高解像度EEGレコーディングを使用して焦点てんかんの前臨床ラットモデルにおける脳ソースイメージング

サマリー

このビデオは、非侵襲的条件下での焦点性てんかんの特定の前臨床モデルを用いて、鎮静ラットに対する高解像度脳波の準備、記録、およびソース分析の手順を紹介しています。

要約

脳波図(EEG)は、焦点性てんかん患者の切除に最も適した脳領域を決定するために伝統的に使用されてきました。この方法論は、発作間欠性てんかん様放電 (IED) が出現する脳の同じ領域から発作が発生するという仮定に依存しています。前臨床モデルは、病巣性てんかんにおけるIEDの位置と実際の発作開始の根底にある領域との間の相関関係を見つけるのに非常に有用です。ラットは、てんかんの前臨床試験で一般的に使用されています¹。したがって、この特定の種には、限局性てんかんの多種多様なモデルが存在します。しかし、このような小動物でマルチチャンネル脳波を記録し、脳源イメージングを行うことは困難です。この問題を解決するために、ネズミ²から32チャンネルの脳波記録を取得する特許技術と、Wistarラットの脳解剖学的構造のMRI確率アトラスを組み合わせて、脳源イメージングを行います。このビデオでは、限局性皮質異形成のWistarラットからマルチチャンネル脳波を取得する手順を紹介し、MRIアトラスから体積導体モデルを定義する手順とIEDを一意に決定する手順について説明します。最後に、IEDの脳源画像を取得し、それらを発作発症時の異なる時間枠で得られた画像と比較することにより、方法論全体を検証します。

概要

脳波から観察される発作間欠性てんかん様放電(IED)が、限局性てんかん患者のてんかん発生の有用なマーカーを構成する^{ことが示されています3。}これらのIEDの発生源である脳内の領域は、刺激性ゾーンと呼ばれ、実際にはEEG記録4に基づいて局在化^{することができます。}これらの刺激性ゾーンと実際の発作開始領域との相関関係を見つけるには、前臨床モデルが不可欠です。しかし、人間の頭皮に比べて頭の表面積が小さいため、小動物の脳波を記録することは困難です。ラットの慢性的な記録のための侵襲的な方法を用いることができるが^{、5, 6}、麻酔を必要とせずに急性条件下でげっ歯類の従来の脳波記録を取得する技術は現時点では利用できない。

>jove_content<この問題を解決するために、私たちは特許取得済みのEEG^{mini-cap 2}を適用し、これによりげっ歯類からの32チャンネルのEEGデータを非侵襲的に記録することができます。この研究では、IED周波数を維持するための鎮痛薬の必要性についての証拠も提供します。したがって、脳波ミニキャップの固定はイソフルラン下で行ったが、脳波記録は鎮静剤(dexdomitor^)下でのみラットで得られた7。この研究で提案された方法は、焦点性てんかんの任意の前臨床ラットモデルで使用できます。この方法論の機能を説明するために、それを適用して、限局性皮質異形成症 (FCD) の刺激性ゾーンと発作発症ゾーンの相関関係を理解します。そのために、WistarラットのFCD⁸の「ダブルヒット」モデルを使用します。

脳源分析を行うためには、a)脳波生データからIEDを正確に抽出し、b)個々の動物の頭部の体積導体モデルを取得する必要があります。実用的な体積導体モデルを生成するために、強度/形状の平均画像を含み、31匹のWistarラット⁹のT2画像の非線形レジストレーションを介して得られたin vivoラットMRIアトラスを使用します。生成された体積導体の順方向モデルは、境界要素法(BEM)¹⁰によって計算されました。ヒトの場合と同様に、IED(鋭波とスパイク)の2つの典型的なパターンが検出され、インテリジェントな特徴抽出、特徴選択、および分類プロセス¹¹を通じて異なるクラスターにサブ分類された。これらのサブ分類された信号は、さまざまなタイプの刺激性ゾーンに関連する脳源の局在を推定するために使用されます。Brainstorm¹²と呼ばれる有名な公開ソフトウェアを使用したソース分析の手順を示します。各IEDサブタイプのEEG源の局在化と発作開始時間枠は、Brainstormで利用可能な標準化された低解像度脳電磁断層撮影法(sLORETA)¹³を使用して実行されました。

