組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

サマリー

ここでは、筋生検の凍結、埋め込み、凍結切片、および人工物の凍結を避けるための最も効率的な方法を示します。

要約

筋肉生検の組織学的評価は、神経筋疾患の病態の発症および進行の理解に不可欠なツールを務めています。しかし、そうするためには、適切なケアは、最適な染色を達成するための組織を切除し、保存するときに注意が必要です。組織保存する一つの方法は、ホルムアルデヒドで組織を固定し、その後パラフィンワックスでそれらを埋め込むことを含みます。この方法は、よく形態を保持し、室温で長期保存を可能にしますが、面倒であり、有害な化学物質の取り扱いが必要です。また、効果的な免疫染色​​のための抗原回復プロトコルを必要と抗原架橋、ホルムアルデヒド固定をもたらします。逆に、凍結切片は、固定を必要とし、したがって、生物学的な抗原の立体構造を保持しません。この方法は、intraoperaような迅速な組織学的評価を必要とする状況で、それは特に有用なもの、時間の周りクイックターンで明確な利点を提供します外科的生検を的。ここでは、異なる組織学的および免疫学的汚れによる可視化のための筋肉生検を調製する最も効果的な方法を説明します。

概要

筋肉組織学の検討は、神経筋障害^1-4の異なるタイプの理解に重要な役割を果たしています。他の技術と組み合わせると、それは研究者が病状の症状および進行のより良いアイデアを得ることができ、また、治療的介入^5-10の有効性を評価するために不可欠であることができます。しかし、正確に、組織を直ちに切除前の生理的状態を維持するように適切な方法で保存する必要があります。これは、除去、保存、切片、および染色の際に細心の注意が必要です。

組織を光学顕微鏡研究のため、2つの異なる方法で調製する​​ことができます。 （FFPE）のセクション、埋め込 ​​まれた第1の方法、ホルマリン固定パラフィンは、組織はパラフィンワックス^11,12に埋め込 ​​まれる前に、10％の自然緩衝ホルムアルデヒド中に固定することが必要です。固定工程は、より良い形態を維持するのに役立つだけでなく、クロスリンク内因性のPRoteinsは、このように免疫染色のための複雑な抗原回復手順を必要とし、このようなセクション¹²の酵素染色の可能性を排除します。凍結切片を、一方、予め固定または処理する必要はありません。したがって、タンパク質は、天然の生物学的な立体配座^13,14を保持することができます。また、凍結切片はまた、時間に肉腫および他の外科的生検¹⁵の術中診断で、たとえば、必要である、迅速なターンアラウンドタイムを可能にします。適切に行われていない場合は、この方法は、組織学的検査のためのセクションでは、不向き作る筋肉のアーキテクチャの変更を紹介しダメージを、凍結する傾向があります。本稿では、適切な検査のために最適な染色を達成するために、筋肉生検を準備するための最も効果的な方法を概説します。

