イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

サマリー

細胞膜の

トランスポーターは、細胞膜または細胞層間でイオンを異なる分離することを可能にし、組織の生理学、修復、病理学において重要な役割を果たします。ここでは、in vivoで単一細胞および組織における特定のイオンフラックスの測定を可能にするイオン選択的自己参照型微小電極について説明します。

要約

動物、植物、単一細胞からの細胞は、外部から細胞質を分離し、細胞膜と呼ばれるバリアによって囲まれています。例えば、上皮細胞層としても外​​側または多細胞生物の異なる区画の内部を分離するバリアを形成します。これらの障害の重要な特徴は、細胞膜または細胞膜を横切るイオンの微分分布です。二つの特性は、この配布を許可する：1）膜および上皮は、特定のイオンを選択的に透過性を表示します。 2）イオンは、細胞膜および細胞膜を横切るポンプを介して輸送されます。これらの特性は、組織の生理機能の維持に重要な役割を果たし、修理の際に、損傷後の手がかりを信号として機能し、または病理学的条件の下で。イオン選択自己参照微小電極は、単一の細胞および組織レベルでのカルシウム、カリウムやナトリウムなどのイオンの特定のフラックスの測定を可能にします。微小電極は、イオノフォアのカクテルが含まれています特定のイオンを選択的に透過。内部充填溶液は、目的のイオンの設定濃度が含まれています。微小電極の電位はイオンの外濃度によって決定されます。イオン濃度が変化するように、微小電極の電位がイオン活性の対数の関数として変化します。 （これはイオン束に濃度勾配で、すなわち ）イオンのソースまたはシンクの近くに前後に移動すると微小電極電位はイオンフラックス/勾配に比例した振幅で変動します。増幅器は、微小信号を増幅し、出力は、コンピュータに記録されます。イオン束は、その後、特定のイオン移動度として、電極電位変動、微小電極の偏位、および他のパラメータを使用して拡散フィックの法則によって計算することができます。本稿では、イオン選択自己参照微小電極のANを用いて細胞外のイオンフラックスを測定するための方法論を詳細に説明しますいくつかの代表的な結果を提示するdは。

概要

全ての動物細胞は、外部環境から細胞質を分離する脂質二重膜で囲まれています。セルは、イオン¹の能動輸送により、内部の電気膜電位、負を維持します。膜電位は、細胞は、膜²に、様々な分子デバイスを動作させるために利用することができる保存されたエネルギー源です。ニューロンおよび他の興奮性細胞は、大きな膜電位を有します。ナトリウムチャネルの迅速な開口部は膜電位（脱分極）の崩壊と神経²の長さ方向に沿って搬送される活動電位を生成します。別にこれらの急速な電気的変化から、多くの組織や器官が発生し、重大な長期的な電位を維持します。例えば、皮膚、角膜上皮が発生し、イオンの方向励起（主にナトリウムと塩化物^）3によって経上皮電位および細胞外の電流を維持します。

10トン">内因性細胞外電流の測定は微小電極システム^7-10は、細胞膜および上皮細胞層の電気的パラメータの測定を可能に用いて振動プローブ^4-6および膜または経上皮電位の測定値を使用している間、彼らはない与えます関与するイオン種の指標。

選択的イオノフォアと微小電極は、溶液中の特定のイオン濃度を測定することができます。イオン勾配またはフラックスは異なる位置に2つ以上の電極を用いて測定することができます。しかし、各プローブの固有の電圧ドリフトは、不正確な測定または存在しなかった勾配であっ​​ても検出....

プロトコル

1.イオン選択自己参照微小電極作製

1. イオン選択性微小電極の作製
   1. 熱は微小電極プラーを使用してフィラメント（1.5ミリメートル外径、1.12ミリメートル内径）を使用せずに薄い壁ホウケイ酸毛細血管を引き出します。
      注：これは、先端に直径3-4ミクロンを提供します。小さいヒントは、電子ノイズの微小電極受けやすく、また、イオン濃度の変化に遅く応答と関連する、より高い抵抗性を有します。有用な情報は、Smith らによって発表された論文に記載されています^。26。
   2. 親油性イオノフォアカクテルの保持を補助するための内側表面を疎水性にするために電極をSilanize。それらを乾燥させるために> 100℃のオーブンで金属ラックおよび熱O / Nで微小電極を配置します。ラックは、直径2mmの孔を有する金属板を介して方法の一部を掘削します。 250ミリリットルgの上向きの穴先端に電極を配置しますその上小娘ビーカー。
   3. 午前中は、オーブンをオフにして、絶縁手袋を着用し、慎重に所定の位置に電極を、ビーカーの金属ラックを削除します。熱を保持するためにオーブンのドアを閉じます。
   4. ラテックスまたはニトリル手袋、白衣と目の保護具を着用します。プラスチック製パスツールピペットで、私は、各電極の基部にシラン化溶液の液滴を配置（場所にビーカーを保つ、ピペットアクセスのための注ぎリップを使用します）。シラン化ソリューションは、ホットプレー....

