エタノール鎮静感度との急速な寛容を測定するための安価な、スケーラブルな行動アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

サマリー

ショウジョウバエのエタノール感度と急速耐性を測定するための簡単なアッセイは、これらの重要なエタノール関連の挙動を調査するためのこのモデル生物の使用を容易にします。ここでは、ハエのエタノール感度と迅速な耐性を測定するための比較的単純でスケーラブルなアッセイについて説明します。

要約

アルコール使用障害（AUD）深刻な健康上の課題です。 AUDへの大規模な遺伝性の構成要素にもかかわらず、いくつかの遺伝子が明確に彼らの病因に関与している。ミバエ、 キイロショウジョウバエは 、アルコール関連行動の根底にある分子遺伝学的メカニズムを探索するための強力なモデルであるため、識別し、AUDに影響を与える遺伝子の機能を理解するための非常に有望である。研究は、これらのタイプのためのショウジョウバエモデルの使用を確実にエタノールへの行動応答を測定するアッセイの利用可能性に依存する。このレポートでは、ハエでエタノールの感度と迅速な寛容性を評価するための適切なアッセイを説明しています。このアッセイで測定されたエタノール感受性ハエ、試験の直前に食物なしに収容されているボリュームと使用のエタノール濃度、以前に報告された遺伝子操作で、さまざまな時間の長さも影響される。対照的に、エタノールのこのアッセイで測定されたensitivityフライ取り扱い、ハエの性別、および抗生物質または生酵母と成長培地の補充の活力に影響されない。エタノール感受性を定量するための3つの異なる方法は、すべて本質的に区別できないエタノール感度の結果につながる、記載されている。比較的低経費アップを設定するには、その全体的なシンプルさと組み合わせたこのアッセイのスケーラブルな性質は、エタノール感度やショウジョウバエの急速な寛容の小規模および大規模な遺伝子解析に適したもの。

概要

アルコール使用障害^{（AUD）（1}に概説される）世界的な巨大な健康問題である。 AUDの開発を駆動するメカニズムは複雑ですが、これらの疾患は、主要な遺伝的要素を持っている（ 例えば^、2）。 AUDと保存された行動反応の大遺伝はより良いの分子基盤を理解するためのエタノール関連行動における特定の遺伝子の関与を調査するために、遺伝的モデル生物を使用することに強い関心を生成している^（3,4で検討）は、多くの種にわたってエタノールへAUD。ミバエ、キイロショウジョウバエは^、（3,4で見直 ​​し）エタノール関連行動の分子遺伝学的メカニズムを探索するための主要なモデル生物として浮上している。ハエの研究は^（5で検討）のエタノールへの行動反応のいくつかのシグナル伝達経路のための役割を強調している。興味深いことに、遺伝子および経路のいくつかの行動RESPONSに影響を与えることハエでエタノールのESはまたげっ歯類エタノール関連行動および/ ​​またはヒトAUD（ 例えば^、6-14）に関与している。 ショウジョウバエモデル系で利用可能な遺伝学的ツールのスイートと相まって種にわたってエタノール関連行動を駆動するメカニズムの保全は、エタノールへの行動反応の遺伝学を調査するためのショウジョウバエモデルの有用性を強調する。

感度^15,16及びヒトでエタノールに^（17に概説）耐性はAUDの開発にリンクされている。エタノールへのこれらの行動反応の両方が^（3,4で検討）実験室の種々のアッセイを経由してハエにモデル化することができます。著者らに知られているフライアッセイのすべては、時間依存エタノール誘発鎮静/協調不能またはエタノールの鎮静からの時間依存性の回復のいずれかに基づいている。

