細菌のトランスクリプトーム解析ケーススタディのための高速かつ信頼性の高いパイプライン：セリン依存の遺伝子調節に肺炎球菌

サマリー

この原稿は、DNAマイクロアレイによって提供される最先端の技術の使用について説明しています。マイクロアレイは、特定の条件下で発生する細菌のトランスクリプトーム変化の概要を提供します。さらに、便利な自社開発のソフトウェアパッケージを使用して大量のデータを簡単に分析できることを強調しています。

要約

遺伝子発現とその調節は、異なる条件下での細胞の挙動を理解することが非常に重要である。様々な技術は、遺伝子発現を研究するために、今日使用されているが、ほとんどが、全トランスクリプトームの発現の全体像を提供するという点で制限されている。 DNAマイクロアレイは、全体的な遺伝子発現の完全な概要を示し、迅速かつ経済的な研究技術を提供し、新規遺伝子の同定および転写因子結合部位を含むアプリケーションの膨大な数を持って、細胞の転写活性の特徴付けにも数千の分析に役立つ遺伝子の（単一の実験で）。本研究では、DNAマイクロアレイ解析に細胞収穫から細菌のトランスクリプトーム解析のための条件が最適化されている。考慮時間、コスト、実験の精度を考えると、この技術プラットフォームは、細菌のtranscriptoを研究するために非常に有用と普遍applicabaleであることが分かるMES。ここでは、Sの転写応答を比較することにより、ケーススタディなどの肺炎球菌を用いたDNAマイクロアレイ解析を行う肺炎連鎖球菌は、培地中にL-セリン濃度を変化の存在下で増殖させた。トータルRNAは、RNAの品質チェック用キットを用いて確認したRNA単離キットおよびRNAの品質を使用マカロイド方法を用いて単離した。 cDNAは、逆転写酵素を用いて調製し、cDNAサンプルを、二種のアミン反応性蛍光色素のいずれかを使用して標識した。マイクロアレイスライドを標識cDNAサンプル及びマイクロアレイデータのハイブリダイゼーションのために使用した自家製のDNAは、cDNAマイクロアレイデータの前処理ワーク（Microprep）を用いて分析した。最後に、サイバー-Tは、統計的に有意な差次的に発現される遺伝子の同定のためMicroprepを使用して生成されたデータを分析した。また、社内で構築されたソフトウェア·パッケージ（コショウ、FIVA、開示、検察官、Genome2D）を分析するために使用されたデータ。

概要

遺伝子の過剰発現またはノックアウトを含む、特定の時間に、または特定の条件下で単細胞生物または真核生物細胞のゲノムによりコードされるmRNAの存在量（トランスクリプトーム）のセット全体の研究では、トランスクリプトミクスと呼ばれています。トランスクリプトは、私たちはどの程度の遺伝子に観察することができる時間点Xにおける特定の条件の下で発現し、私たちに遺伝子が参照と比較して表しているかを強くに関する情報を提供している。

マイクロアレイは、固体基板上に二次元配列（通常、ガラススライドまたはシリコン薄膜電池）ハイスループットスクリーニングを用いて、生物学的物質の大量をアッセイするために使用され、小型化が可能で、多重化して並列処理し、検出されメソッド。マイクロアレイは、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイ、組織マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、細胞のマイクロアレイおよびその他を含む、さまざまな種類があります。 DNAマイクロアレイは、基本的には固体表面に固定された微視的DNAスポットは、通常、ガラスのアセンブリ。 DNAマイクロアレイは、同時に一つまたは複数の遺伝子のセットの発現レベルを測定するために、またはゲノム^2,3の複数の領域の遺伝子型を決定するために使用される。プローブのピコモル（10 ^-12モル）がレポーターと呼ばれる特定のDNA配列を表し、各DNAスポット中に存在する。サンプルからの標識mRNA分子は、「ターゲット」と呼ばれている。フルオロフォアは、フルオロフォアで標識された標的のプローブ - 標的ハイブリダイゼーションおよび検出を測定するために使用される標的核酸配列の相対存在量を決定する。アレイは数万プローブの何千ものが含まれている可能性があるため、マイクロアレイ実験は、並行して複数の遺伝子検査を達成することができます。シンプルなマイクロアレイ実験のレイアウトは、 図1に示されている。最近では、それはこの技術は非常に費用対effectivを作るもの、これらの配列は、再利用可能であることを私たちと他のラボに設立されましたE。

