誘導を含む様々なプロトコルが開発されている。しかしながら、これらのプロトコルは、精製された心筋細胞を生成する能力において非効率的であり、非常に可変である。最近では、Wnt /βカテニンシグナル伝達の小分子ベースのプロトコルを利用変調は、高効率で心臓分化を促進することが示された。このプロトコルでは、分化した細胞の50％よりも-60％が心筋トロポニン陽性心筋細胞を一貫して観察されたされた。さらに、心筋細胞の純度を高めるために、分化した細胞を特異的に代謝の差に基づいて、非心筋細胞を除去するためにグルコース飢餓に供した心筋細胞と非心筋細胞の間の。この選択戦略を使用して、我々は一貫して、分化した細胞の集団における非心筋細胞への心筋細胞の割合で30％を超える増加を得た。これらの高度に精製された心筋細胞は、in vitro疾患モデル研究及び薬物スクリーニングアッセイにおいてヒトIPSCベースからの結果の信頼性を高めるべきである。

概要

初代ヒト心筋細胞が原因侵襲心臓生検、単一の細胞に解離であり、なぜなら、培養中の乏しい長期の細胞生存の難しさの要件を得ることが困難である。初代ヒト心筋細胞の欠如を考えると、患者特異的なヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CM）技術は、基礎研究のための強力な代替的な心筋細胞源、ならびにこのような疾患モデルおよび薬物の臨床および翻訳アプリケーションと見なされている発見^1。心筋細胞への多能性幹細胞を分化の初期の努力は、胚様体（EB）を用いた分化プロトコールを用いるが、EB中の細胞の、しばしば25％未満が、心筋^2,3拍動しているため、この方法は、製造心筋細胞における非効率的である。比較的、AとBMP4、アクチビンサイトカインを用いて、単層ベースの分化プロトコルは、EBをより高い効率を示したが、このプロトコルはまだ比較的非効率的であり、ヒト多能性幹細胞株の限られた数⁴に高価な成長因子、および機能のみを必要とする。最近では、高効率、hiPSC単層ベースの心筋細胞分化プロトコルは、Wnt /βカテニンが^{5シグナリング}変調することによって開発されました。これらのhiPSC-CMは、心筋トロポニンTとアルファアクチニン、心筋細胞⁶の標準マーカーである2筋節タンパク質を発現する。プロトコルは、ここに記述し、この小分子ベースの、フィーダー細胞を含まない、単層分化方法^5,7を適応したものです。私たちは、7-10日間（ 図1）の後にhiPSCsから心筋細胞を破って入手することができます。しかし、50％が細胞を破って、その結果心筋細胞の分化以下、一貫して免疫染色することは、心臓特異的トロポニンTおよびアルファ - アクチニンなどの心筋細胞特異的マーカーに対して陰性である非心筋細胞の人口の存在を示している。 FUに対するrtherが心筋細胞を精製し、非心筋細胞を排除し、不均一な分化した細胞集団は、複数の日のために極めて低グルコース培地（ 図2）で処理することにより、グルコース飢餓に供した。この処理は、選択的に低グルコース環境⁸で生き残るために、一次エネルギー源として乳酸を代謝するために、心筋細胞の能力に起因する非心筋細胞ではなく、非心筋細胞を排除します。この精製工程の後に、非心筋細胞の心筋細胞の割合が40％の増加が観察される（ 図3、図4）、これらの細胞は、下流の遺伝子発現解析、疾患モデル、および薬剤スクリーニングアッセイに使用することができる。

プロトコル

注：このプロトコルで使用される全ての試薬 ​​のためのベンダー情報は、 表1に列挙されており、 マテリアルリスト。細胞と接触するすべての溶液および機器は、無菌でなければならず、かつ無菌操作はそれに応じて使用する必要があります。特に指定しない限り、加湿した37℃、5％CO ₂インキュベーター内ですべての培養のインキュベーションを行う。このプロトコルでは、すべての分化はhiPSCsが播種された、6ウェルプレート中で実施される。分化および精製の後、細胞を解離させることができ、下流の使用のために再プレーティング。

