馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

サマリー

このプロトコルは、ガンマシンチグラフィーを使用して細胞の生存と組織分布を決定するために、馬の間葉系幹細胞の放射性標識と馬の腱損傷への移植を説明しています。

要約

馬での腱や靭帯損傷の治療のための骨髄間葉系幹細胞（BMMSC）の適用における最近の進歩は、実験的および臨床研究の両方でアウトカム指標が改善することをお勧めします。 BMMSCが大量に腱損傷に移植されていますが（通常は10から20000000細胞）、比較的少数が生き残る（<10％）、これらは、移植後までの5ヶ月間持続することができますが。これはBMMSCは、他の組織に移植されており、それは多くの人が最初の注入プロセスを生き残るためには、細胞が他の臓器にクリアされているかどうかをどのように、この損失が発生したときに理解することが重要である他の種における共通の観察であるように思われます。細胞の運命を追跡する前に細胞数のセルの位置と定量化のin vivoイメージングで非侵襲的に移植可能BMMSCを放射標識することによって達成することができます。

このプロトコルは、電池が記載さlabeli馬で負傷した屈筋腱にテクネチウム-99m（Tc-99m）、および移植後のこれらの細胞の追跡を使用していますngの手順。 Tc-99メートルは、ガンマ線を放射し、親油性化合物のhexamethylpropyleneamineオキシム（HMPAO）の存在下で細胞によって内在化することができ短命（6.01時間の_T 1/2）同位体です。これらの特性は、多くの異なる疾患の診断のための核医学診療所での使用に最適です。標識された細胞の運命は、肺、甲状腺および他の器官への細胞の病巣と流通に保持された細胞の数の両方を定量化するためにガンマシンチグラフィーによって（36時間まで）短期的に続くことができます。この技術は、血液白血球の標識から適合され、他の臓器に移植BMMSC画像に利用することができます。

概要

病的または損傷組織の修復のための再生戦略は、組織のさまざまな由来の多能性幹細胞に基づいており、患部に注入されます。馬での腱や靭帯損傷の治療のための自家BMMSCの応用における最近の進歩は、両方の実験^1-5で改善されたアウトカム指標および臨床研究^{6を示しています} 。馬は、幹細胞に関連する治療の有効性を評価するための特に魅力的なモデルである、それは年齢に苦しんでいると遠位前肢の腱に関連した傷害を無理ので、それはアスレチック動物であり、それは大規模な、容易に骨髄の回復であり、正確な注入。腱損傷は、線維症に自然に治癒するが、癒さ腱⁷機能的に劣っていると再傷害⁸のリスクが高いです。それは弾性エネルギーとして機能するように進化してきたように浅指屈筋腱（SDFT）が最も一般的に影響を受けています店舗や経験の高負荷は、エネルギー効率、高速移動を達成するために強調しています。損傷後の機能を回復することは、非常に重要です。これらの損傷は、同様の機能^9を行い 、ヒトにおけるアキレス腱に影響を与えるものと同様です。したがって、細胞ベースの再生戦略が成果を改善するために、再損傷を低減するために魅力的な機会を提供し、治療や、怪我のために良い修復を達成するためには良い治療法の選択肢はありません。

ほとんどの研究では5から20000000自家BMMSCは通常、したがって、細胞のための容器として機能する腱体のコア内に発生した病変に直接注入されています。一度注入された細胞の運命は、細胞を追跡するための、明確で異なる細胞標識法は、最近記載されているではありません。蛍光タグで標識された細胞は、比較的少数^{（<10％）10,11}の中で生き残ることが示されました。蛍光ラベルが必要組織抽出と時間がかかり、容易に大規模な動物モデルまたは臨床例では、時間的分析を容易にしない組織学的分析のために切片。より最近の研究では、細胞を標識し、ガンマシンチグラフィー¹によって彼らの運命を追跡するために放射性同位体^{99m Tcで}を使用しています。この方法は^、12動脈内または静脈内注射^1,12経由頚静脈¹または地域の灌流を介した静脈内、迅速な比較は病巣内などの細胞送達の異なる経路間で行うことを可能にします。細胞の持続性及び分布は、その後、種々の器官のガンマシンチグラフィーにより画像化することができます。これは、病巣内に注射された細胞のわずか24％が24時間で¹病変に残り、これは他の研究実験を使用して作成された病変と同一の放射性標識^{5を使用して}サポートされていることを実証しました。さらに、細胞はdelivere腱病変に家に限られた能力を示し、局所灌流によってDまたは静脈内投与が、後者の経路⁴によって肺に分散されます。