結果

我々は以前、カルシウム流入は、単一のセルが^24を負傷した後に表示されることが示されています。したがって、我々は、他のイオン束は、単一の細胞損傷の際に発生するかどうか尋ねました。我々は、Xを使用しました卵母細胞をアフリカツメガエル 、単一のセルのための十分に確立されたモデルは^30〜34と電気生理学的記録^24,35-39創傷^{治癒します} 。興味深いことに、カリウムイオンは、Xの内部に、より集中しています創傷時のカリウムの流出を示唆している：（1 mMのMMR 1Xに）使用される細胞外溶液中よりも卵母細胞（約110 mM）の^40を アフリカツメガエル 。この仮説を確認するために、我々は、Xの過程でカリウムフラックスを測定しましたイオン選択自己参照微小電極を用いた卵母細胞の細胞膜の治癒をアフリカツメガエル 。

卵母細胞を創傷に、最初の大きな先端サイズ（〜50μm）を有するキャピ.......

ディスカッション

in vivoでの細胞外イオンフラックスの測定に成功するために最も重要な手順は次のとおりです。ノイズの低減、イオン選択微小電極と参照電極の正確な製造、およびサンプルと両電極の配置。

ノイズを最小にするために、記録システムは、好ましくは、接地された金属張り（防振）テーブルでアース（接地）ファラデーケージにする必要があります。また、顕微鏡シャーシも接地する必要があります。電気ノイズの発生源は、光源を含みます。光ファイバ「ファンレス」光源は、最小限の電気的ノイズの原因となります。最後に、所有者はまた、塩素化微小電極に銀線、ペレットを維持すること（次亜塩素酸ナトリウム漂白剤に浸漬してのdH ₂ Oですすぎ）ノイズを最小限に抑え、イオン選択微小電極や測定になります参照電極中の気泡の選択図存在として失敗微小電極の導電率はゼロか、改ざんされます。これにより、所有者にそれらをマウントする前に顕微鏡下で電極を検証することが重要です。気泡を除去するための詳細な手順のためのプロトコルを参照してください。サンプルおよび微小電極の両方の正確な位置決めが確実かつ再現可.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イオナップ	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	なし	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA によって作成されたアンプ。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)または該当する電子機器(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	なし	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA によって作成されたソフトウェア。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
ヘッドステージプリアンプ	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA;同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	なし	X、Y、Z ポジショニングには 3 つの MicroStep ドライバーが必要です。BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; によって作成されました。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
手動マイクロポジショナー	世界の精密機器	モデルKITE-R	同様のシステムは、Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand から購入できます。	World Precision Instruments	Model M10	同様のシステムは、Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
防振テーブルから購入できます	ニューポート社	モデルVW-3036-OPT-023040	同様のシステムは、適用可能な電子機器(http://www.applicableelectronics.com/)から購入することができます
3次元マイクロポジショナーの一部:アングルブラケット、90°、スロット付き面	ニューポート社	モデル360-90	3次元マイクロポジショナーの集合体には、X、Y、Z制御用の3つの電動ロータリーモーター、MCA-2調整可能な角度ポストと振動テーブルにボルトで固定するさまざまなニューポートコネクタとネジを備えたMPH-1取り付けアームも必要です
次元マイクロポジショナーの一部:ペグ結合ダブテールステージ0.5インチ Xトラベル	ニューポート株式会社	460PD-X	なし
3次元マイクロポジショナーの一部: クイックマウントリニアステージ、0.5インチ XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	なし
Kwik-Fil薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリー(フィラメントなし)	世界の精密機器	TW150-4
無電極プーラー	成茂	PC-10	なし
金属製ラック		なし	製電極ホルダー 10cm x 15cmの長方形のスチール製ベースに半センチ間隔の穴をあけて、2mm幅の穴を開けて社内製
オーブン	QL	Model 10 ラボオーブン	なし
シラン化ソリューション I	Sigma-Aldrich	85126	危険、プロバイダーが推奨するハンドル
ガラスペトリ皿;パイレックス	フィッシャー サイエンティフィック	316060	なし
電極/マイクロピペット 保存ジャー	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	E215	なし
ガラス乾燥器	フィッシャーサイエンティフィック	08-595E	ドライエライト乾燥剤が含まれています(WA Hammond Drierite Co. Ltd、Xenia、OH、USA)。シールにワセリンを敷いて気密にします。
プラスチックパスツールピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	11597722	なし
ブンゼンバーナー	フィッシャー・サイエンティフィック	S97329	なし
顕微鏡スライド	シグマ・アルドリッチ	S8902	なし
ストレートマイクロ電極ホルダー	ワーナー・インスツルメンツ	QSW-A15P	ゴールド1mmオスコネクターとAg/AgClワイヤー付き
ストレートマイクロ電極ホルダー	World Precision Instruments	MEH3S	内部にAgCl(Ag+)ペレット、金2mmオスコネクタ付き
6 cmシャーレ	VWR	60872-306	なし
Nitex mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	なし
接着剤;ロックタイトエポキシ	VWR	500043-451	計量ボートで接着剤と硬化剤を均等に混合し、完全に混合します。すぐにセットしますが、完全に硬化する
脱イオン水	Sigma-Aldrich	99053	なし
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7653	なし
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P9333	なし
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C1016	なし
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M8266	なし
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	なし
ヒドロキシドナトリウム	Sigma-Aldrich	S8045	なし
酢酸カリウム	Sigma-Aldrich	P1190	なし
アガロース	Σ-Aldrich	A9539	なし

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