プロトコル

1.組織の収穫と筋組織の凍結

1. イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロエタン）の過剰摂取で、​​マウスを安楽死させます。ヒュームフードで、このステップを実行し、そのようなデシケーターやイソフルランに浸した綿棒を含むベルジャー等の二次封じ込めメソッドを使用します。
2. しっかりとフットパッドを絞ることによって死を確認してください。このような頸椎脱臼などの安楽死の二次メソッドを使用します。
3. 筋肉の緩み髪の毛の付着を低減するために、70％のアルコールで毛を濡らします。このような＃5のように微細な鉗子を使用して、四肢切断、皮膚の皮をむきます。
4. 慎重に、下骨から（この場合は前脛骨筋（TA））、目的の筋肉を分離腱から開始して削除します。
5. 、筋肉を切除10月（最適切断温度化合物）でそれをカバーし、標識された使い捨ての凍結金型の上に平らに横たわっていました。筋肉は、その正常な生理的姿勢であることを確認してください（TAIにヘッド延伸することなくL）。あるいは、小さな発泡スチロールの正方形の筋肉を凍結し、筋肉の正しい長さを確保するために昆虫ピンを使用してピン。
6. 液体窒素を用いた鋼ビーカーに2-メチルブタン（イソペンタン）を冷やします。 5分 - これは、平均3になります。白い沈殿物をビーカーの底と壁に形成し始めるまで、断続的に攪拌してください。
   注：この場合、イソペンタン、最適な凍結温度に到達した（-150°C）
7. チルド2-メチルブタンの筋肉を含む金型を浸し。 12秒と腓腹筋ヒラメ筋（GS）と15上腕三頭筋などの大きな筋肉 - - 20秒かかる6ダイアフラムと長指伸筋（EDL）などの小さな筋肉をフリーズします。あまりにも長い間、この亀裂につながる可能性としてのための筋肉を凍結しないでください。
8. ドライアイスの上で凍結組織を移し、（このプロセスは15の周りの平均をとることに注意してください - 20分）イソペンタンを蒸発させて。アルミ箔で組織をラップとuでそれらを格納切片までLTRA低温（-70℃〜-80℃）。

2.組織ブロックを準備するために10月に組織を埋め込みます

1. ドライアイス上で輸送組織が融解を防ぐためにcyrostatします。 （組織の完全融解を回避するために、C°-24、-20に設定）チャンバをクライオスタットし、それらを30分間平衡化させるために組織を転送します。
2. の冷却ペルチェベイの電源を入れます。クライオスタットは、この冷却を持っていない場合は、すぐに10月を凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用しています。このような埋め込み中の任意の時点での筋融解は、凍結損傷を与えることができないようにしてください。
3. 試料ディスク上の10月の均一な薄層を追加し、冷まします。上にまだ液体ながら10月のほとんどが底に凍結されている場合には、（横断面と縦断のための10月に平行のため10月に垂直な方向）正しい向きで組織を挿入します。すぐにOCTを凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用してください。熱EXTと組織のunembeded部分に触れてractor、45秒間待ちます。
4. 、筋肉の周りに10月の別の薄い層を追加し、エアロゾル冷却スプレーで噴霧し、前のステップと熱を抽出。
5. 少しずつで10月を追加し続けると、すぐに全体の筋肉がカバーされるまでエアロゾル冷却スプレーおよび熱抽出器の組み合わせを使用して、10月にフリーズ。
6. 組織ブロックの上に熱抽出を入れ、5分間待ちます。

3.切片を作製し、筋肉のミッド腹領域からのセクションを識別する

1. 試料ヘッドの上に試料をマウントします。ディスクを右に回して、締め付けます。試料ディスクを試料ヘッドとの良好な接触状態にあることを確認します。
2. °-21の間および-24℃に室内温度を調整し、設定温度が達成されるまで待ちます。
3. 厚さの設定（7μm）を調整します。粗微動の設定を使用してブロックを前進または後退させることにより、ブロックをトリミング。
4. セクションを収集上のスライドに切断面の付着を容易にするために、反対の電荷間の引力を使用して、セクションの上にスライドの上部を押して、正に荷電した顕微鏡スライドを予熱しました。
5. セクションの断面積（​​CSA）を測定することにより、ミッドベリーセクションを識別します。顕微鏡に接続されているコンピュータにこの使用してイメージングソフトウェアを実行してください。
   注：ソフトウェアプログラムのトレース機能を介して位相コントラスト画像が取得され、筋肉全体の円周を測定します。これは、CSA、ならびに最小フェレット直径（粒子の反対側にある2つの平行な接線の間の最小距離として表現さ​​れる繊維断面サイズの測定）測定の両方が得られます。注：CSAと最小フェレット直径測定値がプラトーに開始すると、半ば腹に達しました。
6. 将来の染色のために-80℃でスライドをインベントリおよびアーカイブします。
   注：10月前staininに削除する必要はありません。G手順。スライドをカバーガラスをされると、彼らはすぐに染色される準備ができています。

