マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

Summary

Cold Plantar Assay (CPA)は、30°Cから5°Cの間の寒冷反応性を測定し、また、寒冷適応を測定することもできます。このプロトコルでは、CPAを使用してマウスの冷え性過敏症、鎮痛、および適応を測定する方法について説明します。

Abstract

寒冷過敏症は深刻な臨床問題であり、広範な患者の一部に影響を及ぼし、生活の質の大幅な低下を引き起こします。 コールド足底アッセイは、マウスの冷感感受性を客観的かつ安価に評価することを可能にし、鎮痛と過敏症の両方を定量化することができます。 マウスはガラス板に順応し、圧縮されたドライアイスペレットを後足の下のガラス表面に保持します。 冷却ガラスから引き抜かれるまでの待ち時間は、冷感感受性の尺度として使用されます。

寒さは、季節的な温度変化のある地域で生き残るためにも重要であり、感度を維持するためには、動物が周囲温度に一致するように熱反応の閾値を調整できなければなりません。Cold Plantar Assay(CPA)は、30°Cから5°Cの範囲の温度でマウスの寒さ感受性をテストすることにより、周囲温度の変化への適応の研究も可能にします。 マウスは上記のように順応しますが、ガラス板は、お湯、湿った氷、またはドライアイスで満たされたアルミニウムボックス(またはアルミホイルパケット)を使用して所望の開始温度に冷却されます。 プレートの温度は、フィラメントT型熱電対プローブを使用して中央で測定されます。 プレートが所望の開始温度に達すると、動物は上記のように試験されます。

このアッセイは、無害なものから有害なものまで、さまざまな温度でマウスを試験することを可能にします。CPAは、無傷のマウスで明確で一貫した行動反応をもたらし、過敏症と鎮痛の両方を定量化するために使用できます。このプロトコルでは、CPAを使用してマウスの冷え性過敏症、鎮痛、および適応を測定する方法について説明します。

Introduction

げっ歯類で冷たい反応性を測定することは、正常および病的両方の条件下で、ヒトにおける低温感受性の潜在的なメカニズムの理解を改善するのに重要である。コールド足底アッセイ（CPA）、もともと数年前に^1を開発し、RTで配信寒冷刺激に再現可能な、明確なネズミ行動反応を生成するように設計されています。このアッセイのより最近の強化は、温度が²の広い範囲での低温感受性の再現性のある測定を可能にしてきた。どちらのバージョンも、比較的高いスループット、および使用する安価であるように設計されている。

大きな進歩は、他の行動の方法を使用して低温感受性のメカニズムを理解する上でなされた。一つの方法は、軽くたたくまたは噴霧アセトンをマウスの足に、マウスが足^{3,4フリック}費やす時間の量を測定することを含むアセトンの蒸発試験である。残念ながら、アセトンの蒸発に対する応答は、湿式感覚とアセトンの匂いによって混乱している。また、アセトンの蒸発試験に適用される冷熱刺激を印加アセトンの量に基づいて変化し、定量化が困難であることができる。最後に、無傷のマウスは、ベースライン時にアセトンに最小限の応答を持っていることは不可能この方法で過敏症が存在しない場合に鎮痛を測定すること。

冷応答のための別の古典的なアッセイは、テール冷水^5,6に浸漬された後に撤退する待ち時間が測定されるテイルフリックアッセイである。このアッセイにおける行動応答があいまいであり、アッセイは、特定の温度に対する応答を測定している間、動物は、十分に記載ストレス誘発鎮痛メカニズム⁷を通じて冷たい応答性を変えることができ、試験中に拘束されなければならない。

もう一つの一般的に使用されるツールは、行動を測定コールドプレート試験であり、彼らはペルチェ冷却板^8-10上に置かれた後のマウスの応答。このツールは、特定の温度での動物の応答に関する情報を提供していますが、それはまた、一貫性なく使用されてきた。別のグループは、ジャンプ^8,11数、最初の応答^{8,11- 13}に待ち時間を含む応答の異なるタイプを測定して、足の数は非常に異なる結果を^11,13,14を持ち上げる。コー​​ルドプレートアッセイはまた、一度に試験することができる唯一の​​動物のような比較的低いスループットであり、それは高価で脆弱なペルチェ素子を必要とする。