鉄ナノ粒子で標識されたBMMSCは前肢の腱^13内に移植された細胞を追跡するための別の方法です。鉄ナノ粒子標識された細胞は、MRIによるインビボでの細胞の追跡を可能にするが、大型動物の経時研究は麻酔がMRIスキャンを実行するためのそれぞれの時点で投与することができる回数によって制限されます。また、鉄ナノ粒子は、腱の体内への標識細胞の移行に関する情報を制限し、MRI上の低強度です。使用できる他の放射性同位体は、インジウム-111を含むが、これはのTc-99メートル（2.8日対6.0時間）以上のガンマ線放射エネルギーよりも長い半減期の不利益を被ります。加えて、細胞生存率は、インジウム-111 ¹⁴で標識されたときに減少することが報告されています。 TC-99メートルは、一方で、日常的にウマおよびヒトの両方の核に使用され薬は、末梢血単核細胞を標識し、シンチグラフィーにより生体内でそれらの分布に従うこと。これは、比較的容易に細胞へのTC-99メートル-HMPAOとして、テクネチウムを結合するためのリンカー分子としてHMPAOを用いて細胞に取り込ませることができます。 Tc-99メートル-HMPAOはBMMSCが良いの生存率を示し、 試験管 ⁴ で増殖することができるラベルされました。このプロトコルは、前肢SDFTで天然に存在する病巣に移植ラベリングおよびウマ自家BMMSCの追跡を詳細に説明します。

これは、プロトコルが唯一の研究ツールとして使用することを意図していることに注意することが重要です。細胞表現型の放射性標識の効果が十分に解明されていないような臨床治療法としてのその使用は推奨されません。

プロトコル

本明細書中に記載の例は、馬に使用される手順があり承認されたプロトコルに基づいていますコレヒオ・デ・Veterinariosデマラガ、スペイン、ロイヤル獣医大学、ノースMymms、英国の動物倫理福祉委員会によって付与された倫理的な許可に従って行いました移植後鎮静、骨髄吸引、内腱注射、局所灌流、静脈内注射、術後の治療や痛みの管理と監視が含ま幹細胞ベースの治療を受けた馬にクリニックで使用。

1.キー配列は事前に作られて

1. 制度的倫理と動物福祉の承認を求めると作業を開始する前に、現地の法的要件に準拠しています。
2. 人員の保護の適切なレベルと環境とcontamの処分など、地元との法的規制によって指示されるように電離放射線で動作するように制度の承認を求めますinated無駄。
3. 以下の選択基準を使用してください：前肢と腱と欠陥内の欠陥が生じる病変の浅指屈筋腱デジタルへの非外傷性無理損傷（腱障害またはdesmopathy）を備えた本馬がそのまま腱および/またはparatenonに囲まれて。
   注意：このようなけがや細胞移植のための馬の臨床的製造のための検査・診断は他^6,15詳述されています。
   注意：馬の骨髄由来BMMSCの文化の中での単離および拡大は以前^6,16詳述されています。馬にSDFTの怪我のためにBMMSCを注入するための現在のプロトコルは、自己骨髄上清^（BMS）16 mlの⁴当たり10万個の細胞を使用しています。
4. 高継代数Cに関連する潜在的な細胞表現型または遺伝的変化を避けるために、in vivoでの移植のためにこれ以上の4以上の通路を受けた細胞を使用してくださいells。
5. 細胞移植が行われる獣医クリニックに- （8 ^{O Cを} 4でチルボックスに24時間以内）BMSのセルの必要な数を提供します。
   注意：骨髄上清中の間葉系幹細胞の臨床使用はReCellerate社（米国）が所有する特許を取得した手続きであり、その使用は、許可が必要な場合があります。
   注：のTc-99メートルは、比較的半減期の短いガンマ線放射体（140 keVの）である（6.0058時間、したがってそれのほぼ94％が24時間で⁹⁹ Tcのの安定した形に減衰します）。ガンマ線エネルギーは、馬や動物の取扱人員の両方に非常に限られた放射線の露光時間でガンマカメラ（シンチグラフィー）および短い半減期の結果による検出に適しています。このプロトコルは[HMPAO（過テクネチウム酸ナトリウムなど）のTc-99メートルで標識された]のTc-99メートル-HMPAOを用いて細胞の現場ラベルについて説明します。
6. それは、細胞のウィットを標識するために提供され、使用されるように、供給者から新鮮なのTc-99メートルの注文Tc-99メートルジェネレータから溶出の2時間をホアヒン。 Tc-99メートルは、1ミリリットル溶液（供給者の標準緩衝液）で1 GBQとして提供されていることを確認してください。
7. RTですべてのバッファを使用してください。標識操作を実行し、アルコールで洗浄、すべての機器との同位体封じ込め室で細胞およびイメージング（ガンマシンチグラフィー）の注入は、従来の研究の開始に拭きます。