プロトコル

倫理文：全ての実験は、フロリダ国際大学（IACUC 13から004）で施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立されたポリシーに従って実施されています。

1.脳波レコーディング

1. EEGミニキャップの調製
   1. 脳波ミニキャップ0.2％塩化蒸留水で少なくとも12時間の電極チップを浸し。蒸留水に静かにEEGミニキャップをすすぎます。キャップと空気中の電極を乾燥させます。
   2. 2の体積比率で0.9％NaCl溶液と混合脳波電極ペースト：1.は、電極の内側と皮膚に電極ペーストを視覚化するのに役立ちますメチレンブルーの低下を、追加します。シリンジ内の混合ペーストしてください。シリンジ内に気泡がないことを確認してください。気泡を導入することなく、それらを充填、電極32のそれぞれにゲルを注入します。これは、下部ではなく上部から注入することをお勧めします。これは、より良いACCEを提供します各電極へのSSと波及ゲルの可能性を低減します。
   3. EEGおよび生理学的記録システムの電源を入れ、使用中のコンピュータに対応する記録ソフトウェアを開きます。
2. 動物の準備と麻酔
   注：慢性てんかんは、ウィスターラットにFCD ⁸のプロトコルを使用して作成されました。脳波記録は（ - 400グラム8週齢、300）は、成体ウィスターラットで行いました。
   1. 実験シートにラットの体重を記録します。鎮静剤の投与量（dexdomitor 0.25ミリグラム/キログラム）を計算するためにこの情報を使用してください。 5％イソフルランと酸素100％（14.7 psiで1 L /分）でラットに麻酔を誘導します。
   2. 後の2％にイソフルランを減少させ、脳波ミニキャップの全体の設定の間にそれを維持するため、ラットの頭をトリミング。ラットの反射が（つま先ピンチ）は存在しないか確認してください。耳のバーを使用して、外耳道を固定することで定位固定装置に加熱パッドの上にラットを置きます。麻酔ノーズコーンが安全であることを確認します。
   3. APそれぞれの目に潤滑油眼軟膏をプライ。
   4. カミソリを使用して、ラットの頭と耳に余分な毛を剃ります。シェービング中に出血を避けます。
      注：皮膚に残った毛は、EEG記録のノイズを生成します。血管を刺激し、皮膚を脱脂するために90％のイソプロピルアルコールでラットの皮膚をこします。
   5. 頭皮に生理食塩水の綿棒を置き、EEGミニキャップが配置される準備ができるまでは、良好な皮膚コンダクタンスを維持するためにそれを完全にカバーしています。
   6. 温度、呼吸、および3本のリード心電図プローブを接続します。温度を直腸プローブによって測定されることに注意してください。連続記録手順の間に、ラットの生理機能を監視します。毎分60回の呼吸、および心拍数は約350である - - 通常の温度は37℃であることを確認し、呼吸範囲は30で、毎分450拍。
3. 記録手順
   1. ラットの頭皮に生理食塩水の綿棒を取り出して、準備された脳波ミニCを配置その皮膚上にp。ゴムバンド付きミニキャップを修正しました。通常、目の前で、頭皮の前面に1ゴムバンドを配置し、耳と首の間、頭皮の奥に別のバンド。正常な呼吸を容易にするために、首の下にプラスチック製のプロテクターを使用してください。
   2. グランドおよび基準電極の両方に高いコンダクタンス電極ペーストの層を置きます。それぞれの耳の上に置きます。
      注：基準電極は、おそらく他の位置に配置することができます。
   3. アンプに脳波ミニキャップを接続し、電極インピーダンスのためのワークベンチのプレビューを確認します。全ての電極の性能を確認してください。 30kΩの - 高品質の記録のために、インピーダンス値が5の範囲であることを確認してください。ノイズの多い電極がある場合は、電極の上からより多くのゲルを注入優しく頭皮に向けて足場の内側にそれらを動かすか、いずれかの方法で頭皮との良好な接触を提供します。
   4. dexdomitorの管理（0.25ミリグラム/ kg）をintraperitoneally、すぐに0％にイソフルラン率を低下させます。呼吸速度は30内にない場合 - 分範囲あたり60呼吸、穏やかイソフルラン速度を増加させる開始。 1％のイソフルランの値を超えないようにしてください。イソフルランとdexdomitorの混合物は、危険な状態に動物を促す可能性があるため、慎重にこの手順を監視します。
      注：dexdomitorにはないのに対し、焦点てんかんの前臨床モデルでは、イソフルランは、IED事件に影響を与えます。イソフルラン下の被験者は、すなわち、比較的少ないのIEDは、他の条件^7,14に比べて検出することができ、より弱いてんかん性を有しています。 dexdomitor用量は、約2時間のために有効です。したがって、その効果のために時間を節約するために、調製物は、イソフルラン下で行いました。
   5. EEG記録を行っています。 EEGミニキャップが削除される前に記録した後、それらの内側にカラーペンを挿入することにより、皮膚の上にEEGミニキャップの3突き出円の位置をマークします。 MRI共同のための目印にしてください-registration。ランドマークでラットの頭部を撮影。バックケージの中にラットを置き、dexdomitorの影響から完全に回復するまで、それを監視します。
      注記：この実験では、赤色（緑色の反対色）が電極位置（緑）と区別するために使用しました。しかし、小出血斑が皮膚に認められた場合、他の色（紫/緑）を使用することをお勧めします。

