方法論記事

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

DOI：

10.3791/52698

⸱

2015年4月30日

 ,  ,  , 
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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有孔肝正弦波内皮細胞は、さまざまな病気、毒素、生理学的状態の影響を強く受ける生物学的に重要なフィルターシステムです。これらの変化は肝機能に大きな影響を与えます。これらのセルの開窓のサイズと数の測定を標準化する方法について説明します。

要約

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肝臓の正弦波内皮細胞は肝臓への入り口であり、その経細胞開窓は、血液からの小さな溶解した物質を肝臓実質にスムーズに移動させ、代謝と処理を行うことを可能にします。開窓は動的な構造であり、そのサイズや数の両方がさまざまな生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変化する可能性があるため、調節の重要なターゲットになります。LSECの形態がさまざまな疾患、毒性、生理学的状態によってどのように影響を受けるか、またこれらの変化が肝機能にどのように影響するかを理解するには、開窓のサイズと数を正確に測定する必要があります。この論文では、再現性のある試料調製と正確な解釈を確保するために当研究室で使用されている走査型電子顕微鏡の固定および処理技術について説明します。その方法には、灌流固定、二次固定および脱水、走査型電子顕微鏡の調製および分析が含まれます。最後に、標準化された画像分析のための段階的な方法を提供し、この分野のすべての研究者に利益をもたらします。

概要

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肝類洞内皮細胞（のLSEC）は、高度の肝正弦波の壁を覆う内皮細胞を分化されます。のLSECを非diaphragmedある穿孔で穿孔され、経細胞は、直径50〜250 nmの細孔。のLSECの表面の最大20％が篩板1-3（ 図1）と呼ばれる数十〜数百のグループに通常は穿孔によって覆われています。開窓は非常に効率的限外濾過システムを作成し、血液と肝細胞との間にプラズマとnanosubstratesの転送を可能にします。開窓は動的構造である - それらのサイズおよび/または数の両方は、種々の生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変更することができます。例えば、開窓は摂食状態4よりも絶食が大きいです。 2ジヨードアンフェタミンは開窓の数を増加させ、5,6および細胞あたり穿孔のサイズおよび数の減少は、加齢および多くの疾患状態7-13で起こります。穿孔のサイズと数の正確な測定は、LSECの形態は、種々の疾患、毒性、および生理学的状態に影響される方法を理解するために重要です。肝機能に及ぼす影響。および開発するための治療的介入1を開窓を調節。

開窓の研究は困難です。開窓の直径は、両方の無傷の肝臓組織または培養のLSECに電子顕微鏡を用いて、先にのみ観察が可能であった、従来の光学顕微鏡の解像度の下にあります。走査型電子顕微鏡（SEM）は、最も....

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プロトコル

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注：動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われます。私たちの仕事はシドニー現地保健地区動物福祉委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載されており、すべての回で、動物の福祉を確保するためのガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律の遵守を確認してください。

EM固定剤を調製するための1プロトコル

  1. 固定液100mlを、磁気撹拌機で絶えず撹拌しながら、三角フラスコに蒸留水25ミリリットル、65ºCの熱パラホルムアルデヒド粉末2gを添加することによって、パラホルムアルデヒドを準備します。
    注：グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびカコジル酸ナトリウム緩衝液は、すべての有害物質であり、常に換気フード内で処理する必要があります。
  2. 2分間65ºCの熱は、その後冷却します。必要に応じて、水酸化ナトリウム溶液を加えるdropwISE完全に透明な溶液に、撹拌しながら。
    注：水酸化ナトリウムは危険です、取り扱いに注意して。
  3. EMグレードの株式のグルタルアルデヒドの10ミリリットル、50の0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液mlのショ糖の2グラムを追加し、マグネチックスターラーで攪拌します。 1.0 M CaCl 2を2ミリリットルを追加します。
  4. 蒸留水で100mlにソリューショ....

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結果

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走査電子顕微鏡による低倍率での初期の可視化は、多くの大規模な肝血管および正弦波（ 図1A）を観察するのに十分な大き露出面積と肝臓試料の平らな面を明らかにする。実装スタブの正しい肝臓ブロック配置を確保することが、この理由（ 図1B）のために避けるべきである正弦波と肝臓のグリソン鞘の鮮明な画像を得るために必須です。倍率を大きくすると、肝臓の密な血管構造の精密検査を可能にし、血管（ 図1C）を分割し、肝細胞の単一細胞プレートを明らかにする。悪い画質、血液細胞および残骸における肝結果の悪い固定肝臓（ 図1D）の視野を不明瞭。

また、倍率を大きくすると、LSECの開窓（ 図2A）の観察を可能にします。これは、正弦波がCORRていることが不可欠です ectly特定さ-肝細胞のプレートは、ある状況下で、このような姿勢（ 図2B）を支援細管胆汁などの血管が、機能のように見えることができます。高い灌.......

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ディスカッション

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正確かつ再現肝類洞内皮の状態を測定する能力は、これらの非常に特殊化した細胞の生物学を理解する上で重要なステップです。このような構造化照明顕微鏡32などの新しい技術、原子間力顕微鏡33とD-STORM（直接確率光学Reconstrucion顕微鏡）34は、 インビトロでこれらの細胞の形態に関する重要な情報を付与しますが、SEMはにその構造を視覚化し、測定するために主要な方法論のままその場で 。

最も重要と技術的に困難なステップは、初期固定である：肝臓がよく保存されている場合は後続のステップは、肝臓の正弦波の画像を容易に観察し、確かに、美しい生成されます。肝臓全体の灌流は良好な定着性を確保するための最も有効な方法であるが、同等の結果はすぐに修正されている針灌流サンプルが可能です低圧下で。脱水肝臓サンプルによる水の吸収が悪いSEM像のための別の一般的な理由ですが、これは簡単に乾燥剤とのデシケーター内のサンプルを適切に保管することによって回避することができます。

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者には謝辞がありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25% EMグレードのグルタルアルデヒドProSciTechC001必要になるまでストックを-20°Cで保管し、再凍結を避けてください
パラホルムアルデヒド粉末シグマ・アルドリッチ158127常にパラホルムアルデヒドの新鮮な
カコジル酸ナトリウム粉末を準備します シグマ・アルドリッチC02500.2 Mストック、pH 7.4 粉末をdH2Oに溶解することにより、主に0.1 Mで1:2希釈を調製して使用します
塩化カルシウムSigma AldrichC1016粉末をdH2Oに溶解して1 M CaCl2を調製
ミウムトレトロキシドProSciTechC011汚染を避けるために、使用前にアンプルを弱酸で洗ってください。ガラス瓶に2%のストックを準備し
ます エタノール- アブソリュートシグマアルドリッチ459836 100% エタノールは高品位でなければならず、モレキュラーシーブで保管する必要があります
エタノールLabtechEL5dH2Oヘ
キサメチルジシラザンシグマアルドリッチ52619 使用前に室温に戻してください
CannulasTerumoTSROX1832C、TSROX2225C、TSROX2419C18 Gはほとんどのラットに適しています、22 Gはほとんどのマウスに適していますが、非常に小さなマウスの場合には、手元にいくつかの24 Gを持っているのが良いです
導電性カーボンテープProSciTechIA0201
カーボンペイントProSciTechI003
ケタミンライセンスに基づいて取得する必要があります
ラジンライセンスに基づいて取得する必要があります
モレキュラーシーブシグマ アルドリッチ208647100% エタノールから水を取り除きます
します オスの他のグレード キシ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal....

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