前肢腱の馬と超音波検査の作製

1. 時点で、最初の（骨髄を吸引する）負傷のため入院とで録音超音波スキャンは、放射性標識された細胞が注入されます。
2. 馬が失速に均等に体重を保有するとし、（むしろ全身麻酔より）鎮静を立ち下超音波検査と細胞移植を行います。 0.01〜0.02ミリグラム/ kg静脈でデトミジンHClおよび酒石酸ブトルファノールの混合物、それぞれを使用して鎮静を管理します。
   注：回復は迅速であり、手術後の治療はありませんが必要です特別な考慮事項。
3. 神経周囲麻酔が患肢に（ステップ2.6）に適用された後、治療中の馬の動きを減らすために鎮静下駅で馬を保ちます。視覚的に低下し、ヘッド位置と馬の態度からと馬が細胞注入及びシンチグラフィー画像の取得時のガンマカメラの動きの間に快適であると判断鎮静の適切なレベルを確認してください。
   注：鎮静点滅下影響を受け、馬目の水和を維持することができるされていないので（乾燥を防ぐために）目に獣医軟膏を適用する必要はありません。細胞の移植後の監視は、非侵襲的（超音波及びガンマシンチグラフィー）です。
4. （馬の毛をバリカンで）腱を覆う髪が、最終的にアルコールクロルヘキシジン手術用スクラブの組み合わせを使用して、クリップされた領域をきれいにし、密接にクリップ。
5. 領域に音響結合ゲルを適用し、シリアルの入射横と縦の画像を得るために線形変換器（12 MHzまたは類似の）で、7 ¹⁷ -完全な掌中手骨部位のスキャン、順次ラベルのレベル1を記録するために系統的にスキャンします。断面積と最大の損傷ゾーン^4は、画像解析ソフトウェアを用いて得られるように、デジタル画像を保存します。
6. 腱や浅指屈筋腱を覆う皮膚の完全な脱感作を確実にするために、局所麻酔薬の無菌注射用手首のすぐ遠位手掌神経を覆う面積を準備します。 mepivicaine皮下および屈筋腱や四肢の両側に手根のすぐ遠位提靱帯の間（そのサブ筋膜の場所に）掌神経に隣接する両方の2ミリリットルを注入。
7. 予備スキャンはクロルヘキシジン外科手術のエリアをスクラブすることにより、移植部位の準備が行われた後は浸したガーゼで少なくとも5分間、最終的にはアルコールのためcrubソリューション。無菌の方法で後続のすべての手順を実行します。

馬間葉系幹細胞の3のTc-99メートル標識

注意：これは腱に標識された細胞の細胞標識と注入の間の同位体の減衰を最小限に抑えることができますように細胞標識のステップは前肢の超音波検査中に実行することができます。