図1.特定のラット上に配置された脳波ミニキャップの絵。

この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

2.脳ソースイメージング

1. IED分類
   注：IEDの検出と分類は、に基づいて、MATLABでの自己開発のコードを使用して実行されます以前の研究^15。このソフトウェアは、リクエストにより利用できるようになります。
   1. 視覚脳波トレーサーを検査することにより、ノイズの多いチャンネルを破棄します。テンプレートとの相関分析に基づいて周期的波形の減算のための自動的な方法を用いてEKGの成果物を削除します。
      注：通常、脳波を記録した実験者は、インピーダンス値に基づいて、観察された不良チャンネル情報について書かれた実験シートを共有します。 EKGアーチファクトを除去するためのソフトウェアが要求によっても利用できるようになります。
      
      図2のIEDの種類を示す脳波のトレースの例。赤いボックスはのIEDの1種類を示します。
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
      
   2. 150Hzのノッチ - 3のカットオフ周波数を有するバンドパスフィルタを適用しますライン周波数（一般的には60ヘルツと一部の国では50 Hz）でコンポーネントをオフラインを削除するには、フィルタ処理します。
   3. のIED（スパイク、鋭い波）の2種類を検出します。 70ミリ秒と70 - - それぞれ持続時間が200ミリ秒のスパイクとシャープな波は20の大電気的事象を構成しています。したがって、それぞれのバンドパスフィルタ（15のカットオフ周波数-スパイク50 Hzから5 -シャープ波15 Hz）を適用した後、のIEDは、振幅が^15をしきい値に基づいて検出されます。
      注：マルチユニット活動¹⁵の以前の研究で示唆されているようにしきい値を自動的に4σに設定されています。 {|フィルタリングされた信号| / 0.6745}ここで、σは、σ=中央値 、バンドパス·フィルタ処理された信号の推定標準偏差です。
   4. 異なるクラスタにスパイクと、鋭い波をサブ分類します。別のスパイクと、鋭い波の顕著な特徴は^{、15ウェーブレット}変換用いて抽出されます。これらは、サブ分類されるk平均を使用して複数のクラスターに、最適なクラスタ数kは、シルエットを使用して決定されます。
   5. 同じクラスタ内のサブ分類の信号を平均化します。各IEDサブタイプに対する平均EEG信号は、脳源解析のために使用されます。
2. 容積導体モデル
   注：以下のセクションでは、オープンソースソフトウェア、ブレーンストーミング^12は 、Wistarラット⁹用のMRIアトラスと一緒に使用されます。しかし、個々のラットのMRIはまた、可能な場合は容積導体モデルを生成するために使用することができます。 MRIアトラス^9がでダウンロードすることができhttp://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ 。このウェブサイトは、「ウィスターラットのMRIアトラス」セクションの下NIFTI形式としてアトラスを提供し、それは登録後アクセスすることができます。前処理のために必要なソフトウェアはまた、このウェブサイトで見つけることができます。
   1. ソフトウェア¹²への入力MRIと脳表面。