2プレート温度嗜好試験は、動物が、異なる温度^{9,15- 17}の2接続プレートに費やす時間の相対量を測定するコールドプレート試験の一般的に使用される誘導体である。別の類似の一般的に使用されるアッセイは、熱勾配アッセイ、マウスは、異なる温度帯で過ごす時間の量である長い金属板上に5°Cと45°Cの範囲では^16を測定する。これらのアッセイは、温度の比較を可能にしながら、それは行動が温度嫌悪や温度の好みにを表すかどうかは不明である。

最後に、動的コールドプレートアッセイは、マウスは、周囲温度^18の変化に対応するかを測定するために使用されてきた。この方法は、RTペルチェ素子にマウスを置き、マウスがジャンプしたり、異なるプレート温度で彼らの足をなめるどの程度測定しながら、1℃にそれをランプダウンが含まれます。これはマウスが冷却環境に適応する方法をテストが、それはマウスがクーラー周囲温度の設定で冷たい刺激に反応するかテストするための方法を提供していません。さらに、それは実行するために高価な設備を必要とし、その低温感受性を測定する前に検査機器にマウスを順応する方法を提供していません。

これらのアッセイを補完するために、CPAはacclimaをテストテッド温度範囲において、種々の明確に定義された冷刺激に対する応答、または冷たい周囲温度に適応する過程。これは、安価に高スループットテストのためにスケールアップされる可能性を、私たちの現在の装置との時間で14匹のマウスまでテストすることができます。

Protocol

すべてのマウスプロトコルは、健康のガイドラインの国立研究所に従ったとワシントン大学医学部の動物実験委員会（ミズーリ州セントルイス）によって承認された。

1.テストプレートとエンクロージャの準備

1. ガラス表面をきれい。
2. 実験用テープでガラス板の中央に表面にT型フィラメント熱電対プローブを固定する。
3. プレートの中央に沿って一列にガラス板上の動物のエンクロージャを置きます。
4. 中央動物囲いを通して熱電対プローブを通し、データロガーに接続します。自動シャットダウン機能を無効化しながら、上のデータロガーの電源を入れ、付属のケーブルでコンピュータにデータロガーを添付。
   1. 実験中のプレート温度を記録する場合は、プレート温度の記録を開始するために、データロガーソフトウェアを開きます。
   2. 必要であれば、再ソフトウェアを調整コー​​ドプレート温度を一度毎秒。
   3. 熱データロガーでパッケージソフトを使用して温度の記録を開始。
5. マウスとの間の視覚的相互作用を防止するために、黒挿入物を有する筐体を区切ります。
6. 位置は、エンクロージャの下面が快適着座位置から見えるようにガラスの下に反映しています。

