の単離のための最適化された濃縮技術<em&gt;アルスロ</em&gt;バクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から

サマリー

私たちは、Arthrobacter属の細菌に感染するバクテリオファージの単離のための濃縮プロトコルを提示します。この濃縮プロトコルは、土壌分離株からのArthrobacterファージの単離と増幅について、迅速で再現性のある結果をもたらします。

要約

>jove_content<環境サンプルからのバクテリオファージの分離は、微生物学の先駆者によって定められた原則を使用して、何十年にもわたって行われてきました。Arthrobacter宿主に感染するファージの単離は、おそらく以前の多くの単離技術の成功率が低いため、研究に利用できるArthrobacterファージのグループが少なく評価されているために限られています。ここで説明する濃縮技術は、他の多くの技術とは異なり、インジケーターバクテリアの成長のベースとして、汚染細菌を含まないろ過された抽出物であるArthrobactersp. 具体的にはKY3901です。最初に土壌細菌を除去することにより、標的ファージは、初期の土壌サンプルに存在する天然の土壌細菌との競合によって妨げられることはありません。この濃縮法により、いくつかの異なる土壌タイプから数十のユニークなファージが生成され、同じ濃縮土壌サンプル分離株から異なるタイプのファージが生成されました。この手順の使用は、非常に多様な興味深い宿主細菌のファージを単離するために、ほとんどの栄養豊富な好気性培地に拡大することができます。

概要

土壌環境でのロバクター種の普遍性は、宿主細菌のこの種から単離されることができるファージの膨大な数と多様性を提供しています。 Acintobacteriaceaeファミリーの細菌メンバーは、アトラジン、様々な他の殺虫剤や除草剤の^1,2,3のような扱いにくい化合物を分解することが彼らの異化経路のための最も注目すべきである。ほとんどの研究は、 アルスロバクターの環境の株を用いて行われたが、この属の臨床分離株は、血液、尿、目、すべての系統発生異質^4を表示する他の多くのヒト供給源において見出される。

アースロバクター菌の研究のかなり大規模なボディがありますが、唯一の少数の研究は、この多様な属のメンバーに感染することができるのファージについて報告する。興味深いことにしかし、 アルスロで以前に行われた作業は、土壌のタイピングなど、いくつかの重要な個別のトピックにタッチをファージをのアルスロバクター種^5、活性汚泥処理プラント^6、及び作業強調部位特異的組換えおよびインテグラーゼ遺伝子⁷において有害な泡の低減を目的と工業用途。

様々な濃縮技術プロトコルは、純粋なファージは、 アルスロバクター種におい....

プロトコル

ファージを単離するためのArthobacter細胞の作製

• 文化アースロバクター·エスピー KY3901コロニーは2〜3日間30℃でインキュベートルリアBertaini（LB）寒天プレート上にストリーク。コロニーを採取し、バッフル培養フラスコ中のLBブロス250ミリリットルに追加し、30℃で225rpmで振盪インキュベーター中でインキュベートし、滅菌ループを使用。
• ファージ感染実験のために後半早い/指数関数定常期の細胞を得るための成長の約24時間を許可します。後半定常成長状態に真ん中に入るから細胞を防ぐために密接に細菌増殖の状態を監視します。
  注：細胞増殖は、後述するファージの単離および精製手順/ステップのために0.5-.0.7間の光学濃度OD ₆₀₀で構成する必要があります。

土壌サンプルからのファージの2コレクション

1. 目的の場所から土壌の200〜400グラムを収集します。注：Arthroba中の細菌以来CTER属は、それらを感染させるファージに見出され、土壌のほとんどの種類に普及していることができる一般的な土壌細菌である。
2. 土壌へのファージバッファ（PB）[68 mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO ₄を、10mMのTris-CL液（pH7.5）]の少なくとも400 mlを加えPBの少なくとも20....

結果

アースロファージのための改善された濃縮技術の再現性を実証するために、30種類の土壌サンプルは、固有のアースロファージは、この濃縮を使用して採取した土壌サンプルの22から得られたこれらの30の土壌サンプルの2014年の春と夏の間、異なる時間と場所で使用した手順。標準濃縮手順は、同じ土壌試料の3からユニークなファージを得た。濃縮サンプルは、プラークまたはプラークの検出に成功のために濃縮されたアルスロの大きな体積を必要とする比較的低いファージ力価を分離するために最初の希釈を必要とする非常に高いファージ力価を持つことができます。私たちは、最初の濃縮およびLB寒天上にプレーします（ 図2）の後に、純粋なファージ集団を単離するためにプラークストリークメソッドを使用します。あるいは、従来の標準的なプラーク力価アッセイは、この方法は多くの時間、試薬および材料を要するものの、純粋なファージ単離物を単離することができるS。前述のように、我々は実験的にプレート上ウェビングパターンを形成するファージ力価数およびプラーク形成単位（PFUで）の数を決定するために、プラーク力価.......

ディスカッション

アルスロホストに感染することができるファージを単離するための多くの以前の試みにもかかわらず、私たちは、標準的な濃縮手順を使用してほとんど成功していた。環境サンプルからファージを豊かにするバンTwestとKropinski ¹⁰によって開発され、適合した細菌の濃縮の一般化された方法は、濃縮手順の大多数のための基礎のまま。以前の研究からの証拠は、ダイレクトプレーの方法は、分離⁵の非常に低い成功率ではあるがアースロバクターの菌株に検出可能なプラークを生産していることを示唆している。ダイレクトプレーティング法により、ファージをファージバッファに土壌試料から抽出し、雑菌を除去するために濾過される。ファージ粒子を含有する濾過抽出物は、宿主細胞の感染を可能にするために、所望の細菌宿主に添加し、細菌の増殖およびファージ増幅のさらなるラウンドなしでメッキされる。

当社の濃縮技術は堅牢でオペアンプですアースロバクター·エスピー KY3901からアースロファージの比較的.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LBブロスパウダー	フィ	ッシャーBP9722-2	て注文するのが最善です。
粒状寒天	フィ	ッシャーBP1423-2	て注文するのが最善です。
0.22 umシリンジフィルター	フィッシャー	09-719A
0.22 um ブフナーフィルター	フィッシャー	430320	レシーブチューブを慎重に交換することで、50ml以上の液体を得ることができます。
エッペンドルフチューブ	フィッシャー	05-408-129
5 ml ピペット インディビジュアル	フィッシャー	13-678-11D
50 ml コニカルチューブ	フィッシャー	76002844
15 ml コニカルチューブ	フィッシャー	76002845
10 ml ピペット 10 ml ピペット		13-676-10J
25 ml ピペット インディビジュアル	フィッシャー	13-676-10K
Whatman定性的な濾紙	フィ	ッシャー1001-824

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