胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

サマリー

ゼブラフィッシュの胆道による肝臓再生の根底にある分子メカニズムを評価するために、メトロニダゾール治療によりニトロレダクターゼを発現する肝細胞が遺伝的に除去される肝障害モデルを確立しました。 このプロトコルでは、肝細胞のアブレーションと胆道主導の肝臓再生を巧みに操作、監視、分析する方法について説明します。

要約

肝臓は再生する素晴らしい能力を持っています。 hepatocyte-または胆管駆動の肝再生：肝細胞、肝臓の実質細胞は、次のいずれかの方法で再生することができます。胆管駆動の再生に、再生肝細胞は、胆管上皮細胞（BECS）から誘導され、一方、肝細胞主導の肝再生においては、再生肝細胞は、既存の肝細胞に由来します。肝細胞主導の肝臓再生のために、大幅に肝再生の現在の理解に貢献した優れたげっ歯類モデルがあります。しかし、そのようなげっ歯類モデルは胆汁駆動型肝再生のために存在しません。私たちは最近、BECSが広く重度の肝細胞の喪失時の肝細胞を生じさせているゼブラフィッシュの肝障害モデルについて報告しました。このモデルでは、肝細胞を特異的薬理遺伝学的手段によって切除されています。ここでは、肝細胞を切除するとBEC主導の肝再生過程を分析するために、詳細に方法を提示します。この肝細胞特異的切除モデルは、さらに胆汁ドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを発見するために使用することができます。さらに、これらの方法は、肝再生を増強または抑制する小分子を同定するために、化学的スクリーニングに適用することができます。

概要

肝臓は非常に再生器官です。肝臓再生中に、肝細胞の再生、肝臓の実質細胞は、既存の肝細胞（肝細胞ドリブン肝再生）またはBECS（胆汁ドリブン肝再生^）1,2から誘導されます。肝臓損傷は、通常、既存の肝細胞の増殖を誘発します。肝細胞増殖が損なわれたときただし、BECS ^2-4を肝細胞に寄与することができます。肝再生のこれらの2つのモードは、臨床的に重要です。 （理由肝腫瘍やライブ肝ドナーの例えば ）ヒト肝臓の一部を外科的に除去すると、残りの肝臓における肝細胞は、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。 BECSまたは肝臓前駆細胞（たLPC）は、肝細胞の再生^5,6に寄与するように見えるように対照的に、重篤な肝疾患を有する患者において、肝細胞増殖が大きく損なわれる。げっ歯類2/3部分肝切除モデル、中肝細胞は有意に肝細胞主導の肝再生^7,8の現在の理解に貢献してきました、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。しかし、再生肝細胞は、主にBECSに由来する有効なげっ歯類モデルはありません。いくつかのげっ歯類の肝臓毒素モデルは胆道駆動型肝再生^2-4の同定をもたらしたが、マウスにおける最近の系譜トレースの研究では、これらのモデル^9,10に肝細胞の再生にBECSの最小の寄与を示しています。部分肝切除^11-13とアセトアミノフェン誘発性肝障害^14,15を含むげっ歯類の肝障害モデルのいくつかは、ゼブラフィッシュに適用され、肝臓再生に関与する新規遺伝子または経路の同定につながってきました。しかし、肝細胞主導型ではなく、BECドリブン、肝再生は、これらのゼブラフィッシュの肝障害モデルで発生します。したがって、新規な肝臓損傷モデルとは、BECSは広くregeneratに寄与します肝細胞をるがBEC主導の肝再生のよりよい理解のために必要とされます。

ここで説明肝切除モデルの全体的な目標は、（1）BECSは広範囲の肝細胞の再生に寄与し、そして（2）BECドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを解明した肝損傷モデルを生成することです。私たちは、損傷の重症度は、肝臓再生のモードを決定するという仮説を立てました。このように、我々は、胆管駆動の肝再生が厳しい肝細胞傷害の際に開始するだろうと予測しました。この仮説を検証するため、我々はトランスジェニック系統を生成することにより、ゼブラフィッシュの肝臓損傷モデルを開発し、Tgは^{（fabp10a：CFP-NTR）S931は} 、ことは非常に肝細胞特異的fabp10a下シアン蛍光タンパク質（CFP）と融合した細菌ニトロレダクターゼ（NTR）を発現しますプロモーター。 NTRは、非毒性のプロドラッグを変換するので、メトロニダゾール（MTZ）は、細胞傷害性薬物に、それだけで意図アブレーションNTR-この場合^、16-18肝細胞発現細胞。 MTZ治療の持続時間を操作することによって、肝切除の程度を制御することができます。このモデルを使用して、我々は最近、重度の肝細胞の喪失時に、BECSは広く、さらに他の二つの独立した研究^20,21によって確認された肝細胞^19を 、再生を生じさせることを報告しました。したがって、上記の齧歯類及びゼブラフィッシュ肝臓損傷モデルと比較して、我々の肝切除モデルはBEC駆動型肝再生を研究するため、より有利です。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ肝切除モデルを用いて、肝再生の実験を行うための手順を記載しています。このモデルは、胆汁駆動型肝再生のメカニズムを決定するための、および化学スクリーンが抑制または肝再生を増強することができる小分子を同定するために適切です。