エタノール感度とrの遺伝学上の私たちのグループから前回の記事でショウジョウバエ APID耐性が、ハエのエタノール蒸気誘導性の鎮静に基づいて行動アッセイは^、18を使用した。このアッセイにおける試験は、ライブ大人を転送することによって開始されたセルロースアセテートプラグの上部（ すなわち、非フライ側）にエタノールを加え、酢酸セルロースプラグ付きバイアル中のハエトラップ、餌バイアルを空に麻酔なしハエ、およびシリコーンストッパー^（18を参照すると、 図S3に概略参照）ハエ、セルロースアセテートプラグおよびエタノールを含有するバイアルを密封する。ハエの異なるグループを表す複数のバイアルは、このアッセイのスループットを向上させる、並行して評価した。バイアルを匿名コードを与えられたと実験者は鎮静の評価において意図しない偏りを防ぐために、処置群を知らされた。標準実験では、バイアルにハエは6分間隔で穏やかにタッピングし、30秒の回復後、各バイアル中の鎮静さハエの数を数え、converteパーセントの活性ハエにD。ハエは、内部エタノール¹⁸および鎮静（本報告書でのCF参照¹⁸および図1Aおよび1B）の漸進的増加を引き起こし、時間依存的に酢酸セルロースプラグからエタノール蒸気を吸収した。このアッセイにおける鎮静は操作上ハエ（I）歩行の不在に立っまたは（ii）で、またはそれらの羽ばたくことなく、彼らの背中に横たわっていると定義した。ここで、このエタノールの鎮静作用アッセイを詳細に記載され、それを使用に関連するさらなる操作上の最適化が提供され、そしてアッセイは、フライ鎮静感度に対する食物補充オプションの寄与をアドレス指定するために使用される。

プロトコル

アッセイの前に1日

1. 11（シングル性別）短い下（1-5分）CO ₂のグループにおける生鮮食品バイアルにハエを収集します。
2. ハエは、環境的に制御された空間（典型的には25°C、相対湿度60％、12時間の明/暗サイクル）において食物バイアル中にO / Nを回復することを可能にする。
3. 計画された実験のための適切な最終濃度（複数可）に精製された（≥18MΩ）水中の純粋な（100％）エタノールを希釈することによりエタノール溶液（単数または複数）を準備する。溶液（S）は、RT O / Nに戻ることができるようにします。
   注：エタノールの希釈は、発熱性である。

アッセイの2日目

1. ハエの各バイアルを試験するために、きれいな、空の食品バイアル（i）を調製する。すなわち、（ 表3参照）（ii）の新規セルロースアセテートプラグ、（iii）のシリコーンストッパー及び（iv）のエタノール溶液1mlを、バイアルを試験する。
2. 百分の55から65に20〜25℃の温度および相対湿度を調整することにより、試験室を準備します。
3. 別の労働者を持っているバイアルの各グループに一意のコードを割り当て、後でコードを記録する。少数分間順応さ試験室にハエでコード化されたバイアルを置きます。
4. 2.3からフライバイアル上のコードと一致するように空のテストバイアルにラベルを付けます。
5. 表1に似てスプレッドシート内の列（1列/バイアル）にコードを入力することで、ハードコピーのテストログを構築します。
6. ガイドとして、テストログを使用して、試験室で配列をマッチングにハエや空のテスト用バイアルにコード化された食品のバイアルを手配。
   注：テストするバイアルの合理的な最大数は24である（ すなわち、4バイアルそれぞれの6セット）。
7. 転送がマッチした/ラベル空のテストバイアルに食品バイアルから飛ぶと、すぐにセルロースアセテートプラグが2センチメートルバイアルのトップスを下回るまで、テストのバイアルにセルロースアセテートプラグを挿入します。
8. 以下、千鳥1分間隔でセットとして4バイアルの各行を処理します。
9. 時間0評価のために、wは個別に各バイアルを把握i番目の親指と人差し指、バイアルの底にハエをノック30秒待ってから、死んだ/不動であるハエの数をカウントするテーブルの上に静かに3回タップします。ハードコピーテスト·ログに一度に0分を各バイアルのための不動/死んだハエの数を記録します。
10. タイマーが時間0で連続的にカウントアップを起動し、すぐに4バイアルの最初の行/セット用バイアル中にセルロースアセテートプラグにエタノール1mlを加え始める。それらがテストされるために、5秒間隔で、バイアル中のセルロースアセテートプラグにエタノール1mlを加える。エタノールは、セルロースアセテートプラグ全体に均一に吸収されるように円を描くようにセルロースアセテートプラグにエタノールを加える。エタノールは、セット内のすべての4試験バイアルに追加されたとき、それを密封するために、各バイアルシリコーンプラグを差し込む。
11. 時間1、2、3、4、5分で、それぞれ、4つのバイアルの第二、第三、第四、第五及び第六のセットにエタノール1mlを加える。後にシリコーン栓を挿入し続けます4バイアルの各セットにエタノールを添加すること。
12. 時間6分で、親指と人差し指で各バイアルを把持し、バイアルの底にハエをノックテーブルに静かに三回タップ、30秒待ち、その後の合計数をカウントし、記録することによって、4つのバイアルの一組をテストする鎮静されているハエ。スコアは、彼ら（i）は、バイアルの床の上に立ったが、あるいは彼らの羽ばたくことなく、彼らの背中の上を歩く又は（ii）嘘をつかない場合は、鎮静さとして飛ぶ。
13. 表2のスケジュールを使用して5秒間隔でセット内の各バイアルを処理します。
14. 最初のセットのために行われたように7倍、8、9、10および11分の時点で、それぞれのバイアルの第2、第3、第4、第5および第6のセットをテスト。
15. 時間12分で2.12に記載のように、再び4つのバイアルの最初のセットをテストし、それぞれ、13、14、15、16及び17分でのバイアルの第二、第三、第四、第五及び第六のセットをテストし続ける。
16. 2.12で説明したように、すべてのハエがSになるまで、テストのハエを続行edated。
17. ハードコピー·テスト·ログの各バイアルにハエの合計数を入力します。ハエの総数から時間0で不動/死んだハエを検閲。
18. 時間（x軸）対％活性ハエ（y軸）として、各評価時点でのパーセントの活性ハエプロットデータを算出する。三次多項式またはシグモイド曲線から50値（ST50、50％の鎮静までの時間）が収まるまたは曲線下面積を計算鎮静時間を補間することにより、エタノールの鎮静を定量する。
19. デコードされたバイアルからデータをコンパイルし、統計分析を行う（ 例えば、一方向ANOVAボンフェローニの多重比較検定付き）実験計画のために、必要に応じて。

