の同期カウロバクターCrescentus細菌細胞周期の調査のため

サマリー

細菌細胞の同期は、細菌の細胞周期と発生の研究に不可欠です。 Caulobacter crescentusは、密度遠心分離によって同期可能であり、細菌細胞周期の研究に迅速かつ強力なツールを提供します。 ここでは、Caulobacter細胞の同期に関する詳細なプロトコールを提供します。

要約

細胞周期は、すべての細胞の成長、ゲノム複製、および発生にとって重要です。 細菌では、細胞周期の研究は主に同期していない細胞に焦点を当てており、細胞周期の進行、ゲノム複製、分裂に必要な時間的イベントを順序付けることが困難になっています。 Caulobacter crescentusは、密度遠心分離によりG0状態で細胞を迅速に同期させることができる、細菌細胞周期の優れたモデルシステムを提供します。 細胞周期同期実験は、染色体の複製と分配を支配する分子イベントの確立、細胞周期の進行を制御する遺伝的調節ネットワークのマッピング、および非対称細胞分裂に必要な極性シグナル伝達複合体の確立を特定するために使用されてきました。 ここでは、Caulobacter NA1000細胞の迅速な同期のための詳細なプロトコールを提供します。 同期は、遺伝子発現プロファイリングやウェスタンブロットアッセイ用の大規模フォーマットだけでなく、顕微鏡検査やFACSアッセイ用の小規模フォーマットでも実行できます。 Caulobacterの迅速な同期性と高い細胞収量により、この生物は細菌の細胞周期の研究のための強力なモデルシステムとなっています。

概要

細菌の細胞周期は、ゲノムの複製と娘細胞の分裂の両方を制御する。抗生物質耐性は、公衆の健康に成長している脅威であるとして重要なのは、細菌の細胞周期は、抗生物質開発のための未開発の目標を提示します。

細菌カウロバクターcrescentusでは、各細胞周期の異なる運命（ 図^1A）1,2の2つの娘細胞を生じる、非対称分裂に導く。 One娘細胞は鞭毛を継承し、他の娘は茎を継承し、固着されている間運動性である。集積回路の遺伝子は、転写調節、リン酸化シグナル伝達、およびタンパク質分解規制³ことによって、細胞周期の進行および細胞の運命を制御する。また、染色体複製と同時分離は、第⁴染色体の正確に一つのコピーを含む娘細胞が得られる。重要なことに、これらの2つの細胞型は急速COLLOによって分離することができる高収率（ 図1B）を有する集団の残りからswarmer細胞の単離を可能にする同期可能NA1000株^5-7 idalシリカ粒子の密度遠心分離。細胞s​​warmer分離された後、非対称細胞分裂を通じて同期的に進む。ここでは、詳細プロトコルは、 カウロバクター株 NA1000を同期させるために使用される。私たちは、プロトコルおよび大規模および小規模の両方の同期のための一般的なトラブルシューティングのヒントを提供する。この実験手順は、 カウロバクター細胞周期と細胞の運命の時空間制御を調べるための強力なツールを提供します。

プロトコル

1.大規模同期性 - ウエスタンブロット、マイクロアレイ/ RNA-SEQ、およびその他素材集中アッセイに最適

1. 冷凍庫ストック又はプレートから、PYE培地で28℃で振とうすることにより歪NA1000の5ミリリットルO / N培養を成長。
2. M2Gの25ミリリットル（表1-2）に、ステップ1からの細胞の0.5ミリリットルを接種し、培養が0.5と0.6の間のOD ₆₀₀に_達するまで28℃で振る。
3. M2Gの1リットル中に細胞を接種し、28℃で振る。
4. OD _600が 0.5〜0.6に達すると、液体取り付けられた位相差顕微鏡を用いて細胞swarmerの存在を確認する。位相差顕微鏡によってスライドガラス上の細胞の1μlを、カバーガラスで覆い、スポット、および画像。人口が急速に泳いで細胞を視覚化することによってswarmer細胞の存在を確認してください。
5. JA-10ローターで4℃で7 kxgで15分間細胞をスピン。
6. 上清を捨て、冷たいM2（表1-2）の180ミリリットルを加え、穏やかにresは血清学的ピペットを使用してすべてのセルをuspend。緩くペレット化した細胞を捨てる。彼らはpredivisionalとストーカー細胞である。
7. 冷たいコロイダルシリカ溶液の60ミリリットルを加え、よく細胞懸濁液を混ぜる（よく細胞に添加する前にコロイダルシリカ懸濁液を混在してください）​​。
8. 8 30ミリリットルチューブに細胞懸濁液を注ぎ、JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで30分間スピン。
   注：Oneは、2つの異なるバンドが表示されるはずです。ストーカー/ predivisional細胞は、トップバンド（ 図1B）にいる間swarmer帯は下のバンドである。
9. 慎重にトップバンドをオフに吸引し、swarmerバンド（下のバンド）上記〜1 cmの液体を除去する。
10. パスツールピペットを用いて（クリティカル）、慎重にswarmerバンドを削除して、清潔なチューブに配置します。 JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで10分間コロイダルシリカ、トップ冷たいM2とチューブオフとスピンを洗い流す。
11. 注意深く上清を破棄し、再懸濁JA-20ローターで冷たいM2の20ミリリットルと、4℃で6.4 kxgで10分間スピンのセル。
12. コールドM2 30mlの中に全てのペレットを再懸濁し、分光光度計を用いてOD _600を測定し、冷M2培地を用いてブランク。 swarmer細胞を確認するために位相イメージングのための1μLを保存します。細胞90〜95％がswarmersでなければなりません。
13. JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで5分間、細胞をスピンダウン。 28℃M2G培地中の細胞を再懸濁A ₆₀₀になるように_{、〜0.3〜0.4}と28℃で振とうを開始。
    注：典型的な収量は30と同期していない細胞の1Lからswarmer細胞培養の60mLの間にある。
14. ^8,9（野生型の文化が分裂するのに約135〜140分かかります）の時点を取って開始します。各時点で、OD _600を測定する。分割後のOD _600が約2倍初期OD ₆₀₀であることを確認してください。
15. ウェスタンブロットまたは遺伝子発現アッセイのために、立方1mLのアリコートを除去所望の時点でlture、30秒間、卓上遠心分離機において最大速度でスピンダウンし、急速に培地をデカントまたは吸引し、フラッシュは、液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。下流の分析まで-80℃で細胞を保管してください。

