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方法論記事

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

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DOI：

10.3791/52662

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2015年3月16日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Ophthalmology, Duke University

この記事について

サマリー

私たちは、マイクロマニピュレーションと網膜電図技術を利用したゼブラフィッシュの幼生の網膜電図(ERG)分析の方法を提示します。これは、ゼブラフィッシュの幼生の視覚機能をin vivoでアッセイするためのシンプルでわかりやすい方法です。

要約

電図（ERG）は、網膜機能を決定するための非侵襲的な電気生理学的手法である。角膜の表面上の電極の配置を介して、光に応答して生成された電気的活動を測定し、 インビボでの網膜細胞の活性を評価するために使用することができる。この原稿は、ゼブラフィッシュで視覚機能を測定するためのERGの使用が記載されている。ゼブラフィッシュは、長いによるモルホリノオリゴヌクレオチド、および薬理学的操作による遺伝子抑制を容易に脊椎動物の開発のためのモデルとして利用されてきた。 5-10 DPFでは、唯一のコーンは、幼虫の網膜で機能的である。したがって、ゼブラフィッシュは、他の動物とは異なり、 インビボでの錐視覚機能の研究に有用なモデル系である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの研究を行う研究室で一般的な標準麻酔、マイクロマニピュレーションと実体顕微鏡のプロトコルを使用しています。概説された方法は、標準的な電気生理学EQを利用する幼虫の角膜に記録微小電極の配置をガイドするuipmentと低光カメラ。最後に、本来のマウス用に設計市販のERG刺激/記録を容易にゼブラフィッシュでの使用に適合させることができる方法を示す。幼生ゼブラフィッシュのERGは、モルホリノオリゴヌクレオチドの注入により修飾された動物において、円錐視覚機能をアッセイするのに優れた方法ならびにそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNが）などの新しいゲノム工学技術を提供し、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、及びInterspacedショート回文反復（CRISPR）/ Cas9、大幅にゼブラフィッシュで遺伝子ターゲッティングの効率性と有効性を増加しているそのすべてが定期的にクラスタ化された。さらに、我々は光応答に寄与する分子成分を評価するためにゼブラフィッシュの幼虫を貫通する薬理学的薬剤の能力を利用する。このプロトコルは、研究者によって変更して使用することができるセットアップを概説様々な実験目標に。

概要

電図（ERG）は、ヒトにおける網膜の機能を決定するための臨床で広く用いられている非侵襲的電気生理学的方法である。光刺激に応答した電気的活動は、角膜の外面に記録電極を配置することによって測定される。刺激パラダイムと応答波形の特性が応答に貢献する網膜神経細胞を定義する。この方法は、マウスおよびゼブラフィッシュを含む多くの動物モデルの使用に適合されている。典型的な脊椎動物ERG応答は、4つの主要コンポーネントがあります。光受容体細胞の活性に由来し、角膜陰性電位であるA波を、。 b波、ON双極細胞由来の角膜陽性の可能性。 d波、OFF双極細胞の活性と解釈角膜陽性の可能性。とb波の後に数秒を発生し、C波は、ミュラーグリアとRETの活動を反映しているノミナル色素上皮1-4。ヒトとモデル動物で歴史とERG分析の原理を理解するための追加の参照は、ユタ大学とそのようなビジョン4、5の臨床電気生理学の原則と実践などのテキストから、オンライン教科書、Webvisionです。

ゼブラのフィッシュ（ゼブラフィッシュ）は、長いによる臓器系の非侵襲的な形態学的分析を可能にし、その急速な成熟と透明性、に、脊椎動物の発生のモデルとして好まれた行動アッセイおよび順方向および遺伝子スクリーニングを逆転されている（レビューのために、Fadoolを参照してくださいダウリング6）。ゼブラフィッシュの幼虫は、その高い繁殖力と組み合わせると、それらのハイスループット生物学的分析のための優れた動物モデルにする遺伝的および薬理学的操作、に非常に適している。幼虫のゼブラフィッシュでロッドに錐体の比率が高い - およそ1：マウスと比較して1（〜3％のコーンS） -コーン機能7-9の研究のために特に有用なものにする。