1.培地調製

1. E8媒体については、各培地成分のためのストック溶液（飽和NaHCO _3、L-アスコルビン酸-2-リン酸、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、インスリン、FGF2、TGFB1）を作製し、-20℃での解を格納。滅菌するためにDMEM / F12及びフィルタのボトルにストック溶液の適切な量を加える。ソリューションconcentrストックコンポーネントおよびE8媒体ATIONと反応セットアップは、 表1に見ることができる。
2. 細胞外マトリックス溶液は、4℃CO / Nで（一般に10mg / mlで供給）基底膜マトリックスを解凍。ヒト多能性幹細胞は、α-6-β-1インテグリン^9を用いて、この材料に良好に接着することができるので、マトリゲルは、一般的に、多能性幹細胞培養のために使用される。一度氷冷ピペットチップ、チューブを使用して氷上で2.25ミリグラム（250μL）アリコートを作成し、-80℃でアリコートを保存し、解凍した。
   1. ECMSでプレートをプレコートすると、氷の上に細胞外マトリックス溶液（ECMS）を解凍し、アリコート。氷上で200：1の比率でECMS、氷冷DMEM / F12培地を混合する。時期尚早ECMSの固化を防止するために、冷静さを保つ。
3. インスリン媒体なしRPMI / B27については、RPMI培地500ml中にB27マイナスインスリンの10ミリリットルを追加します。
4. 培地（インスリン）RPMI / B27については、insuliで（B27サプリメントの10ミリリットルを追加n）およびRPMI培地を500mlにペンストレプトマイシン抗生物質を5ml。
5. 低グルコース培地では、グルコースを含まないRPMI培地500ml中にペン連鎖球菌の抗生物質のB27サプリメントの10ミリリットルと5ミリリットルを追加します。
6. 1の比率：凍結/凍結保存培地の場合は、9位のジメチルスルホキシド（DMSO）と一緒にウシ胎児血清をミックス。凍結培地を4℃で1ヶ月まで保存することができる。
   注：すべてのメディアは、ろ過し、保​​存され、4℃で、指定がない限り、2週間以内に使用する必要があります。特に断らない限り、以下で使用される全ての試薬/溶液体積は、6ウェルプレート中で単一のウェルのために意図されている。

ECMS 2.プレコーティング6ウェルプレート

1. 次に、6ウェルプレートを各ウェルにたてECMS 2mlの適用、200：1の比で氷冷DMEM / F12培地（ 例えば 、マトリゲル）基底膜マトリックスを混合することによりECMSを行う。 6ウェルプレート中でそれぞれが約90 mgのECMを受信します。
2. ECMをインキュベートSは、37℃で1時間プレートをコーティングした。直前に各ウェルから細胞、吸引DMEM / F12液をメッキする。次いで、プレートを、細胞を受信できるようになります。

3.解凍冷凍hiPSCs

注：それは、最適な培養および凍結/解凍サイクル以下のhiPSC-CMSへのhiPSCsの下流分化につながる可能性が密接に、この手順に従ってください。

1. 6ウェルプレートの各ウェルについてhiPSCsの1バイアルを解凍する。各バイアルのためのROCK阻害剤（10μM）と冷たいE8培地9mlで15ミリリットルコニカルチューブを準備します。 ROCK阻害剤は、凍結保存¹⁰以下のhiPSCsの生存率を改善する。約5mm直径の氷結晶が残されるまで、細胞を融解し、37℃の水浴中でバイアルを維持。
2. 70％エタノールバイアルの外側をスプレー。無菌層フードにそれらを移動する前にティッシュペーパーとのバイアルを拭きます。
3. 準備されたコニカルチューブに細胞を移す。 Tをすすぐ彼はE8の培地500μlで一度バイアルと同じ円錐管に解凍した細胞を含む培地を転送する。 200×gで4分間、室温で遠心する。
4. 遠心分離後、上清を吸引し、軽くROCK阻害剤（10μM）とE8培地2mlで細胞ペレットを再懸濁します。 ECMSでプレコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに再懸濁した細胞を移す。
5. 培養24時間後にROCK阻害することなく、E8媒体とのメディアを交換してください。細胞は、この時点で接着している必要があります。