2.小​​規模同期性 - 顕微鏡用に最適

1. 冷凍庫ストック又はプレートから、M2Gに28℃で振とう5ミリリットルO / N培養を成長。
2. M2G（表1-2）15mlに希釈し、中期対数（OD ₆₀₀ = 0.5〜0.6）になるまで成長する。
3. JA-20ローター中で4℃で10分間6.4 kxgでスピンし、1ミリリットル中に再懸濁冷たいM2（表1-2）と2 mlのマイクロ遠心チューブに移す。
4. 上清を吸引し、細胞をペレットにマイクロ遠心チューブ中で3分間15 kxgでのスピンは、冷たいM2の900μlの氷の上でペレット、再懸濁を置く。
5. マイクで4℃で15 kxgで20分間、コロイダルシリカとスピンコーティングされた冷たいPVP900μlのを追加します。rocentrifugeチューブ。
6. （クリティカル）を吸引したり、トップを切っピペット/ predivisional細胞バンドをストーカーして、新しいマイクロ遠心チューブにバンドswarmer底に集める。
7. 3分間15 kxgで遠心分離しながら、冷たいM2の1ミリリットル中swarmer細胞を2回洗浄します。
8. 最後のスピンの前に、予備冷却した1mlのガラス試験管に細胞を移動し、M2のブランクと比較した細胞のOD _600を測定する。
9. 0.4及び28℃/ロール細胞を振る - 0.3の間ODで28℃、M2Gに最終的な細胞ペレットを再懸濁。
   注：典型的な収量はswarmer細胞培養の2および4 mlの間である。
10. 顕微鏡実験のために、所望の時間にポイントがイメージングのためM2Gアガロースパッド上に細胞を1μLを置く。

結果

より高い密度を有するswarmerバンド、およびより低い密度のストーカー/ predivisionalセル帯域：同期は、典型的には、セルの二つのバンド（ 図1B）が得られる。効率的な同期を確実にするために共通のコントロールがOD _600を監視し、異なる細胞周期の時点でウエスタンブロットによりCTRAタンパク質のレベルを測定することを含む。 OD _600は、細胞周期（ 図2）の過程で約2倍に増やす必要があります。細胞周期のマスターレギュレーターCTRAためのウェスタンブロットは、良好な同期（ 図2）を確認するための有用な制御である。 CTRAは、DNA複製をブロックするswarmerセルに利用され、DNA複製¹⁰の開始時に分解される。 CTRAは、その後、細胞周期における合成し、鞭毛^11,12の多くの構成要素を含む発生遺伝子の宿主の転写を活性化する。成功した同期は、Tを持つことになりますCTRAタンパク質レベルの彼の振動パターン。

ディスカッション

細菌の細胞周期は生命の基本的なプロセスであり、成長の研究や次世代抗生物質の標的として重要です。ここでは、細菌の細胞周期と非対称細胞分裂を研究するためのモデル生物である C. crescentus NA1000の迅速な同期手順について詳しく説明しました。 この方法は、細菌の細胞周期の時空間調節を調査するために、ウェスタンブロット、遺伝子発現プロファイリング、および蛍光顕微鏡アッセイに修正可能です。

このプロトコルは迅速で、健康な同期細胞を生成します。 他の同期方法は、細胞の長い飢餓を必要とし、細胞周期を同じ状態で停止させるための厳密な応答に依存し、対数増殖 ¹³の培養物とは異なる細胞をもたらします。 「ベビーマシン」 やその他の表面付着方法が成功裏に使用されていますが^14,15、それらは通常、同期されたセルの収量が低くなります。 ここで紹介する密度遠心分離プロトコルは、同期したC .クレセント NA1000スウォーマー細胞のより高い純度と収量を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PVPコーティングコロイダルシリカ(パーコール)	Sigma-Aldrich	P4937
コロイダルシリカ(Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 ローター	ベックマン・コールター	369687
JA20 ローター	ベックマン・コールター	334831
硫酸第一鉄キレート溶液	Sigma-Aldrich	F0518
30 mlの遠心分離機の管	のコーニング	8445
Na2HPO4	>EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	アムレスコ	0621-500g