プロトコル

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って上昇して飼育しました。実験は、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

胚/幼虫の調製

1. 時限交配を行うために、成人男性と女性のTg（fabp10a：CFP-NTR）を設定^S931半接合またはホモ接合性魚類のO / Nを、それらの間の仕切りを配置します。相手が所望される場合は、次の朝、この分周器を取り外します。細かいプラスチックメッシュストレーナーを用いて水を負担することによって胚を収集します。
2. 逆さまにストレーナを回して、スクイーズボトルから分配卵の水の細い流れにメッシュ表面をすすぎます。卵、水25mlで100ミリメートルペトリ皿に100胚を移します。ペトリ皿当たりない100以上の胚を維持し、28℃でそれらを発生させます。
3. 色素沈着を抑制するために、10時間後に受精（HPF）の前にペトリ皿にフェニルチオ尿素（PTU）を追加し、電子メールを上げます80 HPFまでmbryos /幼虫。 PTUの最終濃度は0.2 mMです。注意：PTUは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
4. ペトリ皿の中に0.016％の最終濃度で、3-アミノ安息香酸エチルエステル（トリカイン）を加えることにより、幼虫を麻酔。そして、落射蛍光顕微鏡、ソートCFP陽性幼虫を使用。同様の肝臓サイズで幼虫を使用して、小さいまたは大きい肝臓のものを捨てます。
   注：ヘミ接合性およびホモ接合性幼虫の間に肝切除の程度の差がないため、任意のCFP陽性幼虫は関係なく、強度、使用することができます。注意：トリカインは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
5. トリカインを含む卵の水を除去し、0.2 mMのPTUを補充した卵の水を加えます。 28℃での胚/幼虫を保管してください。

2. MTZトリートメント

1. 1にMTZ粉末0.171グラムを溶解することにより、新鮮な10mMのMTZ溶液を調製します00ミリリットルの卵の水は、0.2％DMS​​Oおよび0.2 mMのPTUを補いました。完全にMTZを溶解するために、20〜30分間急速に撹拌しながら室温で溶液を混合。 MTZを製造する場合MTZを可溶化するために役立つと幼虫にMTZの浸透を高めるために、DMSOを追加します。注意：長時間の暴露またはMTZ濃度の増加は、毒性です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
2. 二つの異なるの100mmペトリ皿またはマルチウェルプレートに幼虫の所望の数を転送することにより、対照群と実験群に幼虫を区切り。実験群では、10 mMのMTZ溶液中の幼虫を保ちます。対照群のために、0.2％のDMSOを含む卵水に保管してください。
3. MTZの光不活性化を防止するために、プレート又はアルミニウム箔でMTZ溶液を含むペトリ皿を覆い、そして28℃でインキュベートします。 MTZ処理の時間は、幼虫期およびトランスジェニックラインに依存しています。
4. で同様の重度の肝切除を観察するために、 のTg（fabp10a：CFP-NTR）ライン、（36時間の期間）3.5日後受精（DPF）のいずれかから、または（24時間の期間）5 DPFからMTZ溶液で幼虫を扱います。

胆道主導の肝再生の3分析

1. アブレーション期間の終わりに、プレートからMTZ溶液を除去。卵の水25mlを添加することにより、MTZ処理した幼虫を洗ってください。卵の水を廃棄する前に幼虫を洗浄し、プレートを2〜3回渦巻きます。 3回繰り返し、その後、もう一度卵水に幼虫を浸します。 MTZ処理した幼虫における心臓浮腫と幼虫の死を回避するために、幼虫を固定化するために0.008％の最終濃度で、トリカインの低濃度を追加します。
2. 肝臓分析のために、CFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でMTZ処置幼虫の肝臓サイズを調べます。肝臓の相対サイズに基づいて肝切除レベルを評価：大（非アブレーション; 0〜10％の幼虫）、中（部分的に切除さを、10-20％）、及び非常に小さな（完全に切除された; 80〜90％）。
3. 非アブレーションされたまたは部分的に切除された肝臓と幼虫を削除します。唯一の重度の肝切除の指標である小さな肝臓で幼虫を保ちます。再生0時間の時点（R0H）で肝臓分析のために、MTZの洗い出しとCFPのソート後の幼虫を収穫。それ以外の場合は、収穫の準備ができるまで、0.2 mMのPTUを補充した卵水にソートされた幼虫を保ちます。
4. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに回収した幼虫を転送し、PEM緩衝液中の3％のホルムアルデヒドの固定液で卵の水を交換してください。回転子O上/ Nチューブを4℃でインキュベートします。
5. PBSDT 1mlの固定液を交換し、5分間ローテーターの幼虫を含むチューブを回転させます。
6. 手動で解剖顕微鏡下で卵黄と胸のフィンを取り外し、ピンセットをPBSDTを含有し、使用して100ミリメートルのペトリ皿に固定された幼虫を転送します。 1.5mlチューブにアップTP 20解剖幼虫を転送します。
7. ブロッキング溶液1mlのPBSDT液を交換し、2時間室温で回転体にチューブを揺すります。
8. 一次抗体を含むブロッキング溶液100μlのブロッキング溶液を交換してください。ゆっくりと回転体のO / Nで4°Cのチューブを揺すります。
9. 一次抗体溶液を除去し、10分間PBSDTで毎回5回洗浄します。その後、二次抗体を含む溶液を阻止する100μlのを追加し、2時間室温で回転装置上でそれを揺すります。
10. 回転子に揺動することにより、室温で10分間PBSDTで毎回5回洗浄します。
11. 顕微鏡スライド上に横方向に幼虫を向けると装着メディアのドロップを追加します。慎重にカバーガラスでそれらをカバーし、ネイルポリッシャーでカバーガラスをシール。今は、共焦点顕微鏡のための準備ができています。