^{8 -}別のRNAの単離および精製技術は、C-TAB、SDSおよびGT方法⁴を含む長年にわたって開発されてきた。さらに、いくつかの市販のキットも用意しています。遺伝子発現のために高品質のRNAが非常に重要である。したがって、RNA単離方法は、RNAの最大量を得るために修飾される。同様に、cDNAのcDNA調製と標識のためのステップが最小化される。スキャン後のデータの正規化はまた、社内に構築ソフトウェアパッケージやツール^9を利用して効率的に行われている。

肺炎球菌は、鼻咽頭に定着し、そのような肺炎、敗血症、中耳炎などの複数の感染症の原因であり^、10髄膜炎グラム陽性ヒト病原体である。細菌は、成長および生存^11,12に必要な栄養素を幅広く利用することができる。多くの研究が、上で行われているアミノ酸の重要性および毒性^13,14におけるそれらの役割を強調して肺炎球菌窒素代謝と調節。本研究では、Sのトランスクリプトーム応答L-セリンの濃度を変更することにニューモニエは 、ヒト血漿中に豊富に存在するアミノ酸は、DNAマイクロアレイを使用して報告されている。 S.のトランスクリプトーム応答L-セリン（150μM）の最小濃度で成長させた肺炎連鎖球菌は、セリンの最大濃度（10 mM）の中で増殖させたものと比較した。化学的に規定された培地（CDMまたは最少培地^）15はセリンの濃度を制御するために、本 ​​研究に使用した。この研究の焦点は、この技術はユーザーフレンドリーにすると、データ正規化と分析のためのさまざまなツールを提供することにある。そのため、ツールの数は、分析とデータ解釈のために開発された。 FIVA（機能情報ビューアーとアナライザ）が有する遺伝子のクラスターに含まれる処理情報のためのプラットフォームを提供します類似の遺伝子発現パターンおよび機能プロファイル^16を構築する。検察官は、推定機能や遺伝子¹⁷の注釈の識別を容易に別のソフトウェアパッケージです。クラスタリング手法を利用することにより、開示するDNA結合部位検出アルゴリズムを提供する。遺伝子のシス -規制モチーフは、このアルゴリズム^18を用いて投影することができる。 Genome2Dはゲノムマップ¹⁹上の遺伝子発現レベルの変化を特徴づけるために、異なる色の範囲を提供することにより、トランスクリプトームデータの可視化と分析のためのWindowsベースのプラットフォームを提供しています。コショウウェブサーバは、オールインワンの分析方法、レギュロン、プロモーターおよび転写因子結合部位²⁰のためのマイニングのためのツールボックスに加えて、提供しています。細菌ゲノム中の遺伝子間領域の完全な注釈は、このパッケージを使用することによって達成することができる。それは彼らに実験を設計するためのプラットフォームを提供していますように生物学者が大幅にコショウの恩恵を受けることができますsの仮定情報は、 インビトロ ²⁰ で確認することができるように。それらのほとんどは、自由に利用可能であり、データ正規化と分析を非常に信頼するように、これらのソフトウェアパッケージは、マイクロアレイ解析に大きく寄与する。

プロトコル

1.メディアの調製、および細胞培養

1. S.を育てる以前に¹¹説明したように、肺炎 D39野生株^21。 6.4 ¹⁵の最終的なpHを50ミリリットル化学的に定義された培地（CDM）中（50ml中1/100比滅菌チューブ付き）、10％グリセロール中で-80 ^Oで保存細胞を接種するが、アミノ酸のL-セリンを省略混合物。
   注：二つの異なるのCDMを使用した。 L-セリン（10ミリモル）の最大濃度を含有するL-セリンの最​​小濃度（150μM）およびその他を含むもの。この最小濃度は、基本的には、ヒト血漿中のL-セリンの濃度であり、その目的は、Sの遺伝子発現を比較することであるこの二つの条件の下で、肺炎の D39株。

