胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

サマリー

特定のDNA標識であるメチルグリーンで固定された生物学的物質を蛍光染色する方法が説明されています。メチルグリーンは希釈水溶液中で使用され、光退色に対して非常に耐性があります。その遠赤色発光により、深い標本イメージングが可能となり、特に全胚に適しています。

要約

Methyl greenは、DNAに対して特異的な親和性を持つ組織学的染色として長い間知られていましたが、その蛍光特性は最近まで未開拓のままでした。この記事では、メチルグリーン水溶液の調製方法を示し、希釈すると固定細胞や組織の非常に便利な蛍光核標識として使用できます。ゼブラフィッシュやニワトリの胚を丸ごと標識する簡単な手順が詳細に説明されており、得られた画像の例が示されています。メチルグリーンは、633 nmの赤色光によって最大に励起され、677 nmでピークに達する比較的鋭いスペクトルで放出されます。非常に安価で、毒性がなく、溶液中で非常に安定しており、DNAに結合すると光退色に対して非常に耐性があります。その赤色発光により、厚い試料中の核の高分解能走査型共焦点イメージングが可能です。最後に、このメチルグリーン染色プロトコールは、抗体標識や蛍光色素標識ファロイジンによるアクチンフィラメント標識など、他の細胞染色手順に適合します。

概要

DNAの蛍光染色は、核および染色体構造の詳細な研究、組織および細胞の対比染色、または細胞^{周期パラメータの研究}のために、生物学的研究および臨床診断の両方で広く日常的に使用されています。いくつかのDNA染色剤が利用可能ですが、最も広く使用されているのは、UV光によって励起され青色で発光するもので、蛍光タンパク質や抗体に付着した低分子などの緑色およびオレンジ赤色を放出する蛍光色素と組み合わせると、従来のほとんどの落射蛍光顕微鏡で使用される通常の3フィルターシステムに適合します。これらの青色を放出するDNA染色の中で、最も一般的なのはDAPIおよびHoechstマイナーグルーブ結合剤^2,3です。それにもかかわらず、レーザー走査型顕微鏡に多種多様なレーザー輝線とスペクトル検出を組み込むことで、研究者はヨウ化プロピジウム(PI)やTO-PRO 3⁴などの遠赤色発光核染色の使用を選択できるようになりました。これらの染色剤の利点は、多くの細胞や組織、特に胚⁵に見られる自家蛍光の問題を克服することであるが、それらの多くは、発光プロファイルが広い、または光退色に対して非常に敏感であるなど、異なる問題を抱えている6。

スイスの研究者フリードリッヒ・ミーシャーは、1869年に膿の白血球の核からDNAを抽出して発見しました。彼はそれをヌクレインと呼び、数年後に比較的新しい染色メチルグリーンで沈殿物を形成することを示しました。メチルグリーンは、メチル化の程度が異なる3つのアニリン環で構成され、^DNA7,8の主要な溝に強く結合することを可能にする2つの正電荷を持っています。メチルグリーンによるDNA染色は、非常に早い段階で特異的であることが示され、UnnaとPappenheimは、RNAを特異的に標識するピロニンとの複合染色を開発しました。それ以来、メチルグリーンピロニンは日常的な組織学的手法で広く使用されてきました⁹。

最近まで、メチルグリーンの蛍光特性についてはほとんど知られていませんでした。しかし、私たちの以前の研究では、633 nmでの励起、便利なストークスシフト、電磁スペクトルの近赤外部分での発光、同様のスペクトル特性を持つ市販のDNA染色よりも高い光安定性、および非常に低コストでのメチルグリーン^{スペクトルの利点6}がいくつか明らかになりました。そのため、胚組織や全胚のDNAの非常に高い親和性および特異的な蛍光標識として使用されることを試験することにしました。さらに、これまでメチルグリーン核染色は低pHで行われていたため、抗体染色との組み合わせが困難でした。ここで詳述する方法の目標は、生理学的pHで染色手順を行うことにより前述の不便さを克服する蛍光核DNA染色のプロトコルを持つことであり、したがって、切片および組織全体に対する免疫標識に適した対比染色となる。

プロトコル

色素の1精製

1. 10mlの蒸留水で汚れ粉末0.4グラムを溶解することにより、メチルグリーンの4％水溶液を調製します。それを完全に溶解するまで十分に混合します。
2. ヒュームフードの下で、クロロホルムの少なくとも2部とそれを混ぜます。これは、チューブがクロロホルム耐性があるかどうかを事前に確認することが重要です。
3. 十分に混合し、相分離を促進するために2,000×gで1分間遠心します。
4. 遠心分離後、メチルグリーンと上部の水相、クロロホルム、通常汚染物質クリスタルバイオレットと下層の有機相が得られます。
5. 上相を回収し、下相は、クリスタルバイオレットを完全に欠い表示されるまで、この手順を繰り返します。
6. 終了時に、上相を回収し、2％のメチルグリーンの最終濃度まで水で希釈しました。このストック溶液を、ヶ月間作業台の上に安定であり、光から保護される必要がありません。

