ここでは、ドナーの肝臓移植片の酸素化ex situマシン灌流を説明するプロトコルを提示します。この記事には、機械灌流用の肝臓移植片を調達および準備し、灌流液を準備し、灌流機械をプライミングし、肝臓移植片の酸素化常温機械灌流を実行するための段階的なプロトコルが含まれています。
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この記事について
サマリー
要約
従来の静的低温保存(0-4°C)とは対照的に、ex situマシン灌流はドナー肝臓のより良い保存を提供する可能性があります。臓器の継続的な灌流は、臓器の質を改善する機会を提供し、移植前にドナーの肝臓のex situ生存率評価を可能にします。このビデオ記事では、肝動脈の圧力と温度を制御した拍動性灌流と門脈の連続灌流を提供するデバイスを使用して、ヒトドナー肝臓のex situ常温マシン灌流(37°C)の段階的なプロトコルを提供します。灌流液は、2つの中空糸膜型人工肺装置によって酸素化され、温度は10°Cから37°Cの間で調整できます。灌流中、肝臓の代謝活性と損傷の程度は、灌流液から採取したサンプルの生化学的分析によって評価できます。機械灌流は、移植に適した肝臓の数を増やすための非常に有望なツールです。
概要
現在の肝移植における臓器保存法は、ドナー肝を冷温（0-4 °C）の保存液（ウィスコンシン大学溶液やヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液など）で灌流し、その後保存する方法である。この手法は静的冷保存（SCS）と呼ばれる。0-4 °Cにおける肝臓の代謝率は非常に低いが、それでも0.27 µmol oxygen/min/gの肝組織への酸素需要があり、SCSではこれを供給することができない1。したがって、従来のSCS法は、ドナー肝にある程度の（追加的な）損傷をもたらす。高品質なドナー肝では、この程度の保存損傷は問題とならないが、ドナーですでに一定の損傷を受けているサブオプティマルな（最適ではない）肝臓では、これが重大な制限要因となる可能性がある。このため、品質がサブオプティマルな肝臓や、いわゆる拡張判定ドナー（ECD）肝は、早期のグラフト不全のリスクが高すぎると考えられ、移植に不適として拒否されることが多い。循環停止後ドナー（DCD）からの肝臓、高齢ドナー、または脂肪肝グラフトのレシピエントでは、遅延性グラフト機能不全、原発性不機能、および非吻合部胆管狭窄（NAS）の高い発生率が報告されている2。NASは肝移植後の罹患率および死亡率の主要な原因である。NASはドナーの肝外および肝内胆管の両方で発生する可能性があり、管腔内の胆泥や鋳型形成を伴うことがある3,4。NASの病因は多因子的なものと考えられているが、グラフト保存および移植中の胆管の虚血再灌流傷害が主要な基礎メカニズムとして特定されている2,5。DCDグラフトの移植は、NAS発症の最強のリスク因子の1つとして特定されている。DCDドナーにおける温暖虚血期間、臓器保存中の冷虚血、およびその後のレシピエントにおける再灌流傷害の組み合わせが、胆管の不可逆的な損傷の原因と考えられており、これが胆管の低い再生能力と相まって、肝移植後の胆管の線維性瘢痕化と狭窄を招く2,5。DCD肝を移植された患者の最大30%にNASが報告されている6-8。移植用肝グラフトに対する現在のSCS法は、DCDドナー由来のような、あらかじめ損傷を受けたECD肝に対しては不十分であることが明らかになっている。ECD肝の移植利用を拡大し最適化するためには、代替的な手法が必要である。
機械灌流（MP）は臓器保存の一手法であり、単純冷却保存（SCS）と比較してドナー臓器をより良好に保存できる可能性があります。MPは、特に拡大基準ドナー（ECD）グラフトの保存において有用と考えられます。MPの重要な利点は、保存期間中にグラフトへ酸素を供給できることです。MPはさまざまな温度で実施でき、低体温（0-10 °C）、亜正常体温（10-36 °C）、および正常体温（36-37 °C）の正常体温機械灌流（NMP）に分類されています。MPに使用する温度に応じて灌流液の種類を調整する必要があり、温度が上がるにつれてより多くの酸素を供給する必要があります。ヒト肝移植におけるMPの最初の臨床応用は、灌流液への能動的な酸素供給を行わない低体温灌流に基づいたものでした9,10。動物モデルにおいて、低体温酸素化MP（0-10 °C）は肝グラフトの虚血再灌流傷害に対する保護効果を有し11、胆管の胆管周囲血管叢をより良好に保存することが示されています12。