総RNAの2の単離

1. マテリアル
   1. 全RNAの単離のために酸フェノール、RNAグレードを使用してください。
   2. マカロイド：
      1. の2グラムを一時停止100ミリリットルのTEでマカロイドし、5分間沸騰させる。 RTに冷却し、マカロイドgels.Centrifugeまで、超音波処理RT、4℃で50ミリリットルのTE pHが8店舗で再懸濁で5分間2000×gでソリューション。
   3. ソリューション：
      1. ジエチルピロカーボネート（DEPC）を持つすべてのソリューションを扱う。 15分間37℃でO / Nインキュベートし、オートクレーブ、100μlのDEPC / 100ミリリットル溶液を加える。
2. 方法論
   1. Sの50ミリリットルを育てる中期指数期（OD〜0.3）まで^{、37°C ​​の} （なしの揺れ）で50 mlチューブで、肺炎 D39細胞培養。 2分間10,000×gで上に4℃で遠心し培養。メディアを破棄し、直ちに液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。
   2. プレミックス300μlのクロロホルム：IAA（24：1）と300μlのフェノール（酸フェノール、RNAグレード）。ステップ2.2.3で有機相500μlのを使用してください。
   3. RNAフリースクリューキャップチューブに事前に以下の混合物を準備します00.5グラムのガラスビーズ、50μlの10％SDS、500μlのフェノール/クロロホルム：IAA（ステップ2.2.2で調製した）、マカロイド層（150〜175μL、それは非常に粘性ではない正確なように）。 400μlのTE（DEPC）で細胞ペレットを再懸濁し、スクリューキャップチューブに再懸濁した細胞を追加します。
   4. 細胞を破壊し、氷上で1分間隔で2回60」パルス（ 'ホモジナイズ'）のためのビーズビーターでスクリューキャップチューブを置く。遠心機10,000×gで （4℃）で10分間のサンプル。
   5. 10,000×gで （4℃）で5分間遠心新しいチューブに上相を移し、500μlのクロロホルムを追加：IAA（1〜24）を。
   6. 溶解/結合緩衝2倍量の（1ミリリットル）を追加し、新鮮なチューブに上相500μlのを転送し、ピペッティングにより混合します。 RNA単離キットを用いて全RNAを単離し、製造業者の推奨するプロトコルに従う。

3. R​​NAクリーンアップ

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、全RNAからDNAの汚染を除去100μlのDNアーゼIミックス（90μlのDNA分解酵素バッファーと10μlのDNアーゼI）を追加し、15〜25ºCで20〜30分間インキュベートする。

ウォッシュは、RNアーゼキットを用いてRNAを掃除。溶出した体積の50μLを取得します。

RNA 4.分析

1. 分光光度計でRNAの濃度を決定します。 （ 図2）を次のようにアッセイを使用して、RNAの品質を決定する。
   1. 20〜200 ng /μLでの濃度を得るためにDEPC水50μlでサンプルを1μl希釈する。
   2. 製造元の指示に従ってバイオアナライザーで品質をチェックする1μlの希釈されたRNAサンプルを使用してください。
2. 注：23Sの比率：2.0付近の16Sが良いとされている¹ A260ユニットRNAは40 / mlのに対応している。。標識化のための推奨される量が10〜20μgのです。

5. cDNAの調製と標識

ntent ">注：以下のプロトコルは、cDNA調製と標識のために行った。

1. アニーリング
   1. 自家製スライドまたは会社製スライドの5μgのためのトータルRNA 10-15 mlの濃度を維持し、300μlのPCRチューブにアニーリング反応を実行します。ミックス2μlのランダム量体（1.6μgの/μl）を有するRNA、必要に応じて18μlにアニーリング混合物の最終容量を維持するためにヌクレアーゼフリー水を追加します。
   2. 5分間、70℃でアニーリング混合してください。その後、チューブの底に反応をスピンダウンし、10分間（アニーリング）、および必要に応じて、混合物を室温に冷却する。少なくとも1分間氷上で反応チューブを置きます。
2. 逆転写
   1. 次のように逆転写酵素ミ​​ックスを調製する：18μlのアニーリングミックスに、12μlのマスターミックスを追加（6μlの5倍ファーストストランドバッファからなる、3μlの0.1 M DDT、1.2μlの25X AA-dUTPを/ヌクレオチドミックスと1.8μlのトンを逆転ranscriptase（同社製スライドの1μL）。 42℃で2-16時間反応ミックスを保管してください。

