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方法論記事

の酸化ストレス抵抗を測定

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DOI:

10.3791/52746

⸱

2015年5月9日

 , 
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

この記事について

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サマリー

C. elegansは、酸化ストレス耐性に関与するシグナル伝達経路を研究するための魅力的なモデル生物です。ここでは、96ウェルプレートにいくつかの酸化剤を使用して、C.エレガンス動物の液相の酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します。

要約

活性酸素種の産生と解​​毒の間の不均衡の結果である酸化ストレスは、心血管および神経変性疾患、糖尿病、老化、および癌を含む慢性ヒトの疾患、の主要な原因です。したがって、細胞系においても全生物を使用していないだけで酸化ストレスを研究することが重要である。C.エレガンスは、高度に進化的に保存されている酸化ストレスシグナル伝達経路の遺伝学を研究するための魅力的なモデル生物です。

ここでは、Cの酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します液体中のエレガンス 。簡単に言えば、そのようなパラコート（PQ）およびH 2 O 2などのROS誘導試薬はM9緩衝液に溶解され、溶液は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに等分されます。シンクロナイズドL4 /若年成人C.エレガンス動物をウェルに転送される（5~8匹/ウェル）、生存率が測定されますほとんどのワームは死んでいるまで、毎時間。プレート内のストレッサーの低濃度を使用して、酸化ストレス耐性アッセイを行う場合には、高齢化は、データの誤った解釈につながる可能性が酸化ストレス、時に動物の行動に影響を与える可能性があります。しかしながら、本明細書に記載のアッセイで、この問題は、L4 /若い成体動物を使用しているので、発生しにくいです。また、このプロトコルは、安価であり、その結果、遺伝的スクリーニングのための魅力的なこの技術をレンダリング一日で得られます。全体的に、これは、酸化ストレスに関連するヒト疾患のより良好な特徴付けに変換することができ、酸化ストレスシグナル伝達経路を理解するのに役立ちます。

概要

真核生物では、ミトコンドリアの電子伝達系で起こる酸化的リン酸化は、ATPの形でエネルギー生産の主な要因です。活性酸素種（ROS）は、このプロセスの自然な副産物です。シグナル伝達分子としての重要な役割にもかかわらず、過剰なROSは、DNA損傷、タンパク質のカルボニル化、および脂質酸化につながることができます。 ROS産生と解毒の間の不均衡は、エネルギーの枯渇につながる酸化ストレス、細胞の損傷を引き起こし、細胞死1,2をトリガします。酸化ストレスは老化および癌、糖尿病、心血管および神経変性疾患3-9を含む多くの生命を脅かす疾患の発展に貢献しています。

細胞は適切なROSレベルを維持し、酸化的損傷1,2に対してその成分を保護するために酵素的および非酵素的防御戦略を進化させてきました。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の酵素はconveに第一幕RTスーパーオキシド後カタラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素によって水に変換されるH 2 O 2へ。非酵素的な防衛戦略は、主に必須の細胞成分を保護する細胞高分子と比較して、ROSと速く反応する分子を含みます。 ROS解毒酵素の保護の役割にもかかわらず、いくつかのROS分子は、抗酸化防御機構を脱出し、酸化的損傷につながります。検出、修復、および損傷した細胞成分の分解は、酸化ストレス1,2間に本質的な防御戦略です。

ストレス耐性、特に酸化ストレスに関与するシグナル伝達経路は、進化的に高度10,11に保存されています。生物の条件が部分的にしか再現されている細胞培養実験とは異なり、モデル生物における酸化ストレスの研究12,13は、大きな意義を持っている。C.エレガンスは、CUL、容易かつ安価にすることができます自由生活線虫であります寒天培地上の細菌叢上tured。それは、（長さ約1mm）小型で、通常の遺伝子操作を容易に自己受精ふたなり、として成長します。それは大規模な遺伝子スクリーニング14を実行するための強力なツール作り、世代あたり約300の子孫を生成する、迅速なライフサイクルと高い生殖能力を有しています。 C.エレガンスゲノムが完全に配列決定され、遺伝子の40〜50％は、ヒトの疾患関連遺伝子15〜18の相同体であると予測されます。 RNAiを用いて、目的の遺伝子のノックダウンは、迅速かつCで簡単です。 エレガンス。遺伝子のダウンレギュレーションはE.動物に供給することによって達成することができます関心19のmRNAを標的とする二本鎖RNAを発現するプラスミドを保有する大腸菌細菌。そのため、大規模なRNAiスクリーニングを使用して、遺伝子機能の決意は、癌20,21を含むヒトの疾患を理解する上で大きな影響を与えています。