1. それは同位体の取り込みを妨害するように、細胞からBMSを削除します。これを行うには、冷却ボックスからBMMSCのバイアル（BMSの1ミリリットル中に10万個の細胞）を取得し、室温で5分間、350×gでマイクロ遠心で細胞をペレット化。慎重に細胞の再懸濁を支援するために、チューブに小滴（≤0.1ml）を残して、（2 mlシリンジに取り付けられている）18Gまたは19G針を用いて上清を除去します。滅菌マイクロチューブに上清（BMS）を保存し、後で再利用するために氷の上に保管してください。
2. FLによって上清の残留液滴で細胞を再懸濁（むしろ渦より）指で軽くチューブをIckingの、室温でラックにチューブを残します。細胞が完全に再懸濁され、目に見える細胞塊がないことを確認します。
3. 次のようにのTc-99メートルを準備します。 1ミリリットルの注射器と針を使用してHMPAOのバイアルに転送テクネチウム過テクネチウムの1ミリリットルを。穏やかに、しかし完全に混合し、鉛シールドの背後に5分間おきます。注：細胞がステップ2.1で回転している間は、この手順を行うことができます。
4. 細胞に1mlシリンジと針を使用したTc-99メートル-HMPAO混合物のすべてを加え、穏やかに混合。鉛シールドの後ろにRTで30分間インキュベートします。
5. 次のステップは、（手袋をはめた）親指とその後に他の機器の同位体の汚染を最小限にするためにマイクロチューブの蓋を開くために鉗子（または組織紙）を使用しています。洗浄バッファーを追加または削除するには、2 mlシリンジと21 Gの針を使用してください。
   注：フィールドの同位体モニタの使用は、表面および機器の汚染を監視することが推奨されます。
6. 、蓋を閉じて穏やかに混合し、スピン、ステップ3.1のように、細胞をペレット化するために、のTc-99メートル-HMPAO-細胞混合物に1mlのPBSを追加します。
7. 慎重に（W1とリードシールドおよびラベルの後ろにこれを保存する）新しいチューブにPBSを除去します。新鮮なPBS 1mlに細胞ペレットを再懸濁します。チューブを遠心し、（W2として、このラベルを保存）上記のように、上清を除去します。
8. W1とW2チューブに、細胞ペレットにカウントを測定することにより、標識効率を算出します。まあ同位体投与量キャリブレータ器の各チューブを配置し、分当たりのカウント（cpm）として放射能を記録することによって、これを行います。 （セルのCPMとして放射能）/（細胞+上清の放射能が）×100として標識効率を計算します。
9. 残留PBS中で徹底的に細胞を再懸濁して、BMSは、ステップ3.1から保存を追加します。細胞は病巣内注入の準備ができています。

Tc-99メートル-HMPAO標識細胞の移植4.