脊椎動物の網膜では、コーンは、ロッド10の前に開発する。興味深いことに、ゼブラフィッシュコーンは、そのステージ6、11、12でコーンの選択的な電気生理学的解析を可能にし、早ければ4 DPFとして動作可能である。対照的に、ロッドにおけるERG応答は、11と13のdpf 21との間に現れる。したがって、4-7でのゼブラフィッシュの幼虫は、DPFすべてのコーン網膜として機能を発揮する。しかし、4-7 DPFの幼虫のネイティブ明所視ERG応答は、b波によって支配されている。 （+） - - などLなどの薬理学的薬剤の適用2-アミノ-4-ホスホノ酪酸（L-AP4）、ON双極細胞によって発現される代謝調節型グルタミン酸（mGluR6）受容体アゴニスト、効果的にブロック生成b波および孤立コーン質量受容器電位（「波」）14-17を明らかにする。

ここでは、シンプルでreliablを記述するゼブラフィッシュの幼生との使用に適合されたマウスを使用するために設計された市販のERG装置を用いてERG分析のための電子方法。このシステムは、視覚感度及び明順応16に寄与するシグナル伝達経路の同定を研究者を助けるために、遺伝的背景を変化させること、ならびに薬理学的薬剤で処理されたものなどのゼブラフィッシュの幼生に利用することができる。このプロトコルで概説実験手順はビジョンに係る生体さまざまな質問に答えるためのERG分析の使用に研究者を導く、そして柔軟なERGセットアップの建設のデモンストレーションを行います。

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プロトコル

動物の維持費と実験的なプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の制度動物管理使用委員会によって承認され、実験動物福祉のNIH事務所との評価と実験動物管理国際認定協会のすべての要件を満たしていた。
注：標準のゼブラフィッシュの飼育および維持のためのERG分析用の幼虫を入手するには、公開されたプロトコルが18を採用した。幼虫は、自然繁殖を介して取得し、14時間の明/ 10時間暗サイクルの下に収納されている。このプロトコルは、5-7日後に受精（DPF）で幼虫のために最適化されているが、理想的に手続きに小さな変更を加えて、古い魚を行うことができた。ここでは、5 DPFで、野生型ゼブラフィッシュ幼生のTL株を使用しています。

1.マイクロピペットプロダクション

  1. 1.5×0.86ミリメートル（内径によって外径）と火災研磨ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して複数のマイクロピペットを引き出しますフィラメント（温度、821°Cの融点）及びP-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーボックス熱フィラメントを装備。 表1に記載のマイクロピペットを形作るためのプログラムを使用してください。
  2. 先端の直径が10〜15ミクロンであり、円滑な先端開口（ すなわち、ギザギザのエッジ）を持っていることを確認するために、適切な目盛の定規で顕微鏡下で各マイクロピペットを確認してください。
  3. 先端の損傷や埃への暴露を防止するために、マイクロピペットを慎重に格納します。ストレージオプションは、ラボテープ、フォーム内張りの箱、または市販のマイクロピペット貯蔵容器とのペトリ皿が含まれています。
    注：他のマイクロピペットプラーとガラスキャピラリーは、正しいマイクロピペットの直径と高品質の先端が達成される限り長く使用することができる。
圧力 ヒート 引く 速度 時間
500 560 - 30 200
500 450 - 30 200
500 410 55 40 200

表1：ボックスの熱フィラメントを装備P-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを製造するためのプログラムのマイクロピペットは、フィラメントを有する熱加工ホウケイ酸ガラスキャピラリーを1.5×1.0ミリメートル2（内径によって外径）を使用して行われる。 （融解温度は、821°C）。

