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方法論記事

などの酸素グルコース欠乏および再酸素化

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DOI:

10.3791/52699

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2015年5月7日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Texas A&M University Health Science Center College of Medicine, 2Department of Surgery, Baylor Scott & White Health

この記事について

サマリー

虚血再灌流(IR)損傷は、高い罹患率と死亡率と関連しています。ここで説明する酸素-グルコース欠乏および再酸素化(OGD-R)のin vitroモデルの目標は、さまざまな細胞、特に血液脳関門(BBB)内皮細胞に対する虚血再灌流障害の影響を評価することです。

要約

虚血再灌流（IR）傷害は、虚血性脳卒中に関連する罹患率および死亡率に大きく寄与することが知られています。虚血性脳血管障害は、すべてのストロークの80％を占めています。 IR傷害の一般的な原因は、血液の急性/慢性閉塞次流体、栄養素、フリーラジカルの形成を誘発する組織への酸素の迅速な流入です。

虚血性脳卒中は、血液脳関門（BBB）機能不全および血管原性脳浮腫が続きます。構造的には、内皮細胞間のタイトジャンクショ​​ン（のTJ）は、血液脳関門（BBB）の完全性を維持する上で重要な役割を果たしています。 IR傷害は、非特異的、炎症反応を引き起こす早期二次損傷です。炎症次酸化および代謝ストレスがBBBの透過性とタイトジャンクショ​​ン（TJ）の完全性の破壊などの二次的脳損傷を誘発します。

我々のプロトコルは、in vitroでの提示します</ em>のラット脳内皮細胞TJの整合性とストレスファイバー形成の酸素 - グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）の例。現在、in vivoモデルでいくつかの実験は、IR傷害の影響を研究するために使用されます。しかしそれらは、手術、遺伝子依存性分子の影響とメカニズムの関係を研究することの困難を行う際に技術的な問題など、いくつかの制限があります。しかし、in vitroモデルは、これらの制限の多くを克服するのを助けることができます。提示されたプロトコルは、潜在的な治療戦略を提供するために、様々な分子機構と機械的な関係を研究するために使用することができます。しかし、in vitro試験の結果は、in vivo試験で 、標準と異なる場合があり、注意して解釈されるべきです。

概要

虚血再灌流（IR）傷害は、脳卒中、心筋梗塞、外傷、末梢血管疾患および外傷性脳損傷1,2に関連する様々な衰弱性の合併症や死亡の頻繁な原因であることが見出されています。脳血管のIR傷害は、炎症および浮腫3につながる初期の二次的損傷です。酸化および炎症次代謝ストレスの結果として生じる重篤な合併症の一つは、恒常的なフリーラジカル形成をもたらすバランス、血液脳関門の変化（BBB）タイトジャンクション（のTJ）と微小血管透過性4,5の損失です。

現在、BBBにおけるIR傷害の影響を研究するために使用される生体内モデルにおいて 、中大脳動脈閉塞（MCAO）、微小塞栓、およびトランスジェニックまたはノックアウト動物を含みます。 Hossmann 6で説明したようにしかし、それぞれがその欠点と制限があります。 MCAOモデルはeffecを研究するために使用されますレドックスストレスのTS、BBBの接合部コミュニケーションの変化と脳と免疫細胞間の相互作用。しかし、彼らはその中に正確な顕微手順や困難の必要性など、様々な技術的な課題を提示します。脳虚血を研究するためのトランスジェニックまたはノックアウト動物の使用は、梗塞形成上の遺伝子に依存する分子の影響、血管構造の変化と変化させ、体重6のような課題を持っているかもしれないが微小塞栓は、瞬時にBBBを分解します。したがって、虚血のin vitroモデルは、薬物のための機構研究を行う際にその適用に起因する主に最近の関心を増大させる発見しました。しかし、in vitro試験の結果が完全にin vivo試験を表していない場合があり、注意6と解釈されなければなりません。