20 °Cまたは30 °Cでの亜正常体温酸素化MPも動物モデルで研究されており、SCSと比較してDCD肝のグラフト機能がより早期に回復することが示されました13,14。ヒト肝臓における亜正常体温酸素化MPの実現可能性については、最近、廃棄予定のヒトドナー肝7例のシリーズで報告されました15。NMP（37 °C）では、移植前にグラフトの生存能および機能性を評価することが可能です16,17。さらに、MPを用いることで移植前に肝グラフトを徐々に再加温させることができ、これによりグラフトの回復と蘇生が促進されることが実証されています18。
本プロトコルで使用される肝臓機械灌流装置は、2台の遠心ポンプを用いて門脈および肝動脈を介した二方向灌流を可能にし、門脈への持続的な血流と肝動脈への拍動流を提供します。本システムは圧力制御方式であり、肝内抵抗に応じて肝臓を流れる流量が自動調節されます。2つの中空糸膜オキシゲネーターにより、肝移植片への酸素供給およびCO2の除去が行われます。温度は、予定しているMP（機械灌流）のタイプに基づいて設定可能です（最低温度10 °C）。流量、圧力、温度はデバイス上にリアルタイムで表示され、灌流プロセスの継続的な制御が可能です。各移植片の灌流には、チューブ、リザーバー、およびオキシゲネーターからなる新しい滅菌使い捨てセットが用意されています（図1）。
このビデオ記事の目的は、新たに開発された肝灌流装置を用いて、ヒトドナー肝臓のex situ常温機械灌流を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供することです。
図 1: ヒトドナー肝臓の常温灌流に使用される、（A）概略図、（B）灌流装置の写真、（C）オキシゲネーターの拡大図、および（D）遠心ポンプ。こちらのリンクから、本図の拡大版をご覧いただけます。
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プロトコル
本プロトコールは、オランダのフローニンゲン大学医療センターの医学倫理委員会（Medisch Ethische Toetsingscommissie）によって承認されています。
1. 灌流液の調製
注：本プロトコルに従って常温機械灌流用に調製される灌流液の総量は2,233 mlであり、灌流液の目標浸透圧は302 mOsmol/Lである。
- 表1に記載されている灌流液の成分のうち、ヒト濃厚赤血球、新鮮凍結血漿、およびヒトアルブミンは分けておく。残りの成分を無菌的に混合し、溶液を滅菌バッグに保存して手術室（OR）へ搬送する。この操作は、無菌環境（理想的にはGMP施設）または培養室の層流キャビネット内で行う。
| 構成要素 | 数量 |
| 濃縮赤血球（ヘマトクリット値 60%） | 840 ml |
| 新鮮凍結血漿 | 930 ml |
| ヒトアルブミン 200 g/L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| 修正静脈栄養剤（Clinimix N17G35E、Baxter International Inc.） | 7.35 ml |
| 点滴注入用マルチビタミン剤（Cernevit, Baxter International Inc.） | 7 μl |
| 点滴静注用濃縮微量元素製剤（Nutritrace, B. Braun Melsungen AG） | 7.35 ml |
| 静脈内投与用メトロニダゾール (5 mg/ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| セファゾリン 1,000 mg 5 ml バイアル 静脈内投与用粉末 (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| 速効性インスリン (100 IU/ml) (Actrapid®, Novo Nordisk) | 20 ml |
| グルコン酸カルシウム、静脈内注射液10%、137.5 mg/ml (Sandoz) | 40 ml |
| 滅菌済みH2O | 51.3 ml |
| 0.9% NaCl溶液 | 160 ml |
| 8.4%炭酸水素ナトリウム溶液 | 31 ml |
| 静脈内投与用ヘパリン 5,000 IE/ml | 4 ml |
| 合計 | 2,233 ml |
表1：灌流液の組成16.