1. 病巣内注入超音波ガイド下腱へ
   1. ゆっくりと針の長さができるように、針に沿って、滅菌ドレープで覆われた超音波トランスデューサと縦方向、病変の最大傷害ゾーンに1.5または2インチ（50ミリメートル）20 G針を導入針が正確に病変の中心部に位置されている場合は超音波検査とチップ識別されます。
   2. 適切な遮蔽を使​​用して、（外部の汚染の危険性および鉛遮蔽シリンジカバー内を最小限にするためにルアーロック）2 mlのシリンジに細胞を収集し、20G針を使用して。任意の流体を失わないように注意しながら針を捨てます。今腱に予め位置針上に標識された細胞を注射器を取り付けます。
   3. 組織内の針管がはっきり見えるように針の下に超音波プローブを配置します。病巣にゆっくりだが着実なペースで細胞を注入します。注入に対する抵抗がないことを確認してください。これが発生した場合慎重に、超音波ガイド下で針の位置を変更。病変部への流体噴射がhyperechogenic気泡を含む無響流体として、超音波画像上に表示されていることを確認してください。
   4. 針を引き抜くとすぐに注入された細胞の損失を防止し、四肢の外表面上の同位体の広がりを最小限にするために、針の穴の上に圧力をかけます。すぐに自己接着包帯の一つの層で手足をドレス。馬は今、ガンマシンチグラフィーのための準備ができています。すぐにこれを実行します。
      注意：腱に細胞を注入した後、シリンジに残ることがあり、細胞の可能性の直接的損失を評価するために、空の注射器と針のカウントを取得します。
2. Tc-99メートル-HMPAO標識細胞の局所灌流
   1. ステップ2.4​​に従ってください。
   2. 内側と横方向に配置された2つの100ミリメートルコットンロールガーゼ包帯で近位中手骨の100ミリメートルゴム止血包帯を適用します。
   3. 無菌番目の準備少なくとも5分間、クロルヘキシジンの外科スクラブソリューションと面積をスクラブすることにより、最終的にアルコールに浸したガーゼで横方向近位種子骨の骨のレベルで横の掌側指静脈の上に電子スキンです。無菌の方法で後続のすべての手順を実行します。
   4. ヘパリン処理した滅菌生理食塩水を充填することにより、静脈穿刺のための21のGのx¾ "（0.8×19ミリメートル）翼状針で設定さ100ミリメートル延長を準備して、横方向の掌側指静脈に針を導入します。静脈を入力すると、血液の一部が拡張セットを記入します。ルアーロックコネクタで標識された細胞のその後の注入を容易にするためのルアーロックのゴムキャップを取り付けてください。
   5. PBSでプリロード20ミリリットル注射器で細胞を収集することにより、PBSの19ミリリットルでMSCを希釈します。 （ - 40秒30）ゆっくりではあるが一定の速度で18 G（1.2×40 mm）の皮下注射針を用いたゴムカップを介して細胞に適用します。 syringにプリロード1mlのPBSでカテーテルをフラッシュE。
   6. 針を外し、すぐに5 4×4の綿のガーゼの層で針穴の上の皮膚に圧力をかけます。そして、近位種子骨領域の上に弾性接着剤で光包帯を配置し、注射後30分の場所に止血帯を残します。
   7. 30分後に止血帯を離します。馬は今、ガンマシンチグラフィーのための準備ができています。
      注：細胞を注入した後、シリンジに残ることがあり、細胞の可能性の直接的損失を評価するために、空の注射器と針のカウントを取得します。

5.ガンマシンチグラフィー

1. シンチグラフィー画像
   1. 低エネルギー、パラレルホールコリメータを装備した（20％対称ウィンドウを使用して、140keVで光電ピークに設定）ガンマカメラと平面シンチグラフィ画像を取得。
      1. ステップ2.2のように鎮静し、馬を放置すると、時間0の後にすべての画像を取得します。時間0シンチグラムの後、注入SIの上に光包帯を交換パッド入りの包帯でTE。各シンチグラフィー試験の前に、この包帯を外します。
      2. 「研究の選択」 - - 「骨静的 "オプション"獲得 "して処理ソフトウェアを使用して、60秒ずつ（256行列で256）のための静止画像を取得します。静的モードオプションは、運動を補正するためのモジュールを持っていないので、馬は、画像取得期間中に移動しないことが不可欠です。
      3. 病巣内注射のために、遠位端、対側肢、左肺野と左甲状腺の等価な領域に手根から病変領域から横方向の画像を取得します。前肢画像の取得時には、手足の反対の撮像を避けるために、脚の間鉛スクリーンを設置。注射後5分（時間0）で画像を取得し、その後、1、3、6、12、24、36及び48時間で。
      4. 地域の灌流のために、5.1.1.3と同様に、横方向と背ガンマ画像を得ます。画像を5分のAFを取得ター止血帯リリース。これは、直前に止血帯リリースにカウントを評価するために、細胞を注入した後、手足の画像に役立ちます時間は0になります。細胞の投与後1、3、6、12、24、36及び48時間でのガンマ画像を得ます。
   2. 画像が取得された後、プロセスを手動「ソコロフ」色と「反転」の色のために選択したオプションを使用してソフトウェアの「処理」オプションを使用して画像。これは病変領域の上に選択マスクや動きの整形を可能にするように、次の「関心領域」（ROI）と「楕円」を選択します。 「統計に追加」オプションを選択することで、ROI以上の数を取得します。関心領域（ROI）の同じサイズの領域が異なる時点で各動物について記録されていることを確認します。
   3. 次に、各時点でのテクネチウムの予想減衰のカウントを修正します。減衰を補正するために、以下の式を使用します。E O A = - （0.693トン/ T 1/2）、o は同位体の初期活性である、Aは減衰が時間ゼロで放射能を補正して、tは経過時間であり、T 1/2が半分であります同位体の-Life。そして、次の式を使用して、残りの細胞の割合を仕事に時間0でのROIの割合として各時点で補正カウントを表現します：