cDNAのmRNAおよび精製の6分解

1. 反応混合物からmRNAを分解するために、約15分間、37℃で3 2.5 MのNaOHμlの場所を追加する。その後、NaOHをを中和するために、2M HEPES遊離酸の15μlを添加する。
2. PCRクリーンアップカラムを使用してcDNA混合物を精製し、製造業者のプロトコルに従ってください。

cDNAの濃度の7測定

1. 分光光度計でのcDNAの濃度を測定します。ラベル付けを続行するには、cDNAの濃度が少なくとも60 ng /μLで（自家製スライド）または20 ng /μLで（同社製スライド）であることを確認してください。

アミン反応性色素および精製とcDNAの8。標識

1. のcDNAを標識し、アミン反応性染料を使用してください。直接1アリコート（5μL）の有するcDNAをミックスアミン反応性染料。
2. 60から90分間、暗闇の中で、RTで混合物をインキュベートし、色素標識cDNAの精製に直接進む。 PCRクリーンアップカラムを使用し、製造業者のプロトコルに従って、色素標識cDNAを精製する。溶出緩衝液50μl中のcDNAを溶出させる。

標識cDNAの9.測定

1. cDNAにアミン反応性染料の取り込みを測定するために分光光度計を使用してください。アミン反応性染料の濃度は全量50μl中で少なくとも0.5ピコモル/μlであることを確認してください。

標識cDNA試料の10ミキシング

1. 自家製のスライドでは、cDNA濃度で30％以下の違いとのハイブリダイゼーションのためにすべての標識cDNAを使用しています。同社製のスライドでは、cDNA濃度で2倍の差を超えないとするcDNAを使用しています。
   注：通常は、cDNAの約300 ngは同社製のスライドのために必要とされる、REQに比べて非常に少ないである自家製のスライドのcDNA量をuired。