内皮細胞単層および微小血管透過性の低酸素濃度の反作用効果がありました小川7によって研究。ラット脳微小血管内皮細胞（RBMECs）はインビトロ BBBを開発するために使用されました。このプロトコルで提示酸素-グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）技術はスルエタらと朱ら 8,9によって研究から適応されています。我々は、0％O 2、5％CO 2及び95％N 2を含む、低酸素/無酸素チャンバー中に置くことにより、OGD-Rの脳内皮細胞を曝露しました。細胞は、後にそれぞれの免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジンラベルを使用して、TJの整合性とストレスファイバー形成の変化について評価しました。閉鎖帯-1（ZO-1）についての免疫蛍光染色は、ZO-1と、TJの完全性を決定するために実行されることTJタンパク質に結合した重要な足場膜です。ローダミンファロイジン標識が細胞骨格に繊維状アクチン（Fアクチン ）を決定し、内皮細胞におけるアクチンストレスファイバー形成の明確な指標です。

この方法の目的は、BBB内皮細胞TJの整合性とF-アクチンストレスファイバー形成を研究するためのin vitroでの IRモデルとしてOGD-Rの開発に洞察力を提供することにあります。結果は、TJタンパク質の運命についての情報を提供し、ZO-1およびOGD-R次のストレスファイバー形成します。これらの関係を理解することはOGD-R以下のトリガされる根底にある分子メカニズムを決定し、OGD-R処理後のBBB破壊を増強する潜在的な治療戦略を開発する機会を提供します。

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プロトコル

内皮細胞の1播種

  1. 大人のSDラットからRBMEC年代の初代培養物を得る（または商業的にそれらを得ます）。
  2. 100センチメートルフィブロネクチン（50μg/ mlの）ラット脳内皮細胞増殖培地を用いて被覆されたペトリ皿で​​RBMECs育成。密集度に到達するまで、2日ごとに培地を変更します。
  3. 80〜90％コンフルエントに達すると、穏やかに旋回を5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。次いで、細胞を37℃に平衡化した温かい0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液1ml、それらを暴露することによって分離されます。
  4. 細胞が剥離して分散されるまで2〜5分間、37℃で細胞をインキュベートします。
    注：細胞を剥離するために培養皿をタップします。顕微鏡下で見る細胞が皿の表面から細胞を完全に剥離を確認しました。
  5. トリプシンを中和するためにペトリ皿に5ミリリットル完全培地を追加します。剥離した細胞を含む培地をピペット15mLの遠心分離管にそれを収集します。 。
  6. 遠心分離媒体を5分間220×gでの内皮細胞を含みます。
  7. 上清を吸引した後、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いてカウントされるピペット細胞で軽くそれを混合することにより、およびダウン3〜5ミリリットルの新鮮なラット脳内皮細胞増殖培地中にcells.Suspendにペレットを含むペレットを保存します。
  8. ウェルあたり10,000〜15,000細胞の間の範囲の播種密度で8ウェル滅菌チャンバースライドシステム0.7 cm 2で/ウェルをプレコートフィブロネクチンへの細胞懸濁液（50μg/ ml）を転送します。コンフルエンスが達成されるまで37℃で細胞を増殖させます
    注：実験によって要求されるようにウェスタンブロットまたは他の実験を行うために、細胞を10cmの細胞培養皿または特殊皿で増殖させることができます。

2.酸素およびインビトロでのグルコース欠乏、再酸素化モデル

注：以下のプロトコルをスルエタらから適応されています。 1997;朱H ら。2012 8,9。

  1. （ 図1参照）でRBMECsのOGD-Rの効果を研究するために、低酸素細胞培養システムを使用してください。セットアップし、製造業者の指示に従って、実験を開始する前に、低酸素細胞培養系を較正します。
  2. 37℃のインキュベーターからコンフルエントチャンバースライド（ステップ1.8）を取り外します。 OGD状態を表すために、37℃で2時間、脱酸素とチャンバースライドで完全培地、無グルコース、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および95％の低酸素チャンバーに入れ、N 2及び5％CO 2を交換します。
  3. 37℃で95％O 2、5％CO 2インキュベーターで逆に細胞を移動させ、新鮮なラット脳内皮細胞の完全な媒体を備え、37℃でさらに1時間インキュベートします。
    注：このステップは、再酸素化の状況を表しています。
  4. 免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジン標識のためチャンバースライドを使用します（セクション3を参照）。