（T）= 100％、残りの細胞 - {[（予測減衰（t）を - ディケイ（t））は/ディケイ（t）を予測]}×100

崩壊（T）= ROI（T）は、/ ROI（0）×100。

結果

BMMSsへのTc-99メートル-HMPAOの取り込みは悪の組織培養プラスチックに付着する能力には影響しません、彼らは（ 図1）単分子膜を形成するために増殖能を示しているが、我々は、増殖速度または他の細胞の表現型に影響を与えているかどうかを完全に決定されていません。その形態は、典型的な紡錘状の非標識細胞と同様です。細胞の標識効率（すなわち、ラベルの、取り込み）は、典型的には、約1.5％から25％まで変化します。低標識効率の主な理由は、Moを99 / TC-99メートルジェネレータが溶出されたサイトから診療所への^{99m Tcで}の配送の遅れに関連していました。以上2時間の遅延は、細胞の標識における主要な減少につながります。しかし、十分な同位体は、最大36時間（ 図2）は、ガンマシンチグラフィーを行うために細胞内に取り込まれます。標識効率を向上させることができる因子には議論で詳述されています。

標識された細胞は、デジタル静脈¹又...

ディスカッション

骨髄に加えて、脂肪組織のような供給源から単離された幹細胞は、このプロトコルで標識化するのに適しています。また、凍結状態からの細胞を復活し、標識試験¹²のための所望の数に培養で増殖することができます。

BMMSCを標識の効率を決める重要な要因は、放射性薬局でのモリブデン発生器からのTc-99メートルの溶出の間の時間、のTc-99メートル-HMPAOの準備や診療所での放射性医薬品の使用です。この期間を超えて遅延が大幅に細胞標識の効率を損なうことができるように、発電機からのTc-99メートルの溶出後の標識効率と時間の間に逆の関係があります。したがって、近い協調は、実験室からの細胞の送達および細胞は、放射性標識し、移植になる日に診療所へのTc-99メートルの配信との間に必要とされます。 cliniへの輸送時間Cはそのための重要な要因です。サプライヤーのデータシートのTC-99メートルの減衰が、その後のTc-99メートルと取られたTc-99メートル-HMPAOの量にHMPAOの結合を妨害することができます2時間後、溶出後の放射化学的純度を低下させることを指定します細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
テクネチウム99m			法的要件に従って、地元の電離放射線供給業者にお問い合わせください。 同位体は、モリブデン-99発生源
Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)	GE		ヘルスケア
マイクロフュージ、ミニスピン/ミニスピンプラス	エペンドルフ	22620100
18Gおよび19Gニードル	モメディカル	NN-1838R(18G)に直接お問い合わせください。        NN1938R(19 G)
シリンジ1 mlおよび2 ml	エンティフィックラボサプライ株式会社	SYR6200(1 ml);SYR6003 (2 ml)
マイクロ遠心チューブ 1.5 ml	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS - Phosphate-Buffered Saline	LifeTechnologies	14190
滅菌ガーゼスワブ	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet自己接着包帯	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
超音波画像診断ソフト	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus シンチグラム処理ソフトウェア	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
同位体モニタリング用フィールド同位体カウンター	John Caunt イギリス	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
同位体測定用ウェルカウンター、線量校正器	Capintec Southern Scientific	CRC-25R

からの溶出から2時間以内に使用する必要があります。ヘルスケア GEテルサイ