2.バッファの準備

  1. 微小電極のキャピラリーでろ過し、酸素金魚リンゲルバッファ19を使用して、幼虫が実験のために置かれ、その上にポリビニルアルコール（PVA）スポンジを飽和させる。また、E3を使用胚メディアまたはハンクス液。
  2. 表2に記載したようにpHを7.8に調整し、0.22μmのフィルターを用いて滅菌し、4℃で10倍株式を保管10倍金魚リンゲル液を準備します。
  3. 脱イオン、蒸留水で1倍する10倍のリンゲル液を希釈することによって、実験の日に作業溶液を作成します。 0.22μmのフィルターシステムを使用してフィルタリングします。 10分間、95％O 2/5％CO 2ガスでバブリングすることによって酸素化物。キャップはしっかりとその後ソリューションが含酸素のままであることを確認します。
NaClを 1.25 M
塩化カリウム 26 mMの
のCaCl 2 25 mMの
のMgCl 2 10 mMの
グルコース 100 mMの
HEPES 100 mMの
jove_content "> 表2：10倍金魚のリンゲル液の調製。

3.電図プラットフォーム

  1. 信号対雑音比を改善するためにファラデーケージ内部の除振台上のERG実験を行う。六角ナットを使用して、防振テーブルにカスタムスチールプラットフォームを取り付けます。光源下でテーブルの上に粘弾性ウレタンポリマーの衝撃吸収底の可動プラスチックプラットフォームを置きます。
  2. 可動プラスチックプラットフォームでダウンを目的とした、磁化スタンド付きカメラを、配置します。可動プラスチックプラットフォームの右側にある2番目の磁化されたスタンド付（記録微小電極を保持する）マイク​​ロマニピュレーターを配置します。カメラとマイクロマニピュレーターが他の機器の動きによって妨害されないことを、彼らは、光源からの照明をブロックしないことを確認してください。
  3. ビデオモニターにカメラを接続し、の目を見ることそれを配置適切な位置に電極を配置するための幼虫。
  4. セットアップが正常に銅線で接地されていることを確認してください。ノイズを確認するには、リンゲル液で満たされた35ミリメートルペトリ皿に記録微小電極の参照電極チップを配置します。オシロスコープまたはERG装置の内蔵の機能でセットアップの電気的なノイズレベルを確認してください。ノイズレベルは、ベースラインからせいぜい±10μVでなければなりません。

4.スポンジ準備

  1. 35ミリメートルペトリ皿にぴったりとフィットしますドライPVAスポンジの小さな長方形をカット。スポンジの厚さは、皿の深さよりも大きくするべきではありません。切断のためのきれいなカミソリの刃でカッターナイフを使用してください。
  2. 参照電極（スポンジの底部または小さい方の端部の一方を垂直にカット蝶上の長さ方向の浅いカットのいずれか）に対応するためにスポンジに追加のカットを行います。
  3. 化学的に耐性マーカーを使用してくださいカメラを位置決めするために使用することができるスポンジ（幼虫が配置される場所）に小さなドットをマークする。
  4. 飽和するまでリンゲル液中のPVAスポンジを浸す。 2-3回を削除し、ペーパータオル上ですぐにブロット。きれいな35ミリメートルペトリ皿にスポンジを置きます。
  5. マークがカメラによって視覚化することができるようにプラスチック製のプラットフォーム上にスポンジを含むペトリ皿を置きます。

5.電極の準備

NOTE：ゼブラフィッシュセットアップはリンガー溶液、飽和PVAスポンジと角膜と接触して記録電極と接触する基準電極から成る。参照電極は銀/塩化銀ペレットで構成されている。記録電極は、プルガラスマイクロピペットリンゲル液を充填し、Ag線を含む微小電極ホルダに保持されている。

