プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。
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サマリー
要約
血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。
概要
赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果1の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子2の架橋及び力attracへ浸透勾配3に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。
典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒-1までの範囲の非常に低いせん断速度4で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。
凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要で....
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プロトコル
血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。
1.マイクロチャネルの作製
マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法18に基づいて製造されています。
- コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設定を印刷します。これらは、製造工程中に光路を決定するので、これらのマスクは重要です。この場合には、マイクロチャネルの寸法は、厚さ120ミクロン、深さ60ミクロン、長さ7ミリメートルです。
- クリーンルームでは、スピンコートは、エポキシ系負所望のマイクロチャネルの深さ（60μm）を得るために30秒間2000rpmでシリコンウェハ上にフォトレジスト。
- 70秒間ウェハ650ミリジュール/ cm 2でUVランプの下でフォトマスクを公開します。唯一の透明な領域を露出させることを確認しUV光へのフォトマスク。透明領域の曝露は、フォトレジストの硬化をもたらす鎖の重合を可能にします。 - フォトレジストの過剰を削除する開発者に、シリコン片を浸し。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）の溶液を作成するために1：金型が製造されると、10の比率で、シリコン系エラストマーと硬化剤を混合します。脱気真空チャンバ内に....
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結果
ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与える。 図5のカメラのフレームレート必要との定性的な概念の定性的な尺度を提供し、3連続したフレームのために、4つのヒトRBC凝集体の変位を、次の各フレーム内の分布を集計します。媒体集合体をそれぞれ緑と赤で表示され、大きな凝集体（より大きい30が赤血球を推定）（9から30までの範囲が赤血球を推定）しながら、 図5では、（8以下推定赤血球との）小さな凝集体は、青色で示されています。
チャネルで異なるRBC懸濁物の速度プロファイルは、赤、青、緑の曲線は、5％、10％、15％.......
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ディスカッション
本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル19準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。
成功したテストのためのもう一つの重要な要因は、良好な画質です。この方法は、画像処理に基づいているので実際には、画像の背景（チャネル内の流体）と、検出される粒子間のコントラストを有することが非常に重要です。 図2及び図3に示すようにここで、粒子は、凝集体の検出に役立つ背景よりも暗いように見えます。画像処理技術のために考慮すべき最も重要なパラメータは、tとhreshold値。したがって、コントラストに基づいて、それは、図5に示すように、すべての凝集体が、考慮される最適な閾値を選択することが重要である得られた。この研究のために使用される本画像分割は、広く.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会によってサポートされていました。微細加工は、マギル大学のマギルナノツールのMicroFab施設、カールトン大学の電子部門の支援を受けて実施しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| SU8-50 エポキシ系ネガ型フォトレジスト | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50開発元 | MicroChem Corp. | ||
| ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)シルガード-184 | ウコーニング | 3097358-1004PE-50 | |
| シリーズプラズマシステム | 血漿エッチング | PE-50 シリーズ | |
| K2-EDTA (エチレンジアミン四酢酸) | FisherSci | B367861 | |
| 遠心分離機、 Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| ポシュペート緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| トレーサー蛍光粒子溶液 (15 ml) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| ガラスシリンジ (50 & micro;l) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | 毎秒18フレームを記録できるカメラが使用できます。 |
| ダブルパルスカメラ | LaVision | イメージャー、インテンス | |
| マイクロスコープ、MITAS | 、LaVision | MITAS | |
| 、Nd:YAGレーザー | 、New Wave Research、 | Solo-II | |
| シリンジポンプ(Nexus3000およびPicoPlus)、 | Chemyx Inc.およびHarvard Apparatus | Nexus3000およびPicoPlus | |
| DaVisソフトウェア | 、LaVision | Davis |
参考文献
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.
An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.