2。メチルグリーンを用いた全ゼブラフィッシュ胚の蛍光核染色

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の（パラホルムアルデヒドから）4％ホルムアルデヒド中で一晩胚を修正しました。
   注：これは一晩胚の厚さに応じてするのに数時間かかることがあります。例では、一晩の48時間後に受精（HPF）ゼブラフィッシュの胚を固定しました。
2. 5分間、PBS-T（PBS中1％のTriton X-100）中で胚を3回洗浄します。界面活性剤の高濃度は、キューティクルを透過性に。
3. 5,000-1：PBS-T（2％ストック溶液から）メチルグリーン10,000溶液1を調製します。インキュベーション中の界面活性剤の存在は、ゼブラフィッシュの胚および幼生のような厚い標本のために有用です。
4. 緩やかに揺り動かしながら、4℃で少なくとも6時間溶液中で胚を培養します。ここでも、胚の厚さは、培養時間の長さのための校正パラメータです。
5. 胚3ティムを洗います洗剤過剰を取り除くために30分間、PBSでES。 DNAに結合した場合にメチルグリーン蛍光は、したがって、非結合分子からのバックグラウンドは無視できる、唯一のは明白です。
6. 出土したスライドや実装溶液と自家製室（75％グリセロール、0.1Mトリス·塩酸pHは8）にマウント。
   注：核染色は免疫標識後に行われる場合、メチルグリーン、それを洗い流す必要なしに、使用濃度に取り付け溶液に組み込むことができます。
7. ストアは、冷蔵またはすぐに撮影を開始します。レーザー走査共焦点（または他の蛍光）メチルグリーン発光は677 nmで最大となることを考慮して650〜750 nmに登録するように設定さ633 nmおよび発光フィルターで励起し顕微鏡で撮影を行います。
   注：私たちは、補足資料として、取得ソフトウェアにロードされるメチルグリーン発光プロファイルの測定データを、提供します。

3.蛍光原子力セントメチルグリーンを用いた全ニワトリ胚のaining

1. 興味のあるステージに受精鶏卵をインキュベートします。 4℃で一晩、PBS中（パラホルムアルデヒドから）4％ホルムアルデヒド中で胚を修正しました。 2時間の胚をPBS-Tで3回洗浄します。
2. 5,000-1：PBS-T（2％ストック溶液から）メチルグリーン10,000溶液1を調製します。 4℃で一晩染色液中の胚を培養します。胚をPBSで3回、1時間ごとに洗浄します。 75％グリセロール、0.1Mトリス、pHが8と、チャンバ内のマウント。

4.イメージング蛍光が全体に取り付けられた胚中の核を標識

1. 顕微鏡スライド上に電気テープのいくつかの層を貼り合わせて画像化チャンバを準備し、慎重内の胚を配置するメスでそれに穴をカット。これは、撮像中に破砕から胚を防ぐことができます。
2. 慎重に75％グリセロール、0.1 Mトリス-HCl、pH値= 8でトップにチャンバーを撮像チャンバーに胚を移し、フィルボイドバブル形成。
3. メディア溢れを回避または除去する＃0カバーガラスでカバーしています。マニキュアでそれを封印。
4. 633励起フィルターやレーザーラインを装備した蛍光顕微鏡で標本の画像を取得します。
   注：発光フィルタは、メチルグリーンの677発光極大をカバーする必要があります。

結果

厚い試料の核染色。本明細書に説明されたプロトコルは、全胚における深部構造の均一な染色を達成することができます。レンズの開発48 HPFのゼブラフィッシュ胚が均一に標識されている核の形態（ 図1）。

メチルグリーンDNA染色は、有糸分裂像やアポトーシス核の識別（ 図2A）のような、細胞周期依存性の形態学的な違いの識別を可能にします。ゼブラフィッシュ胚（ 図2B）の表皮核のために示したように、高解像度の核内構造も明らかです。

メチルグリーンは、長期間にわたって高強度の照射下で光退色に対して耐性があります。同じ強度で633nmのレーザー光を照射するとき、それは同様のスペクトル特性を共有する別のDNA特異的染色の場合のように、メチルグリーン核染色は、TO-PRO-3、アウト漂白しません4。全体に取り付けられたゼブラフィッシュ胚の網膜の共焦点面を選択し、高い照射を実現するために63X 1.4NA目的でズームしました。ズームアウトするとメ...

ディスカッション

蛍光顕微鏡のバリエーションに特に焦点を当てた、過去数十年にわたる顕微鏡技術の進歩的な発展により、胚全体を含む無傷の組織サンプルのダイナミクスと構造を調査する可能性がもたらされました^10,11。しかし、大きな制限の1つは、細胞内構造を直接かつ迅速に染色するために使用できる高品質の蛍光色素が入手できることです。

DAPIやHoechstなど、最も頻繁に使用される蛍光DNA染色は、UV光で励起され、可視スペクトル^2,3の青色領域で放出されるため、組織全体の深部構造のイメージングには不十分です。赤色光は生体サンプルへの浸透性がはるかに優れているため、赤色発光蛍光色素はこれらの研究により適しています¹²。自家蛍光は胚組織における一般的な問題であり、赤色発光蛍光色素を使用することによっても克服^{できます5。}

我々は、非常に一般的な組織学的染色メチルグリーンが、DNAに結合すると非常に効率的な赤色発光蛍光色素であり、顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
メチルグリーン	Dr. G. Grübler		また、クリスタルバイオレットフリー
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich 323829をテストしました Sigma-Aldrich	158127
レーザー走査型共焦点顕微鏡 Leica TCS-SP5 Leica	Microsystems
Phalloidin–テトラメチルローダミンBイソチオシアネート	Sigma-Aldrich	P1951
クロロホルム	Sigma-Aldrich	372978
遠心分離機 5810 R	eppendorf	5811 000.010
顕微鏡スライド	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025