  1. 5分（記録MICR 6-9％の次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）でそれらを浸漬することによって電極を塩化物oelectrode線）または15分（参照電極）。 5分間キムワイプ上の空気乾燥。
    1. ステップ4.2で行われたカットのスタイルに応じて、スポンジ（底部の長さ方向の浅いカット用）（垂直蝶カットの場合）または下に参照電極の銀/塩化銀ペレットを配置。記録システムに基準電極リードを取り付けます。
    2. ERGセットアップはスペースの制約があり、またはAg / AgCl電極から特に強い太陽光発電アーティファクトが存在する場合に代替的に、光路の外に電極を移動させるために、寒天、塩橋を介してスポンジを参照電極に接続する。
  2. 5ミリリットル非ルアーロックシリンジに適切なサイズのチューブの約40センチ取り付けます。リンゲル液で注射器を埋める。圧力ポートを有する微小電極ホルダーは、通常、「3/32」を1/16の内径とチューブを収容するためのアダプターで1/8 "または5/32」を出荷する。
  3. で1ml非ルアーロックシリンジに充填リンゲル液および、マイクロフィルを用いて、慎重に微小電極ホルダーを埋める。気泡の形成を防ぐ。
  4. チューブを微小電極ホルダーの圧力ポートに5ミリリットルの注射器を取り付け、微小電極ホルダーはリンゲル液の完全であることを確実にするためにそれを使用。マイクロFILとリンゲル液で満たされた1-mlの注射器を使用して、先端からマイクロピペットガラスを記入し、気泡が存在しないことを確認してください。
  5. 電極線をまっすぐに保つように注意して、微小電極ホルダーにガラスマイクロピペットを取り付けます。いったん確保し、ソリューションの小さな量は先端に表示されるまで慎重に微小電極を通じてリンゲル液を強制的に5ミリリットル注射器を使用しています。マイクロピペットチップで、塵や塩類集積による気泡、ならびに閉塞の形成を防止する（角膜に適用されていない）注射器に圧力を時折アプリケーション。
    1. ソリューションはストリームとして出てくる場合は、Gを交換小娘マイクロピペット、先端開口が大きすぎる、または破損しているよう。
  6. 慎重にマイクロマニピュレータにおける記録微小電極を配置し、記録システムのリードを取り付ける。

6.電図解析

注：記録の準備が間接白色光の低レベルの下で実行されるときにより幼虫の網膜の錐優勢に、高品質のERG結果を得ることができる（<1ルクス）または短い周期を有する（<1分）より高い強度の（ ≤250ルクス）作業灯。暗順応の短い期間がまだ記録の前に必要とされる（ステップ6.7参照）。しかし、実験は、赤外線感応カメラを使用して暗赤色または赤外光で行うことができる。全ての実験は、UNCゼブラ水産養殖施設から濾過滅菌（0.22μmの）システム水中で実施したが、代替胚培地を使用することができる。

  1. 約1を測定するカット紙タオルの正方形cm 2である 。
  2. 単離された円錐質量受容器電位を測定する場合は、5分間500μM（±）-2-アミノ-4-ホスホノ酢酸（APB）を使用してシステムの水に3-5幼虫をインキュベートする。
    NOTE：APBがアクティブ（L）のラセミ混合物とAP4の不活性な（R）形態であるが、L-AP4と同様に有効であり、安価である。
  3. 応答しない、約1〜2分まで、0.02％とトリカイン（w / v）のシステム水に3-5の幼虫を麻酔。
  4. 慎重に最小限の照明（<1分間≤250ルクス）を使用して、解剖ステレオスコープの下にペーパータオルの正方形の上に個々の幼虫を転送するためにパスツールピペットとピペットポンプを使用してください。各幼虫の位置を確認し、遮蔽されていない目で、背側を上にある候補者を選択します。
    1. 拡張された録音（> 30分）、に身体を窓ガラスが、細かいラクダ毛のブラシを使用して、3％メチルセルロースで頭を含めないことによって湿った幼虫を保つ。
  5. 鉗子を使用して、ペーパータオルsquarを転送する湿ったPVAスポンジに幼虫とE。
    1. 長時間録画（> 30分）、蒸留水を含有するサイドアームフラスコ中AIRSTONEを通してガスをバブリングすることにより幼虫にわたって水飽和、100％O 2ガスの連続流を適用する。幼虫の頭の近くに加湿酸素を運ぶフラスコサイドアームを出て、チューブを置きます。
      注：ステップ6.4.1とステップ6.5.1は、魚16の寿命を延ばすます。
  6. 最小限の照明の下で、鼻および眼の尾側端部の間の中間点での微小電極の先端を位置決めするためにマイクロマニピュレータとカメラを使用して、角膜の背側限界に押し穏やか。
    注：角膜の遠い遠位領域への電極先端の誤配置が逆極性のERG波形になることができます。
  7. 5〜10分間暗適応させるために幼虫を許可する。
  8. のAvaIを用いたLED光源や光学刺激装置から提供される光にレコードのテストフラッシュ応答可能な標識刺激と記録装置。実験に合わせて、フラッシュの強度、フラッシュの長さ、フラッシュカラー、背景輝度や色などのプロトコルパラメータ及びフィルタ設定を調整する。
  9. 実験が終了したら、AVMA / IACUCガイドラインに従って幼虫を安楽死させる。