4.染色

注：詳細なステップバイステップの手順は、製品データシートに記載されていますし、染色手順のために従うべきであるが、個人の最適化は、最適な染色を得るために必要とされ得ます。

1. メディアは（表を参照）の取付は、水と混和しないので、（70％、95％、および100％エタノールに2分間ずつ）アルコールの増加グレードを通してスライドを脱水し、キシレン（5分間、100％）を確保するためにそれらをクリアスライドは、時間をかけて不透明になることはありません。
2. セクションをカバースリップし、それらが乾燥してみましょう。イメージングソフトウェアを備えた顕微鏡を用いた画像。

結果

収穫および組織の凍結のためのセットアップを図1に見ることができる。切除した組織を乾燥する（ 図1A）を回避するために、PBSに浸したガーゼ上に格納されるべきです。組織を組織学的分析のために使用されるように選択される場合、それらは、OCT中に浸漬し、適切な向きでクライオモールド上に配置し、正確な形態（ 図1B）を確保することができるような生理学的長さに近いべきです。組織を凍結するのに適したイソペンタンのスラリーを液体窒素で冷却したイソペンタンを小さな白い析出物が下部に表示されるまで撹拌することにより達成することができます。この時点で、メディアが（ 図1C）を凍結するのに適しています。組織は、組織（ 図1D）のサイズ/厚さに応じて冷却したイソペンタン中で6-15秒から凍結されるべきです。凍結後、筋肉はそれを、その時点で白はドライアイス上に保存され、後に-80 <に転送する必要がありますチョークのように表示されます強い>℃の冷凍庫。

ディスカッション

組織学および免疫組織化学は、様々な神経筋障害で病状の症状および進行を理解する上で重要なツールとして使用されています。古典的には、筋肉生検は、最初のホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンワックスで包埋しました。ホルムアルデヒド固定は、組織構造を保持し、室温で組織保存および輸送を可能にするが、それはまた、正確な免疫染色​​を達成するためのさらなるステップを必要とする酵素架橋するタンパク質を不活性化します。この問題は、凍結切片を用いて除去されるが、この方法は、最適な染色結果と正確な解釈^14,15を得るためにユニークな技術的な課題を提示します。

第一に、自己分解と分解が身体から除去した後にすぐに開始するとサンプルは外科的切除直後に凍結することが必須です。組織はまた、サイズに応じて変化する時間の適切な量のために迅速かつ完全に凍結されなければなりません/組織の厚さ。これが正しく行われていない場合は、組織学的評価のために無駄な組織をレンダリング発生するダメージを凍結します。凍結後、組織を直ちにドライアイス上に保存されている必要があり、その後、切片までの超低温（-80℃）...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クライオスタット	ライカCM 1850	ライカマイクロシステムズ株式会社	バッファローグローブ、イリノイ州60089米国、オフィス電話1-800-248-0123 代替:リチャードアレンサイエンティフィック
顕微鏡	Nikon Eclipse 50i	コンインスツルメンツ株式会社	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 オルタナティブ: Olympus
画像解析ソフトウェア	ニコンイメージングソフトウェア 基礎研究	ニコンインスツルメンツ株式会社	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
イソフルラン	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923ウェストピオリアアベニュー、フェニックス、アリゾナ州85029アメリカ
10月	4583	さくら株式会社	トーレンス、CA 90501 U.S.A. 代替ソース:ライカマイクロシステム
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790メモリアル博士、ケンブリッジ、マサチューセッツ州02139 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィック
アセトン	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050スプルースストリート、セントルイス、ミズーリ州63103 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィ
ックエチルアルコール	HC-1300-1GL	サーモフィ	ッシャー790メモリアル博士、ケンブリッジ、マサチューセッツ州02139 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィック
2-メチルブタン	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR
Scientific Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific

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