11.ハイブリダイゼーションおよび洗浄

1. （;40μlの酵母RNAと自家製）デミ水、エタノール99％SHYバッファ：以下の試薬を使用してください。 SHYの最大1ミリリットルを準備します。
2. 装置およびソリューションの準備
   1. 乾燥前に真空濃縮器とヒーター、少なくとも1時間に切り替えます。正しいハイブリダイゼーション温度に調整したセットポイント（ 肺炎球菌 DNAマイクロアレイのために、45℃を使用）とのハイブリダイゼーションオーブンをオンにし、。同様に、30〜60分間のハイブリダイゼーションカセットとオーブンを予熱。
   2. 少なくとも30分間68˚CでSHYバッファーを予熱。
3. サンプル調製（標識cDNA）
   1. 標識cDNA（最大30％の差）の同量を組み合わせる。ボリュームは7μLより小さくなるまで、高い気温（約40分）で、真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させる。
4. リフタースリップ
   1. クリーンリフター·スリップを使用してください。注：30μlをスライド上にロードすることができ±。
   2. 石鹸、水道水と100％エタノールをたっぷりとリフター·スリップを清掃してください。注：ダーティリフタースリップは高いバックグラウンドを与える。
   3. 空気はダスト粒子を吹き飛ばすためにエアピストルでリフター·スリップを乾燥させます。両側の白いテフロンライニングを下に向けてスライド上のクリーンリフタースリップを置きます。
5. （標識されたcDNAに）ハイブリダイゼーション緩衝液を添加すること
   1. 7μlのH ₂ O中で乾燥させた色素試料を溶かし、2分間94℃でインキュベートする。
   2. すぐに、SHYバッファー（68℃）に予熱35μlを添加する沈殿物を取り除くために最高速度で1分間穏やかにスピン混ぜる。ロードされるまで約5分間68˚Cでプローブを予熱。
6. スライドリフタースリップアセンブリおよび予熱。
   1. 50℃の熱ブロック上のハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。加熱されたハイブリダイゼーションスライドホルダーとpにリフタースリップをDNAマイクロアレイスライドを配置分間のリフタースリップとスライドを再加熱。可能な限り迅速に次の手順を実行します。
   2. スライドの最後に、サンプルターゲットの40を添加する。流体は、毛管力によって、ガラス面の間に流れることを可能にする。ゆっくりと慎重にすべてペッティングを行います。
   3. すべての回でリフタースリップ水平にスライドを保ち、リフタースリップが動かなかったことを確認するために、ゆっくりと移動する。
   4. ハイブリダイゼーションオーブンの外に予め温めブリダイゼーションカセットを取り、マシンを閉じます。置きフィルター紙は、ハイブリダイゼーションカセットに3ミリリットル2X SSC（標準クエン酸生理食塩水）に浸漬した。
   5. 静かにハイブリダイゼーションカセット内のスライドとのハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。ハイブリダイゼーションカセットを閉じて、（約16〜18時間）オーブン再びハイブリダイゼーションに入れる。
7. スライド洗浄
   1. 新鮮なウォッシュバッファI、IIおよびIII（洗浄ステップごとに750ミリリットル）を準備します。 500ウォッシュバッファーをmlの私は、2×SSC / 0.5％SDSを使用しています。 500ミリリットルのためにウォッシュバフをER IIは、1×SSC / 0.25％SDSを使用しています。 500ミリリットルのために洗浄バッファーIIIを使用し、1×SSC / 0.1％SDS（オプション）
   2. 30°C（SDSが溶解していることを確認するため）で洗浄·バッファを置きます。
   3. 50mlで充填したファルコンチューブに、非常に穏やかに可能な限り迅速にスライドを沈めたが、ガラス管の円錐形の底部上に載るまで、Iを洗浄緩衝液。
   4. 数秒後、リフタースリップがチューブの底に沈むとき、配列に傷をつけずにピンセットでスライドを取り出し、洗浄ステーションのラックに置く。時間がないギャップの洗浄に進みます。
   5. I（洗浄ステーションで）バッファを洗う500ミリリットルで5分間スライドを洗浄します。ウォッシュバッファ500ミリリットルで20〜30分（洗浄ステーションでの）IIのためにそれを第二の洗浄を与える。同様に、洗浄緩衝液500ミリリットル中で5分間スライドを洗浄III（オプション）（洗浄ステーションで）。
   6. 2000 rpmで2分間スライドを乾燥させます。

12.マイクロアレイ解析

1. スキャン画像スキャナで各波長のフォルダ "Joveのプロジェクト」で保存します。
2. このソフトウェアを実行した後、以前に22を説明したように、最初にスキャンしたファイルを解析するためのソフトウェアを使用して、「赤」と緑の画像ファイル（-.635）などのように、赤の画像ファイル（-.550）をロードするために、「画像を開く」タブを選択します「グリーン」。タブ22を「負荷アレイリスト」を選択することで、画像ファイル上の肺炎球菌配列リストを持つギャルファイル（.gal）をアップロードします。
   注：この配列リストは48のグリッドで構成され、各グリッド上で16行と15の列がありました。グリッド上の各スポットは、単一の遺伝子を表し、遺伝子名などのスポット情報は、スポット記述ファイルを介して追加されます。スポット番号は、左から右へ、上へ下へ与えられている。
3. 慎重にグリッドを選択]タブをスポットした後、スポットを整列させるための「機能を合わせ、ブロックを見つけ、配列を探す」。すべての機能を整列させた後、「分析」トンを選択することで、画像を解析AB。その結果、ヒストグラムや散布図を持つ新しいファイルを作成します。 「名前を付けて保存結果」タブからこのファイルを保存し、さらなる分析のため.gprファイルとして。
4. ^9を説明するように、自社開発Microprepソフトウェアパッケージをさらに正規化とデータの処理を実行します。
5. 色素スワップされたDNAマイクロアレイデータのための独立した生物学的複製を使用してください。 T-TEST1の変種のCyberTの実装を行い^、9が説明されているように偽発見率（第一度近親者）を計算します。
6. 示差的に発現された遺伝子については、標準のように、p <0.001とFDR <0.05を取る。
7. GEO（遺伝子発現オムニバス）アクセッション番号を取得するために、NCBIの提出ページにDNAマイクロアレイデータをアップロードします。