結果

3.5へのDPF劇的に低減肝臓サイズ（ 図1B）から36時間、MTZ処理（A36h、Aは、アブレーションの略）。 MTZのウォッシュアウト後、肝再生（R）の始まりと考え、強いfabp10a：CFP-NTRとfabp10a：DsRedの発現は、30時間（ 図1B）内に再び現れました。肝内胆管ネットワークBECS ²²の膜中に存在するALCAMの発現によって評価されるように、最初に崩壊したが54時間後にウォッシュアウト（R54h）（ 図1C）で再確立されました。これらのデータは、肝臓の再生及び回復が急速に我々の肝傷害モデルで起こることを示しています。

図2は、再生肝細胞がBECSから派生していることを示しています。 Tgが（Tp1の：H2B-mCherryを^{）S939ライン}は12 RBP-Jĸ結合部位^23を含む要素の制御下にある核...

ディスカッション

重度、軽度ではない、肝切除は、胆管駆動の肝臓の再生を誘発します。 CFP-NTR導入遺伝子：したがって、MTZの治療およびウォッシュアウトの後、それはfabp10aから固有のCFPの蛍光によって評価することができるMTZ処理した幼虫の肝臓サイズを調べることが重要です。 MTZ処理した幼虫の小さな割合は、非アブレーション表示（0-5％）または（10〜20％）の肝臓の一部アブレーションされますので、整理し、非常に小さな肝臓で幼虫を分析することが不可欠であり、その重度の肝切除の指標です。

我々のプロトコルでは、我々は5 DPF（36時間の処理期間）に3.5からMTZとゼブラフィッシュの幼虫を処理しているが、代替のステージとMTZ処理の時間も可能です。例えば、6 DPF（24時間の処理期間）5から処理された幼虫は、前述の36時間の処理期間に類似重症肝切除を示しました。独立して生成された二つの追加のグループ類似fabp10a：NTRトランスジェニック系統とは、肝細胞特異的切除次胆汁主導の肝再生の過程について報告しました。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)粉末	Sigma-Aldrich	A5040	0.4%(15 mM)トリカインストックを作る:0.4 gのトリカインを卵水で100 mLにします。pH 7に調整します。
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
メトロニダゾール	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	252549
硫酸カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C3771
N-フェニルチオ尿素(PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
封入剤(ベクタシールド)	ベクターラボラトリーズ	H-1000
100 x 15 mm シャーレ	デンビルサイエンティフィック株式会社	M5300
クリアマニキュア	ッシャーサイエンティフィ	50949071
ファインフォーセプス	サイエンスツール	11251-20	デュモン#5
スライドガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-1
ガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-540-A および 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (マウス アンチアルカム)	ZIRC	zn-5	1:10 希釈
ヤギ anti-Hnf4a	サンタクルス	sc-6556 (C-19)	1:50 希釈
ラット anti-RFP	対立遺伝子バイオテクノロジー	ACT-CM-MRRFP10	1:300希釈
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 希釈
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 希釈
Cy3 ロバ抗ラット IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 希釈
解剖顕微鏡	ライカ マイクロシステムズ	S6F
落射蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	M205FA
共焦点顕微鏡	カールツァイス	LSM700
卵 水			0.3 g/L の海塩 'インスタントオーシャン」0.5 mM CaSO4 蒸留水
[header]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O、80 g NaCl、2 g KCl、2 g KH2PO4. 蒸留水で1Lにします。 pH 7を調整します。 121°Cで20分間オートクレーブします。
1X PBSDT			0.2% Triton X-100 および 0.2% DMSO を 1 X PBS に含みます。
PEM			g PIPES、761 mg EGTA、1 mM MgSO4. 蒸留水で1Lにします。 pH 7を調整します。
ブロッキング溶液			1 mLの熱不活化ウマ血清と9 mLの1X PBSDTを混合します。