- ヒト濃厚赤血球 (840 ml)、新鮮凍結血漿 (930 ml)、ヒトアルブミン 200 g/L (100 ml)、およびステップ1.1で調製した溶液を、灌流装置に投与するため手術室へ運搬する。
2. 灌流装置のプライミング
- ヒト濃厚赤血球、新鮮凍結血漿、ヒトアルブミン、およびステップ1.1で調製した溶液を含む灌流液の構成成分を、オキシゲネーター上部のコネクターを介して装置に加え、チューブ内の気泡をすべて除去する。
- 静脈ポンプのスイッチを入れ、画面上のメーカーの指示に従う。次に動脈ポンプを起動し、同様に画面上のメーカーの指示に従う。
- 画面上の指示に従い、圧力計を大気圧に対してゼロ点調整（ヌリング）する。これにより、灌流中に測定される圧力が、門脈および肝動脈レベルでの実際の圧力となることが保証される。
- カルボゲン（95% O2 + 5% CO2）を用い、流量 4 L/min で酸素供給を開始する。空気の流れは2台のオキシゲネーターに分配され（1台あたり 2 L/min）、これにより灌流液中のpO2は約 60 kPa（または 450 mmHg）になる。長時間の灌流を行う場合は、酸素と二酸化炭素の供給源を分けることが推奨される。これにより O2/CO2 比の微調整が可能となり、灌流液の pH および pCO2 を調整することができる。
- 装置のプライミングから 15-20 分後に、血液ガス測定用の灌流サンプルを採取し、pH と電解質をモニタリングする。
注意：サンプルを採取する前に、約 3 ml の灌流液を必ず廃棄すること。この液体は末梢チューブ内にあり、システム内の灌流液を代表していないためである。緩衝能を確保するために 8.4% 重曹液（炭酸水素ナトリウム溶液）を添加し、生理的 pH（7.35-7.45）を目指す。例えば、8.4% 重曹液を 25-35 ml 添加し、定期的に血液ガス測定用のサンプルを採取して、灌流液中の pH と重曹レベルを確認する。
3. ドナー肝臓の調達と調製
注：in situ冷却の標準的な手法を用いて臓器を採取し、冷保存液（0-4 °C）で洗浄してください19。動脈のカニュレーションを容易にするため、肝動脈に上胸大動脈の一部を付着させたままにしておきます（図 2A）。
- 保存液（すなわち University of Wisconsin solution）で胆管をフラッシュする。外科用縫合糸で胆嚢管を結紮する。
- 臓器を標準的な滅菌ドナー臓器用バッグおよびボックスに詰め、砕氷とともに保管して、その後MPセンターへ輸送する。
- ドナー肝臓が手術室に到着後、直ちにバックテーブル処置を開始する。
- 微生物学的検査のため、保存液を少なくとも 10 ml サンプリングする。
- 外科用ハサミを用いて、肝臓の裸野への横隔膜付着部および大静脈上端に残っている心筋を除去する。
- 解剖用ハサミを使用して動脈および門脈を剥離し、側枝を外科用縫合糸またはヘモクリップで結紮する。
- 非吸収性モノフィラメント縫合糸（例： 3-0 Prolene）を用いて、上胸部大動脈セグメントの遠位端を閉鎖する。上胸部大動脈の近位端に動脈カニューレを挿入し、縫合糸で固定する（図 2A）。灌流装置のメーカーが提供する使い捨てパッケージに同梱されているカニューレを使用する。
- 門脈に静脈カニューレを挿入し、縫合糸で固定する。使い捨てパッケージに同梱されているカニューレを使用する。肝静脈にはカニューレを挿入しない。
- 保存液で胆管をフラッシュする。シリコンカテーテルを胆管に挿入し、縫合糸で固定する。
注：カテーテルを胆管に深く挿入しすぎないこと。胆管上皮を損傷させる可能性がある。 - 門脈カニューレを介して、以下の通り 0.9% NaCl 溶液で肝臓をフラッシュする：
- 移植片が保存液として University of Wisconsin solution で保存されていた場合は、2,000 ml の冷 (0-4 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュした後、500 ml の温 (37 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュする。
- 移植片が保存液として Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution で保存されていた場合は、1,000 ml の冷 (0-4 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュした後、500 ml の温 (37 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュする。温フラッシュの目的は、灌流液の温度が大幅に低下するのを防ぐことである。
- 肝臓を灌流装置に接続する直前に温フラッシュを行う。
注：温フラッシュから NMP 開始までの時間は、常に 1-2 min 未満に保つこと。