hiPSCsの4継代

1. 典型的には、6ウェルプレート中の75％-80％の集密度に達した後通路hiPSCs。培養液を吸引除去する。すぐに無菌の1ミリリットル、RT PBSでウェルを洗浄。吸引するPBS。
   1. 0.5 mMのEDTAまたは1x細胞分離液（ 例えば 、のAccutase）の500μl加え、室温で1-7分間インキュベートする。 EDTAのインキュベーションのための適切な時間は、hiPSCラインに応じて変化する。目に見えるカーリングOを期待これは、EDTAまたは細胞剥離溶液を除去する準備ができていることを示すようにエッジの周りコロニーのr個の肥厚。
2. EDTAまたは細胞分離液を吸引除去する。 10μMのROCK阻害剤を補充したE8培地の1ミリリットルを追加します。繰り返しピペッティングとP1000ピペットでコロニーをオフに噴霧することにより、ウェルのhiPSCコロニーを変位。コロニーは終了後の5〜10細胞塊に分割する必要があります。
3. 15ミリリットルの円錐管にROCK阻害剤とE8媒体1mlに懸濁されたコロニーを移す。
4. E8媒体中の小さな塊に大きな細胞塊を破砕。細胞を希釈し、細胞懸濁液を阻害剤とE8メディア​​の適切なボリュームを追加する。希釈に追加するメディアボリュームは細胞密度に依存し、ウェルの数は、播種する。理想的には、hiPSCsのシングル、80％コンフルエント井戸1:12に希釈されるべきである。
   1. CEの既存の1mlにROCK阻害剤を用いた11ミリリットルE8培地を追加前述の15mlコニカルチューブ中でllの溶液を、1：12希釈物を得る。
5. さらに（各フラグメントで約50-200の細胞がベストです）小細胞断片に細胞塊を粉砕する。これは細胞の生存を減少させるので避け過粉砕する。
6. 吸引除去前のコーティングされたプレートからECMS、各ウェルに再懸濁した細胞の2ミリリットルを追加します。 6ウェルプレートのウェルあたり約100,000個の細胞が理想的である。ウェルの中央に細胞のクラスタリングを回避するためにも周りに均等に細胞を分配することを目指しています。
7. 培養24時間後、ROCK阻害することなく、E8培地で培地を交換してください。細胞が80％コンフルエントになるまで培養液を24時間毎に変更します。その後、細胞を再び通過に対する準備ができている。これは、通常80％の密集度に到達するための通路の間に3-6日かかります。

5.凍結のhiPSCs

注：それは、最適な培養およびヒップの下流分化につながる可能性が密接に、この手順に従ってください凍結/解凍サイクル以下のhiPSC-CMSへのSC。

1. 細胞株名、細胞型、継代数、および凍結日付極低温管にラベルを付ける。一般的なガイドラインとして、6ウェルプレートの各ウェルに1つのバイアルを使用します。 ROCK阻害剤（10μM）とE8培地9mlで満たされた15ミリリットルコニカルチューブを準備します。 90％のFBSおよび10％DMSOで凍結培地を準備し、そして使用するまで4℃で培地を維持する。
2. 培養培地を吸引500 0.5mMのEDTAμlのまたは1xの細胞剥離溶液を添加し、室温で2~7分間インキュベートする。 EDTAまたは細胞剥離溶液の暴露時間は、細胞株、細胞株ごとに異なる​​。
3. 吸引し、EDTAまたは細胞剥離液。 E8培地の1ミリリットルを追加します。
4. ピペッティングとP1000ピペットでコロニーをオフに噴霧することにより、ウェルのhiPSCコロニーを変位。コロニーはより小さい100細胞塊に分割すべきではありません。 E8を含む準備されたコニカルチューブに懸濁した細胞を転送します。 Rでの遠心機T 200×gで4分間。
5. 上清を吸引し、ペレットに冷たい凍結培地500μlを添加する。一から二回ピペッティングしてペレットを再懸濁。細胞生存は、大きな塊で細胞を維持することによって改善される。
6. ラベル極低温チューブに再懸濁した細胞を転送します。すぐに徐々に冷却を可能にする冷凍コンテナ含むイソプロパノール、にバイアルを移動する。長期保存のために液体窒素に細胞を転送した後、24時間-80℃で細胞を容器に保管してください。

人間のIPSCの6.心臓分化

注：追加された場合は、すべてのメディアは、少なくとも室温であるべきである。

1. EDTAまたは1x細胞分離液と解離した後、約10万分化のためのECMSコーティングした6ウェル培養プレート上の人間のiPS細胞（細胞継代手順と同じ手順を）シード。細胞が85％コンフルエントに達したときに、6を有するインスリン媒体なしRPMI / B27に培地を変更μMGSK3ベータ阻害剤CHIR99021（CHIR）と48時間維持する。
2. 48時間後、インスリン媒体を含まないRPMI / B27とCHIR-含む培養液を交換して（3日目まで）24時間放置。
3. 3日目に、5μMWntシグナル阻害剤IWR1とインスリンないRPMI / B27にメディアを変更し、（5日目まで）48時間維持する。
   注：以前の研究¹¹に記載のWnt阻害はまた、他の小分子化合物を使用して試みることができる。 IWR1は、それが¹¹ Wnt ^シグナル伝達を阻害するのに有効であることが示された増加した範囲に起因する他の小分子Wntシグナル伝達阻害剤の上に選択した。
4. 5日目に、インスリン媒体なしにバックRPMI / B27にメディアを変更し、（7日目まで）48時間に向けて出発。
5. 7日目では、（インスリン）RPMI / B27培地で培地を交換し、同じ培地で3日ごとに、その後培地を交換してください。心筋細胞の自発的な鼓動は、初日に約8日目で見えるはずです10。