Oの研究Cでxidativeストレス耐性エレガンスは、酸化ストレスに対する抵抗13,22の保存されたメカニズムの同定につながりました。同定されたいくつかの経路は、低酸素、熱、および浸透圧ストレスなど、他のストレスに長寿と抵抗を調節する一般的な経路です。これらの経路は、インスリンシグナル伝達、TORシグナリング、およびオートファジーを含みます。その他の主な経路は、そのような、または損傷修復におけるこのような熱ショックタンパク質とシャペロン11,13,22としてスーパーオキシドジスムターゼ酵素とカタラーゼ酵素としてROSの解毒を伴います。

このプロトコルは、Cの酸化ストレスに対する抵抗性を決定する方法について説明します液体中のエレガンス 。我々は以前Cでflcn-1（ok975）の喪失時の酸化ストレスに対する抵抗性の増加を示しているので、私たちはプロトコルを示すためにflcn-1（ok975）と野生型動物を使用しましたエレガンス 23。また、この増加した抵抗性が依存することを示していますAMPKとオートファジーは、細胞生体エネルギーを改善し、ストレス耐性23を促進するシグナル伝達軸上。 PQは、反応性酸素種24を生成するために電子伝達系を妨害する酸化的ストレッサーです。同じアッセイを適合させることができ、他のROS源またはROSの生成化合物は、H 2 O 2およびロテノンとして使用することができます。同様のアッセイは、PQの低濃度は25,26を使用しているプレート上で開発されています。このアッセイの利点は、非常に高速であり、結果は、一日で得られることがあります。さらに、96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性アッセイを行うために使用される液体の総体積はPQ含有プレートを調製するために使用される量に比べて低いです。したがって、使用PQの量は、液体アッセイであり、安価なアッセイをレンダリングし、有害廃棄物の生産を制限する、低いです。しかし、プレートアッセイと比較して、このアッセイの制限はラを含みます液体アッセイにおける食品のCKと空気と比較して、液体中の酸​​素濃度が低いです。これらは、いくつかのケースでは、結果に影響を与える可能性がある重要な要因です。したがって、このアッセイで得られた結果を支持することが推奨される酸化ストレス耐性の他の方法を使用して再現性を確認しました。