| ドナーの特性 (N = 12) | 件数 (%) または中央値 (IQR) |
| 年齢（歳） | 61 (50-64) |
| 性別（男性） | 8 (67%) |
| ドナーの種類 DCD、マーストリヒトタイプIII DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| ボディマス指数 (BMI) | 27 (25-35) |
| 却下理由 DCD+ 年齢 >60年 DCD+ 高BMI DCD（循環停止後ドナー）＋さまざまな理由* 重度脂肪肝 | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) 2 (17%) |
| 保存液 UW溶液 HTK溶液 | 6 (50%) 6 (50%) |
| DCDにおけるドナー温虚血時間（分） | 14 (17 - 20) |
| 冷虚血時間（分） | 389 (458-585) |
| ドナーリスクインデックス (DRI) | 2.35 (2.01-2.54) |
表2：ドナーの特性。 * 1つの移植片についてはドナーに静脈内薬物乱用の既往があり、別の移植片については生命維持装置の停止後にドナーのsO2 <30%の状態が持続した。 略語： DCD：循環停止後ドネーション、DBD：脳死後ドネーション、UW：ウィスコンシン大学液、HTK：ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸液
図 2: (A) バックテーブルで準備されたヒトドナーグラフトの写真、および(B-D) その後、常温灌流が行われた様子。(A) 動脈カニューレを上行大動脈に、静脈カニューレを門脈に挿入している。胆管にはシリコン製胆管カテーテルが留置されている。(B) 肝臓を前面が下になるように臓器チャンバー内に配置し、カニューレを灌流装置のチューブに接続している。(C) 常温機械灌流開始から30分後。(D) 常温機械灌流開始から6時間後。操作中、肝臓の無菌的で湿潤な環境を維持するため、臓器チャンバーは透明なカバーで覆われている（これらの写真では示されていない）。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
4. 常温機械灌流
- 肝臓の前面を下にして臓器チャンバーに配置する。すぐに、門脈カニューレを灌流装置の門脈流入チューブに、動脈カニューレを装置の動脈流入チューブに接続し、プライミング済みの灌流装置に肝臓を接続する。
- 画面上の製造元の指示に従い、門脈側と動脈側の両方で灌流を開始する。平均動脈圧を 70 mmHg、平均門脈圧を 11 mmHg に設定する。
- 30分ごとに灌流液サンプルを採取し、一般的な血液ガス分析装置を用いて、血液ガスパラメータ（pO2、pCO2、sO2、HCO2-、pH）および生化学的パラメータ（グルコース、カルシウム、乳酸、カリウム、ナトリウム）を直ちに分析する。サンプリング前に灌流液を約 3 ml 廃棄すること。この液は末梢チューブ内にあり、システム内の灌流液を代表していないためである。
- これらのサンプルを採取するには、灌流装置の使い捨てチューブセットの一部であるサンプリングコネクタから、1 ml シリンジを用いて灌流液を吸引する。サンプルごとに新しいシリンジを使用し、灌流液の吸引後は直ちにシリンジ内の気泡を取り除く。その後、シリンジを血液ガス分析装置に挿入し、分析装置のマニュアルに記載されている製造元の指示に従う。
- アルカリホスファターゼ (AlkP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ (gamma-GT)、アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT)、尿素、および総ビリルビンの測定のため、灌流液から血漿を回収し、-80 °C で凍結保存する。灌流液を 1,500 x g、4 °C で 5 分間遠心分離した後、血漿を回収する。
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結果
様々な理由で移植が見送られた12例のヒト肝臓を、ドナー家族から研究へのインフォームドコンセントを得た後に使用した。ドナーの特性は表2に記載されている。ヒトドナー肝臓を、本論文に記載されたプロトコルを用いて6時間、常温で灌流した。肝移植片の品質は、肝灌流のマクロな均一性をモニターすることで評価した（図2A-D）。肝臓の血液動態は、動脈血流および門脈血流の変化をモニターすることで評価した。肝動脈および門脈の血流が当初増加し、その後安定することが観察され、6時間時点での平均動脈血流量は256 ± 16 ml/min（平均 ± SEM）、平均門脈血流量は748 ± 34 ml/min（平均 ± SEM）となり、灌流中の肝臓の血液動態が安定していることが示された（図3A）。動脈灌流液から採取した灌流サンプルを用いて血液ガス分析を行い、灌流液中の酸素化状態をモニターした。カーボゲン（95% O2および5% CO2）を4 L/minの流量で...