グルコース飢餓を通じて人間の心筋細胞の7精製

1. 10日分化後に、2mlまで6ウェルプレートの各ウェルに、低グルコース培地に培地を変更し、3日間（13日まで）を、この培地中で細胞を維持する。
2. 13日目では、（インスリン）RPMI / B27培地に細胞を戻す。
3. 必要に応じて、グルコース飢餓時の非心筋細胞のより容易に解離を可能に、培養プレートから非心筋細胞を緩める助けるためにグルコース飢餓の第二ラウンドの前に心筋細胞をreplate。
   1. 13日目、吸引培地で、PBSで一回洗浄し、37℃で5分間、細胞解離酵素を500μlを用いて、単一細胞への細胞を解離する。具体的には、酵素処理の5分後に、手動で繰り返し細胞解離酵素を引き上げcardiomyoに対してそれを噴霧することにより、6ウェルプレートから心筋細胞を解離1,00​​0μlのピペットを使用してcyte単分子層。最大30分注繰り返しが単一細胞に心筋細胞を解離するために必要な場合があります。
   2. 細胞を解離させ、単一細胞形態であるした後、200×gで4分間、細胞解離酵素および遠心分離機を希釈するためにインスリンをRPMI / B27培地5mlを充填した15ミリリットルの円錐管にすべての細胞を回収する。吸引し、上清を捨てる。
   3. 新しいECMSコーティングした6ウェルプレートに2ミリリットルRPMI / B27培地プレートで細胞を再懸濁する。一般的には、心筋細胞の高い集密度は、再播種時の細胞の生存に役立ちます。再播種時に最適な生存のための新たな6ウェルディッシュあたり2万個の細胞をreplateを目指す。
4. 14日目に、第二グルコース欠乏サイクルのためにバック低グルコース培地2mlにメディアを変更します。文化3日間以上、この低血糖状態にある細胞。非心筋細胞のほとんどは、この低グルコース培養状態で死んでしまう。
5. 17日目では、Rの中に2ミリリットルを変更インスリンとのPMI / B27培地。残りの細胞は、高度に精製された心筋細胞になります。これらの心筋細胞は、遺伝子発現分析、薬物スクリーニング、代謝分析、および他の様々な下流アッセイのために使用され得る。

結果

hiPSC分化の間の形態学的変化。

無フィーダープレートで培養hiPSCはフラット、二次元のコロニーとして成長した。約85％コンフルエントに達すると、hiPSCs分化6μMCHIR（ 図1A）で処理した。細胞死の実質的な量の、正常および共通の現象は、CHIR処置の24時間後に観察された。 CHIR治療の2日後、hiPSCsは中胚葉の運命に分化し続けた。 hiPSCコロニー中の細胞と比較して、これらの2日目細胞の細胞サイズが増大した。細胞数は、細胞分裂（ 図1B）を介して増加した。 5日目に、中胚葉細胞は、心臓系統（心臓中胚葉）に向けた。このとき、細胞が凝集特性、分岐状構造（ 図1C）を形成し始める。 10日目に、枝状構造は非常に顕著であった、と心筋細胞の星テッドは自然発生的に（ 図1D）を破って。末端分化心筋細胞は、この点を超えて増殖することはありません。分化プロトコルのタイムラインは、 図2

ディスカッション

高度に精製されたhiPSC由来の心筋細胞を大量に取得することは基本的な心臓の研究だけでなく、臨床および翻訳アプリケーションのために重要である。心臓分化プロトコルは、心原性成長を利用し、胚様体に基づく方法からの移行はサンドイッチ法^12をマトリックスへの^、2因子 、および最終的に小分子変調単層ベースの方法⁵に、近年の大幅な改善を経験した。上記のプロトコルの、ここで説明するプロトコルは、小分子CHIRとIWR ^5,7を使用したWnt /βカテニンシグナル伝達を調節することにより、最高と異なるhiPSC細胞株のための最も再現性の心臓分化効率を示した。具体的には、未分化hiPSCsは、Wntシグナル伝達阻害剤IWR1とGSK3ベータ阻害剤CHIRおよびその後の心臓分化の中胚葉分化を受けるように誘導した。これらの連続した​​工程心臓系統の誘導期の間、インスリン欠乏によって補助Wntシグナル伝達の変調は、非常に効率的な心臓分化につながった。 CHIR中胚葉誘導のために使用される一般的な小分子GSK3ベータ阻害剤であるが、GSK3-βの阻害のための他の小分子は、心筋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マトリゲル (9-12 mg/ml)	BD Biosciences	354277
RPMI 培地	Invitrogen	11835055
グルコースフリー RPMI 培地	Invitrogen	11879-020
B27 マイナス インスリン	A1895601
B27 サプリメント (インスリン付き)	Invitrogen	17504-044
連鎖球菌感染症	Invitrogen	15140122
ウシ胎児血清	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell	Lifter Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011