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プロトコル

試薬の調製

  1. C.のためのメディアの準備エレガンスの成長（ここでは、野生型動物とflcn-1（ok975）変異動物）。
    1. トリスHCl、トリス塩基、Bactopetoneの31グラム、塩化ナトリウムを20gとコレステロールの0.08グラムの2.4グラムの5.5グラムを含有する修飾Youngren唯一バクトペプトン（MYOB）ドライミックスを準備します。振とうしながらよく混ぜます。
      注：この混合物は、MYOB培地10 Lを調製するのに十分です。
      注：通常の増殖培地（NGM）プレートはMYOB板27の代わりに使用することができます。しかし、同じタイプのプレートは、系統間の独立した反復間有効な比較のために使用されるべきです。このプロトコルでは、我々は唯一のMYOBのプレートを使用していました。
    2. MYOB乾燥混合物の6グラム、寒天の17グラムを追加することで、MYOB媒体の1 Lを調製し、122℃で45分間、H 2 O、オートクレーブで1 Lに構成しています。プレートを注ぎ、室温で2日間乾燥させてください。
    3. 無菌技術を用いて、cultu 100mlの接種E.とLBブロス培地の再大腸菌 OP50細菌と37℃でO / Nを成長させます。
    4. E.と種子MYOBプレート大腸菌 OP50細菌。それは48時間室温で成長できるようにします。
  2. RNAiを用いて遺伝子のダウンレギュレーションのための準備
    1. MYOBのRNAi送りプレートを準備します。ステップ1.1.1と1.1.2のように進みます。オートクレーブ処理後、培地を約55℃まで冷却し、1ミリリットルM 1のイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および1ミリリットルの100mMアンピシリンを追加することができます。
    2. ストリークE.大腸菌 HT115制御EVまたはプレート寒天アンピシリン上flcn-1特異的RNAi（50μg/ mlの）/テトラサイクリン（15μgの/ ml）のいずれかを発現するプラスミドで形質転換された細菌。 37℃で培養O / Nを成長させます。
    3. コロニーを選択し、Eを接種制御EVまたはflcn-1特異的RNAiのいずれかを発現し、37＆＃でLB /アンピシリン（50μg/ ml）中、O / Nでの培養を成長させるプラスミドで形質転換した大腸菌 HT115細菌176; C。
    4. E.によるシード·プレート大腸菌 HT115 EV細菌やHT115 flcn-1のRNAi細菌。
      注：使用前にRTでプレートを48時間にしてください。給電によるのRNAiノックダウンが有効になっている場合は、DS-RNA 28の送達の他の方法を使用します。
  3. パラコート（PQ）を使用して酸化ストレスを誘導します。
    1. 7 H 2 O·KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4、5gのNaClをし、MgSO 4 0.25gの6gの3gを混合することによってM9バッファーを調製します蒸留水で1リットルに起動します。 RTで122℃、店舗ボトルで45分間オートクレーブソリューション。
    2. アッセイの日に、M9 / PQを含む溶液を準備します。このプロトコルは、100 mMのPQを使用します（M9バッファーの4ミリリットルに溶解PQの0.1028グラムを、ウェル当たりM9 / PQの40μlの全96ウェルプレートを埋めます）。
      注意：PQが危険と毒性の高い化合物です。適切なガイドラインに従って処理します。
      注：最初に新しいのを実行しています電車や新たな条件、それは7-10時間以内に動物を殺すために使用するのに最適な濃度を決定するためにPQの濃度を増加さに生存をアッセイすることをお勧めします。

年齢同期L4人口の調製

  1. E.を接種した新鮮なMYOBプレートに20妊娠大人の雌雄同体を転送大腸菌 OP50細菌。アッセイの間に必要な虫の数に基づいて、いくつかのプレートを準備します。
  2. 彼らは6時間産卵することを可能にした後、白金線虫を用いて、母親を削除選びます。産卵数を評価するために顕微鏡下でプレートを確認してください。
  3. 卵が孵化し、48時間、20℃で成長させます。この時点で、動物が後期L4 /若年成人の段階にあります。同じステージの動物を選択し、PQ液含有ウェルに移します。
    注：48時間のインキュベーションが唯一の野生型動物と同様に成長する突然変異体に適用されるので、それが発達監視することが重要ですそれはそうでなければ、他のタイムラインを使用する必要があり、野生型の現像速度に準拠を保証するために、新たにテストされた変異体の割合。
  4. あるいは、同期技術​​を使用しています。次亜塩素酸溶液を用いて、L1幼虫ワームの同期人口を（;光から分離するためにアルミホイルで瓶を包む水25ml、5.25％の次亜塩素酸ナトリウムの125ミリリットル、4 M NaOHを50ミリリットル）を生成します。強烈な漂白がアッセイ中に動物の行動に影響を与える可能性があるので、このアッセイのために、それは、推奨されません。
    注意：ガイドラインに従って次亜塩素酸溶液を処理します。
    注：ダウン、目的の遺伝子を調節する特異的RNAi細菌を播種したRNAiプレートに母親の転送を除いて、セクション2で説明したように雌雄同体を同期させるためにRNAiを使用する場合。 RNAiのでノックダウンが弱い場合には、複数の世代のための給紙を推奨します。