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   2. デフォルトの設定でヘッド面を生成します。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   3. リードフィールド計算¹²用のMRIに基づいて、頭皮と外側/内側の頭蓋骨の表面を生成します。
      注：頂点の解像度は、推定ソースの精度に影響を与えるが、頂点の数が多い高い計算の複雑性をもたらします。各層の頂点の推奨数は、公正、計算の複雑さと許容精度のための642です。頭蓋骨の厚さは、MRIで確認することができ、MRIアトラスの場合には約1mでありますM。ソフトウェア内の値の上に挿入した後、面と頂点が各面のために噛み合う対応する三角形が作成されます。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   4. 視覚化オプションを使用して、MRIに対する各面の向きと位置を確認してください。従って変更し、任意の面が¹²コ登録されていない場合。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   5. 1.3.5で取得されたラットの頭部画像を使用。 MRI 3ランドマーク（R1、R2、およびR3）の位置を同時登録します。 Gへの参照としてランドマークのグリッド点を使用して電極は、足場（ 図3B）に固定されているように、電極位置をenerate。
      
      図3（A）ラット先頭ピクチャ座標系と電極位置と、（b）EEGミニキャップ図を得るために用いられます。 （A）中の赤い点は、1.3.5で述べたランドマークを示しています。これは、（B）の赤番号に対応しています。また、（A）の緑色のマークは、32電極位置を示している、と彼らは（B）中の青の番号に対応しています。
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
      
   6. 3ランドマークに基づいて、N×3電極位置行列を生成します。ここで、Nは（N = 32）のチャネルの数であり、カラムは、対応するx、y及びz座標値を表します。
      注：EEGミニキャップが剛性の足場です。 3基準格子（R1、R2、及びR3）が得られるとしたがって、電極の位置が自動的に設定されています。ユーザは、ミニキャップが適切に頭皮上に投影されていることを途中でZ値を再定義する必要があります。 図3（b）青の数字で示されているようにN点のグリッドは、順番に番号が付けすることができます。 EEGミニキャップのための標準的な足場は、（ 材料の表 ）は、市販されています。同時登録のためのソフトウェアは、コミュニティに利用可能です。
   7. 入力生成されたチャンネルのファイル。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   8. 全ての電極の位置を表示して確認します。いずれかの見当違いの電極^12を変更します。電気のための最終的な座標系デポジションは、上記の表面のために使用される座標系と一致する必要があります。
      注： "。MRI登録 MRI /表面登録を確認し、「作成した表面は、視覚的に可視化オプションを使用してMRIで検査することができ、そして、選択された表面は、MRI上に黄色の線で表示されます。また、3のランドマークと32の電極の位置は、ツールボックスのオプションを選択することによって、MRIに表示させることができる「センサー MRIビューアを表示します。」の場所は、視覚的にラットの眼と耳の位置に基づいて分布を比較することによって検査することができます（ 図4）。
      