結果

RNA、cDNAの単離および分析

L-セリンは、必須アミノ酸の一つであり、ヒト血漿中のその濃度は、小児および成人における60〜150μMまで変化する。プリンおよびピリミジンの生合成におけるその役割は、代謝におけるその重要性を強調し、それはいくつかのアミノ酸（グリシン、システイン及びトリプトファン）の前駆体である。 S.の全トランスクリプトームに対するL-セリンの影響を研究するためにニューモニエ D39野生株、同じ培地中の最大濃度（10 mM）の中で増殖させ、そのに対するL-セリンの最小濃度（150μM）とCDM中で増殖D39株のマイクロアレイ分析を行った。まず、両方の濃度で増殖させた細胞から総RNAを単離した。 RNAサンプルの濃度を表1に示す。総RNAの品質が品質チェックアッセイ法を用いて調べた。 RNAは、これを行う前にDNアーゼIで処理した。アッセイは、可能なゲノムDNAを除去した。図2は、RNAの品質を示す。レーンLは、ラダーを示し、...

ディスカッション

我々は、細菌の全トランスクリプトーム解析を実行するために適用することができるユーザーフレンドリーなプロトコルを記述する。この特定の技術についてのキーポイントは、細胞が収穫される条件が変動することである。細胞RNAの単離を収穫した後、この技術は、細菌サンプルのすべてのタイプとなると正確に同一の手順に従うので、細菌培養の任意のタイプに適用することができる。プロトコルは、非常に簡便であり、RNAの単離から始まる。従来のフェノール - クロロホルムおよびトリゾール方法と比較して（マカロイドおよびRNA単離キットを使用して）我々のRNA単離プロトコールは時間が有効である。次のステップでは、転写III酵素によるcDNAの調製が行われる。次に、cDNAの標識は、アミン反応性染料を用いてcDNAの第一混合することによって行われ、その後、標識cDNAを精製する。標識化は、単純であり、サンプルは約1でインキュベートする必要があるように多くの時間を取らない暗闇の中で時間。それは、任意の特殊な装置を要求しないように、すべてのこれらのステップは、任意の標準的な実験室で行うことができる。マイクロアレイスキャナーはスライドをスキャンするために必要とされる。スライド走...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酸性フェノール	SigmaAldrich	P4682
ロシュ RNA アイソレーション キット	ロシュ アプライド サイエンス	11828665001
ガラスビーズ		105015
クロロホルム	ブーム	92013505.1000.
IAA		106630
Nanodrop	Nanodrop	ND-100
Agilent BioAnalyser	Agilent	G2940CA
Superscript III	Life テクノロジー Invitrogen 18080044
AA-dUTP	Life テクノロジー Invitrogen	AM8439
DDT	Life テクノロジー Invitrogen
ファーストストランドバッファー	ライフサイエンス テクノロジー Invitrogen	18080044
NaOH	SigmaAldrich	S8045-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H4034-500G
DyLight-550	Thermoscientiffic	62262
DyLight-650	Thermoscientiffic	62265
SHY バッファー	SigmaAldrich	H7033-125ML
Speedvacクーラー	エッペンドルフ	RUGNE3140	Speedvac濃縮器プラス
ハイブリダイゼーションオーブン	グラント・ベーケル	ISO-20
リフター・スリップ	エリー・サイエンティフィック	25x60I-M-5439
ワイプ	キムテック
SDS	シグマアルドリッチ	L3771-100g
SSC	SigmaAldrich	W302600-1KG-K
Genpix オートローダ 4200A1	MSD 分析技術		マイクロアレイスキャナ
重炭酸ナトリウム	SigmaAldrich	104766