2.温暖化/ガラス板を冷却

1. 温め、水、湿潤氷またはドライアイスアルミニウムボックスを充填し、ガラス板上に適切に配置する（ドライアイスを充填したアルミ箔のパケットは、ガラスを冷却するために使用することができ、 図^1）2。
   1. 30℃でのテストでは、離れて、動物のエンクロージャ（ 図^2B）2から「約0.25」アルミボックスを配置します。
      1. ガラス板の両側に加熱された水循環器を設定する。 45にサーキュレータを設定 - 60°C、と私たちお湯（ 図^1C）2の安定した流れでアルミボックスを埋めるために、それをメール。
      2. サーキュレータを配置し、アルミニウムボックスからお湯を直接戻ってそれぞれの側（ 図1C）上のサーキュレータの貯水池に排出すること^2。
   2. RTでのテストのために、（ 図^2）2空のボックスを残す。
   3. 17℃でのテストでは、いずれかの側に離れて、動物のエンクロージャから'' 0.25約の箱を置き、湿った氷（ 図^2）2で満たす。
   4. 12℃でのテストでは、離れて両側の筐体から'' 1.25約の箱を置き、ドライアイス（ 図^2）2で満たす。
   5. （ 図2）5℃でのテストでは、約0.25 ''離れていずれかの側の筐体からのボックスを配置し、ドライアイスで埋める^2。
      1. ドライアイスを用いてガラスを冷却すると、部屋中のCO ₂の蓄積を防止するのに十分な換気があることを確認してください。
2. 所望の温度範囲に到達するためにガラスのを待ちます。
3. プレート上のエンクロージャにマウスを追加します。
   注記：白色雑音発生器は、ノイズ障害を減少させるために使用することができる。
4. マウスが順応するのを待ちます。
   注：私たちの施設では、これはおよそ2.5時間かかりますが、これは、動物の収容及び取扱い条件に基づいて大幅に異なる場合があります。
5. ボックスは温め水、湿った氷、またはドライアイスの完全に保たれていることを確実にすることにより、所望の温度範囲でガラスを維持します。
   注：私たちの装置では箱が氷おおよそすべての90分を再充填する必要がある。
   注：17℃の条件では、それは氷でそれを再充填する前に排水孔を通じてアルミボックスからほとんどの水を空にしておくと便利です。これは、より良い温度を安定し、PRしますイベントのオーバーフロー
   注：ドライアイスの正確な量は季節変化するが、一般に温度を一定に維持するボックスの全長に沿って完全以上のボックスを¼保ちます。

3.固定温度でのマウスのテスト

1. 行動の部屋の外では、ドライアイスの完全な約半分のアイスバケツを埋める。
2. ハンマーやマレットを使用して、微粉末にドライアイスを粉砕。
   注：バケツを過剰充填することは、困難な完全に粉末にドライアイスを粉砕するようになります。
3. ストレートカミソリの刃やはさみを使って、3ミリリットル注射器をトップを遮断。
4. 21 G針を使用して、シリンジ（6穴の合計）の両側に3つの穴を突く。
   注：これらの穴は、ドライアイスを圧縮しながら昇華により発生する圧力が減少します。カットオフ注射器は、複数の実験のために再利用することができる。
5. 注射器、ドライアイス粉末、および行動部屋に手持ち式ストップウォッチを取る。
6. ドライアイス粉末の半分シリンジ室を埋める。フラットオブジェクトに対して注射器の切断端を持ち、しっかりとプランジャーを用いた粉末を圧縮する。注意してください;プラスチック製のプランジャーは、曲げや圧力から破損する可能性があります。このような場合は、新しい注射器からプランジャーを交換してください。
7. 注射器の端を超えて圧縮されたドライアイスペレットの先端を拡張します。
8. 安静時に完全にある試験マウス。
   1. 30℃、23℃、17℃では、すべての4ガラス上の足としないを持って試験マウスは動くが^、19完全に眠っていない。
   2. 12℃、5℃で、移動やジャンプ2足または4足としない上に試験マウス。
9. マウスの後肢（ 図^1A）2の下にガラス面に対して平らペレットフラッシュを押して慎重にしっかり、ターゲティングのためにミラーを使用。手タイマーを起動します。
10. タイマーを停止し、マウスが離れて冷却されたガラスから移動したときのペレットを削除します。
    NOTE：撤退運動が垂直または水平であることができる。
    1. マウスは非常に簡単に足を移動し、冷却面にそれを返す場合、マウスが離れて完全移籍するまで、タイミングと刺激を続ける。
       注：私たちの研究室では、ほとんどの場合において、マウスのための20秒の最大刺激時間を使用しています。
11. 各動物の各足に少なくとも3つの値が収集されるまで、このテスト手順を繰り返します。少なくとも15分までに、任意の単一の足に少なくとも7分であり、個別の連続した​​試験により、同じマウスの反対の足をテストする個別の試験。
12. 必要に応じて、（ 図^3）1の^冷却速度の違いを生成するために、ガラスの異なる厚さを使用する。
    注：冷却速度が反比例ガラスの厚さと相関している。