      図4.同時登録脳の表面に（A）のMRIアトラス（黄色の線）、（B）位置合わせ32の電極と3のランドマーク（赤い点）、および同時登録と（C）のMRIアトラスで作成されたボリュームの導体モデル参照レンス·グリッドR1。
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
3. 脳ソースイメージング
   1. リードフィールド行列^13を計算します。入力1のように、皮膚、頭蓋骨、および脳の比率を満たす導電率値：1/80：1.容積導体モデルと2.2で作成した電極位置に基づいて、リードフィールド行列を取得します。
      注：ツールボックス^{12は、BEM 10を}計算するために他のソフトウェアとのインターフェースを提供しています。したがって、唯一の導電率の値は、入力として必要とされます。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   2. 入力2.1.4に格納されている各IEDのサブタイプの平均EEG信号。
      「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg" />
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   3. 計算されたリードフィールド行列と入力EEG信号に基づいてsLORETA液^13を得ます。光源推定方法のオプションを選択することにより、逆溶液が^12を得ることができます。
      
      この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
   4. 推定ソースをプロットします。

結果

一度すべての手順が正常に完了し、推定ソースが前臨床モデルの脳表面に可視化することができる。 図5は、IED事件からスパイク（上）とシャープな波（下）のいずれかの特定のサブタイプから推定ソースを示します。また、 図6のディスプレイ発作確立中に、順次時間枠でどのようにソース配布の変更。これらの結果は、焦点てんかんのラットに高解像​​度の脳波を記録すると、記録された脳波を使用してソース·分析を行うことが提案された方法論の機能をサポートしています。

図5は、（A）時系列、（B）脳波トポグラフィ。スパイクで異なるクラスタ（上）とシャープな波（下）に関してのIEDの脳源の位置を推定し、（C）皮質電流サワーCES。評価は（A）における赤色の垂直線でマークされた特定の時間に実行されます。
この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

発作時の図6の推定脳源は。の時刻は赤の縦線としてマークされます。
この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

焦点てんかんの特定の前臨床モデルにおいて、非侵襲的にレコードマルチチャンネル脳波への新しい方法が記載されています。記録および分析手順について詳細は、具体的な実験ヒントを、提供されています。成功した結果を達成する考慮すべき重要な要素がありました。まず、EEG記録のために、高品質の信号を得ることが不可欠です。 EEGペーストの適正粘度は、ミニキャップの準備中に、各電極に印加されるべきであり、ラットの頭と耳の毛が完全に剃り中に除去されるべきです。インピーダンスチェックは、EEG記録の品質を確認するための最も重要なステップです。第二に、脳のソース画像のための、適切な容積導体モデルを生成することは重要です。各表面は同時登録する必要があります。また、生成された電極位置は、ラットの頭皮上の実際の電極位置からの最小距離誤差を持っている必要があります。

この原稿は、ソースを紹介していてもブレーンストーミング^12を用いた分析手順は、それらが他のオープンソフトウェア^16,17市販品^18,19を用いて行うことができます。また、sLORETA ¹³の他に、例えば、複数の双極子モデルとビームフォーマのような他の逆解は^4に適用すること^ができます。

このアプローチの1つの制限は、EEG記録を鎮静下で実施されるので、行動分析を行うことができないということです。しかし、ラット^5,6におけるEEG記録のための他の方法に比べて、このアプローチは、非侵襲的です。

我々の予備的な結果は、焦点てんかんラットに刺激性のゾーンを決定するために、ならびに発作開始の¹¹のための基礎となるメカニズムとの関係を評価するために、EEG記録からIEDマーカーの正確な分類のための重要性をサポートしています。さらに、そのような特定のIEDのためのEEG音源定位がRESPとの良好な一致を示したことが示されていますective BOLD活性化および非活性化領域^20。

我々の研究は、生物医学のエンジニアによって開発されたベッドベンチベッド戦略を評価するための前臨床モデルの使用を促進します。例えば、IED抽出が最近かなりの人間の労力を必要とする、手動で、病院で行われます。本研究で提案した方法論は、これを自動的に実行します。私たちは、FCDの患者に適用された場合、この方法を使用すると、同様の結果が得られると仮定しました。私たちは、人間のデータセット内の方法論のこのおよび他の態様の評価のためにIRBプロトコルを準備しています。