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結果

多くの研究がこのステージ9、16,20でERG記録を掲載しておりますので、一般的に、ERGをは、5 DPFでゼブラフィッシュ幼生から記録されている。幼虫の応答は、白色LEDの光の20ミリ秒の刺激を使用しない背景照明と暗順応条件下で測定した。私たちは、全体野の光刺激とコンピュータ·コントローラ/レコーダーからなる市販のERGシステムを利用した。刺激装置は、背景とフラッシュ刺激の両方の輝度を制御するために厳密に制御された独自のパルス幅変調（PWM）方式を使用する。応答は、デジタル変換器（ADC）16ビットアナログ駆動ハードウェアアンチエイリアシングフィルタに独自の完全差動増幅器を用いて記録した。刺激と反応の記録は、製造業者のプロトコルに従って、機器に付属の専用ソフトウェアにより制御した。我々の機器は、1kHzのサンプリングレートを使用するようにプログラムされた、デジタルベッセルCASCADEのフィルタは、過剰なノイズを除去するために0.312 Hzから300 Hzの、および60Hzのノッチフィルタとの間の帯域に設定する。暗順応幼虫における光強度の増加に伴う振幅のb波が増加する（ 図1）。

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ディスカッション

このプロトコルでは、幼虫のゼブラフィッシュのERG記録のための簡単​​な手順が詳しく説明されている。この手順は、心に留めておくべきである手順を通じて、いくつかの重要なステップである視覚的function.Thereを迅速かつ総合的な分析を可能にします。ゼブラフィッシュの幼虫は、潜在的な薬物治療の間、死を防止し、ERG記録中に長期の生活を確保するために、実験の前に健康でなければなりません。また、実験に利用幼虫は密接に年齢をマッチさせたことが重要である。これは、網膜（ すなわち 、コーンサブタイプの差動開発）とも幼虫の全体的な形態と生理学の急速な発展によるものです。例えば、上皮蒸散効率のdpf 7後より困難生きている魚を維持すること減少する。もう一つの重要な要因は、記録電極と基準電極の品質である。ラフなエッジトンを防ぐために、ガラスキャピラリーを引っ張ったときには注意が必要IPS。マイクロフォージは火ポリッシュするために利用することができるマイクロピペットは、電極を引っ張られ、信号取得を改善するのに役立つ。さらに、銀/塩化銀電極の品質を維持することが非常に重要である。使用後は、彼らはすぐに乾燥させ、蒸留水と空気でリンスする...