3.免疫ZO-1の局在とローダミンファロイジンを使用したFアクチンラベリング

  1. OPTI-MEM /低血清培地/ウェルの1時間の100μlにRBMEC単層を含むチャンバースライドを公開します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pHが7.0〜7.2）100μlのチャンバースライドを3回洗浄します。
  2. 15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（pHは7.0〜7.2）の100μLを使用して細胞を固定し、PBSで3回（pHは7.0〜7.2）のためのチャンバースライドを洗浄します。
  3. さらに15分間、PBS中0.5％トリトンX-100100μlの、（pHが7.0〜7.2）を用いて細胞を透過性。時間、PBS中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）100μlでブロックします。 ZO-1またはF-アクチンのためのこのステップのいずれかで染色/ラベル細胞のいずれかの後に。
    1. 免疫STA用ining 1にZO-1に対する抗ウサギ一次抗体で細胞をインキュベートする：150、Oのために/ N 4℃にて2％BSA-PBS中で調製しました。細胞をPBS中で3回、（pHは7.0〜7.2）を洗浄します。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）100μlでインキュベートし、室温で1時間、抗ウサギ二次抗体をタグ付き。
    2. ローダミンファロイジン標識のために、ブロッキングに続いて、20分間、2％BSA-PBS中で調製し、1：50希釈でローダミンファロイジンの100μlに細胞を公開します。
    3. （pHは7.0〜7.2）、PBS中の免疫蛍光染色およびローダミンファロイジン標識から細胞を洗浄します。 DAPIと退色防止試薬を含むマウント培地を用いてチャンバをマウントします。
  4. 60 Xの水浸レンズを用いて細胞を視覚化し、細胞を共焦点顕微鏡下で単一の光学面に走査されます。

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結果

フィブロネクチンプレコートヌンクIIチャンバースライド上で培養した細胞はBiospherix ProOxモデル110チャンバー内に配置することにより、OGD-Rに供しました。ローダミンファロイジン染色ラベルを使用して、Fアクチンストレスファイバーの形成を示す図2及び細胞骨格の組み立てに示すように、図3に示すように、OGD-Rの細胞を施した後、それらは、免疫蛍光技術を使用してZO-1接合部染色のために処理した。あった対照細胞をOGD-Rに供内皮細胞がTJインテグリティ図2の消失を示し、不連続な接合を示したOGD-Rを受けないで継続的な接合部の完全性を示さなかった。OGD-R処理を行わなかった対照細胞は、全くまたは最小限のFアクチンストレスファイバーを示しました。形成OGD-Rにかけた内皮細胞は、アクチン細胞骨格の組み立て図3の変化を示す増加Fアクチンストレスファイバー形成を実証している間、代表リファレンス＃13からの許可を得てRINT

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ディスカッション

虚血再灌流障害のためのin vitroモデルとしてOGD-Rはよくニューロン10,11を研究するために設立されました。透過性及びTJの整合9における脳内皮細胞および変更のOGDの影響を示す研究もあります。しかし、我々の研究は、虚血性脳卒中後の発生のインビボ条件における虚血再灌流障害の近い表現である、OGDの影響だけでなく、再酸素化を示しています。

低酸素性虚血性の条件は、傍細胞透過性および血管原性浮腫4を増加させることによって、破壊をBBBに至る、中枢神経系の炎症を誘発することが知られています。再灌流障害は、過剰な活性酸素種の生成がである、非常に複雑で動的なプロセスであるATP枯渇、細胞外カリウム、興奮性神経伝達物質の放出、内皮細胞および神経細胞の腫脹、免疫細胞活性化の上昇します。このターンCでBBBの完全性5,12の破壊につながる、さまざまなカスパーゼを活性化することが示されているすべてのそれらのausesの種々の炎症性経路の活性化、サイトカイン産生につなが...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々は、共焦点レーザー顕微鏡を使用するための財政支援と医療の統合イメージング研究所のテキサスA＆M健康科学センター大学のためにスコットと白病院研究費補助金プログラムを認めます。私たちは、原稿編集のヘルプ氏グレンクライヤーを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Proox model 110Biospherixmodel 110
DMEM, no glucoseGibco, Life technologies11966-025
Rhodamine PhalloidinLife technologiesR415
ZO-1 Rabbit Polyclonal AntibodyLife technologies617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 よく無菌、ガラス スライド Thermo scientific177402
FITCタグ付き抗ウサギ二次抗体 サンタクルスsc-2090
DPBS 1XサーモサイエンティフィックSH 30028.03利用可能な他のPBSを使用することができます

参考文献

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