3.酸化ストレス抵抗性アッセイを<実行/ P>

  1. 96ウェルプレートの各ウェルに100 mMのPQ溶液をピペット40μL（新しく調製）。すべての条件（処理、突然変異体など ）を複製するように、少なくとも12のウェルを使用してください。白金線虫ピックを使用して、十分に開始時刻と終了時刻を示すあらゆるに5-8 L4幼虫動物を転送します。
  2. 別の条件を開始すると、開始時刻と終了時刻を確認します。ワームを転送し、開始時刻から時間後に死亡した動物の得点間のインキュベーション時間で2​​0℃でプレートを置きます。
  3. 解剖顕微鏡を使用して、生存時間ごとにカウント。ゆっくりカウントを開始する前に、プレートを振ります。死んだ動物として、あっても高強度の光をスポットした後、移動しないワームを示しています。また、生きている動物の数を示しています。
    注：高倍率でワーム形状、尾と頭の動きを見ると、生きているから死んだ虫を決定するのに役立ちます。
  4. ほとんどのワームは死んでいるまで、この手順を時間ごとに繰り返します。
4。毎回ポイントでの生存割合の決意

  1. すべてのウェルに移した動物の数を追加することによって、条件あたりの動物の数を計算します。破損または転送時に殺される動物を無視します。
  2. すべての時点について、条件ごとに死んだ動物の合計数（12ウェル中の死んだ動物の合計）を計算します。すべての時点について、死亡率（死亡した動物の数の動物の総数で割り、100を掛けた）及び生存率（100パーセントマイナス死）を計算します。
  3. このアッセイを、少なくとも3つの独立した回を繰り返します。

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結果

比較すると、野生型C.エレガンスはflcn-1（ok975）変異動物を

ここでは、野生型Cの抵抗を決定するために、100 mMのPQを使用しました酸化ストレス、熱、および無酸素23に抵抗することが示されているflcn-1（ok975）動物と比較してエレガンス 。処理の4時間後、野生型の48.3パーセントはflcn-1で77.8パーセント生存率（ok975）動物と比較して生存しました。予想されるように、flcn-1（ok975）変異動物は、野生型（ 図2および表1）と比較して、100mMのPQに対してより耐性でした。

制御EVまたはflcn-1のRNAi細菌を与えた野生型動物を比較します

RNAiを用いflcn-1のダウンレギュ...

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ディスカッション

C.エレガンスは、それが容易に培養することができるので、 生体内での遺伝的に酸化ストレス耐性を研究するための魅力的なモデル生物であり、急速に遺伝的に同一の子孫の多くをもたらします。酸化ストレス抵抗性を測定するための複数の方法は、以前に記載されており、それらは、PQ、ロテノン、H 2 O 2、及びジュグロン25,26,29-32などの種々のROS光源と培養プレートの補充に基づいています。ここでは、100 mMのPQを用いて96ウェルプレート中の液体中の酸​​化ストレス耐性を測定するプロトコルを説明します。同様のアッセイは、グリアら 33によって行われました。このアッセイは、他のROS源を用いて、液体中の酸​​化ストレスを研究するために適合させることができます。例えば、我々としても23数個のH 2 O 2濃度にflcn-1が増加する抵抗の損失を示しました。

この...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

我々は、Cの線虫遺伝学センターを認めますエレガンス株 。資金援助は、テリー·フォックス·研究所から提供されました。また、RolandeとマルセルGosselin大学院学生の身分とマギル統合がん研究研修プログラムのがん研究FRN53888でCIHR / FRSQ訓練助成金からEPに付与されたサポートを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天細菌学グレードマルチセル800-010-LG
細菌学ペプトンオキソイドLP0037
塩化ナトリウム バイオテクノロジーグレードバイオショップ7647-14-5
コレステロールシグマC8503-25G
ウルトラピュアトリス 塩酸塩Invitrogen15506-017
トリスアミノメタンバイオベーシックカナダ株式会社77-86-1
IPTGサンタクルーズバイオテクノロジーsc-202185A
アンピシリンバイオショップ69-52-3
酵母エキスバイオベーシック株式会社8013-01-2
メチル ビオロゲン二塩化物水和物Aldrich 化学856177-1G
ペトリ皿 60 x15 mmフィッシャーFB0875713A
ピペット 10 mlフィッシャー1367520
リン酸カリウム monobasicG-BiosciencesRC-084
硫酸マグネシウム七水和物シグマM-5921
リン酸ナトリウム二塩基性Bioshop7558-79-4
ディスカバリーv8ステレオツァイス顕微鏡
96ウェルクリアマイクロタイタープレート
flcn-1RNAiソースアーリンガーライブラリ

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:

Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).

to:

Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

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