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開示事項

利害の衝突が宣言されていない。

謝辞

私たちは、ゼブラフィッシュの維持管理のためにUNCゼブラフィッシュ養殖施設のメンバーに感謝します。また、ERG装置のセットアップを支援してくださったDiagnosys, LLCにも感謝いたします。さらに、電気生理学的方法の支援を提供してくださったPortia McCoy博士とBen Philpot博士の研究室にも感謝します。また、ゼブラフィッシュの幼虫のイラストをくださったリジー・グリフィスさんにも感謝いたします。この研究は、国立衛生研究所のF32 EY022279(JDCに)およびR21 EY019758(E.R.Wに)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ファラデーケージ80/20 Incカスタムデザインアルミニウム「工業用エレクターセット」 ケージフレームワーク
用 PVAスポンジアマゾンB000ZOWG1Cゼブラフィッシュの幼虫を配置するための柔らかく湿ったプラットフォームを提供します
150 ml 滅菌フィルターシステムコーニング431154小さな関節がマイクロピペットをブロックするのを防ぐためのろ過ソリューション
エスピオンE2Diagnosys、LLCの連絡先任意の刺激装置のための視覚刺激を生成することができ、独自のソフトウェアを使用して応答のデジタル記録と分析を行うことができるモジュラー電気生理学システム、http://www.diagnosysllc.com
ColordomeDiagnosys、LLCの連絡先RGB LEDとGanzfeld ERGのキセノン光源を備えた光刺激装置、http://www.diagnosysllc.com
マイクロマニピュレータの詳細Drummond3-000-024-R記録用微小電極の保持と位置決め
磁気リングスタンドDrummond3-000-025-MBカメラと参照電極の保持と位置決め
リードエクステンションGrass TechnologiesF-LX電極接続用スペアメス-オス 1.5 mm リードケーブル
オスピン - メス SAFELEADAdaptor Grass TechnologiesDF-215/102mmピンと1.5ヘッドボードピンの接続
ウィンドウスクリーンフレーム(金属製)とスプラインロウズまたはホームデポ各種ファラデーケージフレームワークへの銅メッシュの取り付け用
ステリフリップ50mlフィルターミリポアSCGP00525小さな関節がマイクロピペットを塞ぐのを防ぐフィルタリングソリューション
BNCアダプターMonoprice4127カメラとBNCケーブルの接続
BNCケーブルMonoprice626カメラをビデオアダプターに接続する
カメラレンズNavitar1582232幼虫の角膜への記録微小電極の位置を視覚化
カメラカプラーNavitar1501149幼虫の角膜への記録微小電極の位置を視覚化
Luna BNC to VGA + HDMIコンバーターシーウェルSW-29297-PROBNC to VGAアダプター カメラ画像をコンピューターモニターに投影可能
APBSigmaA1910mGluR6アゴニスト、b波をブロックし、単離されたコーン質量受容体電位の分析を可能にする
ホウケイ酸ガラスSutterBF-150-86-10ファイヤーポリッシュホウケイ酸ガラス (metling temperature = 821°C)フィラメントで寸法が1.5mm x 0.86mm(外径×内径) 
P97 フレーミング/ブラウンプーラーサッターP97ガラスマイクロピペットを引っ張るため
ソルボスタンシートThorlabsSB12A合成粘弾性ウレタンポリマーは、衝撃を吸収し、滑りを防ぐためにパッシブアイソレーションマウントとERGプラットフォームの下に置かれ、サイズにカットすることができます
ブレッドボードThorlabsB2436FERG刺激装置とゼブラフィッシュ試料
用の防振プラットパッシブアイソレーションマウントThorlabsPWA074ブレッドボードに防振を提供
銅メッシュTWP022X022C0150W36Tファラデーケージ
ピペットポンプVWR53502-233パスツールピペットと一緒に使用してゼブラフィッシュの幼虫を慎重に移すために
ツールピペットVWR14672-608ゼブラフィッシュの幼生を慎重に移すためにピペットポンプと一緒に使用
カメラワテックWAT-902B幼虫角膜への記録微小電極の位置を可視化
トリカイン (MS-222)ウエスタンケミカルトリカイン-S医薬品グレード麻酔薬、
マイクロフィルWPIMF28G-5充填用微小電極ホルダー・微小電極
ガラス マイクロ電極ホルダーWPIMEH2SW15ガラス微小電極を保持し、ERG機器に接続します
参照電極WPIDRIREF-5SH電解液を排出し、焼結したAg/AgClペレット電極を露出させるために、ケーシングの最後のセンチメートルを慎重に切り離
参照電極(代替)WPIEP1DRIREF-5SHの代替品。接続リード線に配線/はんだ付けが必要なAg/AgCl電極
電極ホルダー用低ノイズケーブルWPI13620アダプター/ヘッドボードへの記録用マイクロ電極ホルダーの接続
パスします マイクロ

参考文献

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