結果

このエタノールの鎮静作用アッセイからの生データは、エタノール蒸気暴露時間の関数として鎮静化されたハエの数である。生データは、時間の関数としてパーセント活性ハエに変換される（一次データ1Aの図、B、D - F）。曲線がフィットするから、一次データからのエタノール鎮静に対する感度が補間を経由して、鎮静時間50（ST50）として曲線（AUC）下の鎮静さまたはAEAになるためにハエの50％に要する時間を定量することができる。以前は予想通りS字状の曲線は幾分良好（平均R ² = 0.997、N = 24、プライマリ·データに合わせても¹⁸三次多項式曲線は、（平均R ² = 0.934、N = 24、 図1A）も主要なデータを適合報告した。 図1B）。カーブフィットからST50の値を決定する代わりに、一次データからのエタノールの鎮静感度も面積として定量することができる曲線下（ 図1C）（AUC、％活性ハエは時間をX）...

ディスカッション

再現可能に意味のある表現型を定量簡単なアッセイは、行動の分析のために大きな価値がある。ここで説明する作業は、エタノールの鎮静感度とショウジョウバエの急速な許容範囲を測定するためのアッセイのいくつかの実用的な側面に対応しています。この作品の焦点では​​ないが、行動の分析は研究の中の被験者のための環境と遺伝的背景を一定に維持することによって促進される。さらに、比較は、典型的に飼育並べて試験したハエの群の間でなされるべきである。この目的のために、この作業で個々の実験内の全てのハエは同じ遺伝的背景を有し、標準的な食物培地で均一な環境条件（25℃、相対湿度60％、12時間の明/暗サイクル）下に並んで飼育した（10食品媒体を明示的に操作されたそれらの実験を除き％スクロース、3.3％のコーンミール、2％酵母および1％寒天）。

ETHここで説明サノール鎮静アッセイは安価で市販の供給源（ 表3）から容易に入手可能である全てが非常に少ない材料（プラスチックバイアル、セルロースアセテートプラグ、シリコーンストッパー及びエタノール）を必要とする。このエ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
食品バイアルVWR		89092-772	ナロー
フラッグジェ	ネゼー/ flystuff.com	49-102	ナロー
シリコンストッパー	フィッシャーサイエンティフィック	09-704-1l	#4
エタノール	Pharmaco-Aaper	111000200	200プルーフ