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ディスカッション
このビデオでは、肝動脈と門脈を介した圧力制御された二重灌流を可能にするデバイスを使用して、ヒトドナー肝臓の常温機械灌流のための段階的なプロトコルを提供します。このプロトコルに従っている間、灌流装置の技術的な故障は発生せず、すべての移植片は十分に灌流され、十分に酸素化されました。 その場外 灌流肝臓は、胆汁の産生によって定義されるように、安定した血行動態を持ち、代謝的に活発でした16,17。
これは、ヒトドナー肝臓の機械灌流のための確立されたプロトコルです。この技術には、SCS21 の従来の方法に比べていくつかの潜在的な利点があります。機械灌流は、臓器保存の意図されたエンドポイントに応じて、ドナー肝移植片をさまざまな温度で保存する機会を提供します。低体温酸素化機械灌流は、微小血管培養の灌流と洗い流しを改善し、アデノシン三リン酸 (ATP) の再生を刺激することにより細胞内エネルギー量の回復に役立つ可能性があります。ただし、移植片の生存率を完全に評価するには、より生理学的な温度 (常温下または常温) での灌流が必要です。灌流...
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開示事項
この原稿の著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、オランダのInnovatief Actieprogramma Groningen（IAG-3、Jan Kornelis de Cock Stichting、Tekke Huizingafondsからの助成金によって財政的に支援されました。私たちは、廃棄される可能性のある肝臓を特定し、インフォームドコンセントを取得してくれたすべてのオランダの移植コーディネーターに感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 肝臓補助 | 臓器補助 | OA。Li.Li.140 | 灌流装置 |
| 肝臓アシスト使い捨てパッケージ | 臓器アシスト | OA.Li.DP.540 | 使い捨てセットとカニューレ |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | 胆管カニューレ |
| ヒトアルブミン 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Modified Noneroral nutrition | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7.35 ml |
| 輸液用マルチビタミン / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μl |
| 輸液用濃縮微量元素 / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7.35 ml |
| メトロニダゾール 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| セファゾリン / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| 速効型インスリン | さまざまなベンダー | 20 ml | |
| グルビオン酸カルシウム、静脈内溶液 10%、137.5 mg/ml | サンドス | 97038695 | 40 ml |
| 滅菌 H2O | フレゼニウス カビ オランダ B.V. | 98084453 | 51.3 ml |
| NaCl 0.9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| ヘパリン 5,000 IE/ml for i.v. iv. | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| 重炭酸ナトリウム 8.4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | 量は pH によって異なります |
| パック赤血球 (SAGM) | 血液銀行 (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| 新鮮凍結血漿 | 血液銀行 (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
参考文献
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