また、前臨床モデルの使用は、私たちはてんかん²¹に脳波音源定位の能力と限界を理解するのに役立ちます。てんかんを下っ端脳源の正確な推定は、治療戦略と手術計画のために重要です。また、ラットにおけるEEG記録のための標準的なプラットフォームを有するために有用であろう前臨床試験のいくつかの抗てんかん薬の有効性の評価。これは、てんかん脳波バイオマーカーの評価のための新たな扉を開きますてんかんラットを鎮静下で非侵襲的に記録された最初の研究です。しかし、この研究で提示全体の方法論は、他の実験条件と脳障害に拡張可能です。 EEGミニキャップはまた、他の齧歯類の種で使用することができます。

過去には、Wistarラットにおける前足刺激パラダイムはEEGミニキャップ²に記録されたデータの品質と再現性を評価するために使用されてきました。また、脳のソース再建のための検証を同時にウィスカ刺激パラダイム²²下のウィスターラットから層状ローカルフィールド電位を記録した高解像度の頭蓋骨のEEGから行われてきました。この方法は、このため、特定のラットのためのMRIアトラスの存在のウィスターラットのために開発されています列車。しかし、スプラーグドーリーラット^24、及びPaxinosとWatsonのラットは^25、マウス²³などのアトラスの、標準フォーマットを有する他のげっ歯類型に適用することができます。また、提案手法の基本的な手順は、EEGが重要モダリティである任意のげっ歯類前臨床モデルで使用することができます。しかし、この方法論の多くの側面は、EEGの前処理（IED検出および分類）に関する特に、特にてんかんのためのものです。また、研究者が異なる場合には、鎮静のために使用される適切な薬剤を認識する必要があります。私たちの研究ではイソフルランとdexdomitorの使用は慎重に原因のIEDの減少への影響と考えられてきました。 EEG記録に関しては、マウスの場合には、比較的小さい頭皮の表面積が大幅にチャンネルの数を減少させるであろう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
データ取り込み用コンピュータ	ヒューレット・パッカード	Z210 ワークステーション
Dexdomitor	オリオン・ファーマ	6295000	デクスメデトミジン塩酸塩
脳波解析ソフトウェア	The Mathworks Inc.	MATLAB R2011b
		Brainstorm	Sylvain et al. 2001
		OpenMEEG	Gramfort et al. 2010
EEG Data Streamer	Tucker-Davis Technologies	RS4 Data Streamer
EEG Electrode Paste	Biotach	YGB 103
EEG Preamplifier	BioSemi	Active Two
	Brain製品	BrainAmp
	Tucker-Davis Technologies	PZ3 低インピーダンスアンプ
脳波記録ソフトウェア	BioSemi	ActiView
脳波記録ソフトウェア	Tucker-Davis Technologies	OpenEx - OpenDeveloper
EEG SCSI コネクタ	BioSemi	Active Two SCSI コネクタ
	脳製品	D-sub コネクタ
EEG プロセッサ	Tucker-Davis Technologies	RZ2 BioAmp プロセッサ
	Tucker-Davis Technologies	Zif-Clif Digital Headstage
高解像度 EEG ミニキャップ	Cortech Solutions	DA-AR-ELRCS32	米国特許出願番号 13/641,834
イソフルラン、USP	VedcoPiramal Healthcare	NDC 66794-013-25
イソプロピルアルコール	アクア溶液	3112213	90% v/v 溶液
潤滑剤 眼科軟膏	ラグビー	NDC 0536-6550-91	滅菌
NaCl	アボット	2B8203	Vaterinary 0.9% クロライドナトリウム注射 USP
生理学記録ソフトウェア	ADInstruments	LabChart 7.0
生理学記録システム	ADInstruments	PowerLab 8/35
シリンジ	モノジェクト	200555	12cc