4.低温適応中にマウスのテスト

注：これはガラスPLATとしてテストを可能にする別のプロトコルですeはむしろプレートが安定したとマウスが完全に寒冷環境に適応した後も、冷却される。

1. 装置をセットアップするための第1節に記載されている指示に従ってください。
2. RT（ 図^7A）2でベースライン測定を行うためにセクション3に記載されている指示に従ってください。
3. ドライアイス入りのアルミボックスを事前に冷却する。
4. ベースライン引っ込め潜伏時間が測定された後、離れてエンクロージャから両側にプレート約1.25 ''に予め冷却ボックスを配置する（ 図7（a）は、矢印がラベル「ドライアイスを追加^」）2。
5. できるだけ頻繁に測定を行う、ガラス板を冷却するように測定を行う第3節に記載されている指示に従ってください。

Results

30°C、23°C、17°C、12°Cで開始されたマウスから誘発される行動反応は、再現性の高い（ 図^4A）20である。後足の下に生成された冷熱刺激を測定するために、マウスをケタミン/キシラジン/アセプロマジンのカクテルで麻酔し、それらの足をT型フィラメントの熱電対（ 図^4B）20の上にガラス上に固定した。ガラスは、所望の検査範囲に冷却または加温した。プレートは、プレート（ 図^5A）2の長さに沿って均一に冷却されるが、それはコールド勾配が動作エンクロージャ（ 図^5B）2の両端に発生していることに留意すべきである。中央部分（ 図^5B）2少し暖かいいる間エンクロージャの両側にドライアイスに近い筐体の部分は、冷却器である。寒い気温のUSED、マウスは、筐体の中央部分に自分の時間の大半を費やしています。ガラス板の温度が安定したところで、...

Discussion

CPAは、マウスの寒冷感受性と寒冷適応を評価するために使用できます。 これは、さまざまな温度範囲で、拘束されていない順応した動物の寒冷反応を測定するための手頃な価格で効率的な方法を提供します。 また、簡単に定量化および分析できる出力変数により、明確な行動応答を提供します。 炎症¹、神経因性損傷¹、鎮痛薬¹、遺伝子ノックアウト²⁰、および遺伝的ニューロン アブレーション研究²⁶ によって引き起こされる冷感症の変化を評価するためにすでに使用されています。 さまざまな厚さのガラスを使用してさまざまな冷却速度に対する応答を測定するように変更でき、さまざまなサイズのシリンジを使用して適用される冷刺激のサイズを変更できます。

このアッセイを適切に実行するための最も重要なステップは、テスト中にガラス板を均一に冷却または加熱することです。アルミニウム製の箱を動物の囲いの両側に等間隔で配置するように慎重に配置すると、より均一な温度を生成するのに役立ちます。 実験間のアルミニウムボックス...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
T型熱電対プローブ	Physitemp	IT-24p	ガラスの表面温度測定に使用(http://www.physitemp.com/products/probesandwire/ ガラス
板	地元のガラス会社(セントルイス、Stemmerich Inc)		でパイレックスガラス(ホウケイ酸フロート)を使用しています。私たちの研究室では一般的に1/4インチを使用していますが、3/16インチと1/8インチも便利な
サーマルデータロガー	Extech	EA15	サーモロガー ガラスの温度を追跡します (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3mlシリンジ	BD	309657	上部が切り取られ、ドライアイスがシリンジで圧縮されてコールドプローブ
コンピューター	が生成されますExtechのloggerを使用して、セント
			各ボックスの底部近くに、1/2インチの穴が各ボックスの1つの短辺に開けられています。これらの穴は、箱が濡れた氷またはお湯で満たされると、ゴム製の活栓で満たされます。
温水サーキュレーター	VWR		ポンプ付きの任意の水サーキュレーターモデルが機能します
21Gニードル	BD	305165	正確な針のサイズは重要ではありません
ハンドタイマー	ハンドタイマー
ミラー			フラットミラーは機能します