エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

サマリー

動物モデルは、組織改変された移植片を評価するための重要なツールです。この論文では、前十字靭帯組織工学で使用するためのエレクトロスピニング生分解性ポリマーグラフトを調製するためのプロトコルと、ラットモデルに移植するための外科的プロトコルを示します。

要約

前十字靭帯(ACL)の断裂は一般的な靭帯損傷であり、ACLは介入なしではうまく治癒しないため、しばしば手術が必要になります。 現在の治療戦略には、自家移植片または同種移植片のいずれかによる靭帯再建が含まれますが、それぞれに限界があります。したがって、ACL再建に使用するための組織工学グラフトの設計に関心があります。ACL組織工学で使用するためのエレクトロスピニングポリマーグラフトの作製について説明します。このポリカプロラクトングラフトは、生体適合性、生分解性、多孔質であり、整列した繊維で構成されています。このような移植片の評価には動物モデルが必要であるため、この論文では、異種細胞を播種した移植片を含む人工移植片の評価に使用できるACL再構成の関節内胸腺ラットモデルについて説明します。術後 16 週間での代表的な組織学および生体力学的検査結果が示され、移植片は移植片が移植片を移植片としてすぐに検査し、対側ネイティブ ACL が対照として機能します。本研究は、組織改変されたACL移植片を評価するための再現可能な動物モデルを提供し、ACL破裂の治療に対する再生医療アプローチの可能性を示しています。

概要

前十字靱帯（ACL）の破裂は、膝¹の最も一般的な靱帯損傷の一つである。破裂したACLのは、外科的介入なしに治癒することができませんので、日常生活だけでなく、スポーツへの参加の活動には限界が毎年10億ドル³の推定コストで、毎年²手術を受けるために175000以上の患者をドライブ。現在、自家移植または同種移植腱のいずれかが靭帯再建のために使用されている。高い成功率は、自家移植および同種移植の交換の両方を達成することができるものの、深刻な合併症は、これらの再構成オプション⁴に関連している。自家移植片組織は、特に再破裂またはマルチ靭帯損傷の事例では、ドナー部位の病的状態と関連しており、供給が限られている。一方、同種移植組織は、遅延移植片統合、有害な炎症反応、理論的な感染のリスク、および限られたサップとリンクされているLY ^5。合成非分解性移植片は、1970年代と1980年代に開発されたが、時期尚早グラフト破裂、異物反応、骨溶解、及び滑膜炎⁶によって妨げられた。これらの深刻な懸念の結果として、米国での臨床使用のために利用可能な合成移植片はまだありません。

原因既存の移植オプションと、生物学、工学、再生医療における最近の進展にこれらの制限のために、ACL移植のための組織工学的ソリューションに大きな関心が集まっている。現在の組織工学戦略が永久合成材料注入⁷に関連する制限を回避しながら宿主組織の内部成長を可能にするために、生物分解性合成材料を用いる。

ポリカプロラクトン（PCL）は、FDAがuのあった^{8ドレッシング}癒着バリア、創傷などの医療用途の数、のために承認された生分解性ポリマーである血管、骨、軟骨、神経、皮膚、食道組織工学^5,9-16を含む多種多様な用途でのsed。良好な生体適合性、比較的長い生体内半減期は、十分な機械的強度、高弾性、組織工学におけるこのポリマーの普及に貢献する。創傷治癒のげっ歯類モデルにおいて、移植エレクトロスピンPCLは、非免疫原性であること、および副作用¹³ずに局所組織に統合することが示された。エレクトロPCLのSEM像を図1に示されている。

現在のFDAの規制基準では、小規模および大規模の両方の動物モデルにおける有効性と安全性は、PCLまたは米国での臨床試験に移行するために、他の設計のACL移植のために必要とされるであろう。さらに、in vivoでの条件は、多くの場合、in vitroでの組織工学のACLグラフトのプロパティを増大させることができます。屈筋digitorと自家ACL再建のラットモデルumの伸筋腱が以前ネイティブACLが切断された、説明したが、大腿骨と脛骨のトンネルを掘削し、移植片は、縫合糸^17〜22との代わりに渡され、固定した。本稿では、設計のACL置換の評価のためではなく、自家ベースの復興のために、このモデルの修正（ 図2）を説明します。

多くの動物モデルは、靱帯組織工学のために存在するが、ラットは、多くの理由のために、より大きなモデルに比べて有利である。これらの利点は、より簡単に飼育と取り扱い、より少ない倫理的配慮、そして低コスト^17,23が含まれ^ています。また、ラットモデルは、軟骨、腱、および骨組織工学²⁴を含む整形外科組織再生のためのモデルとして広く使用されている。具体的には、無胸腺ヌードラットを最終的な移植oを可能にする、細胞媒介性免疫応答²⁵の欠如に起因して選択したこのモデルにおけるfの異種ドナー細胞は、さらに、将来的に操作された移植片を強化する。このメソッドの論文では、ACL再建の無胸腺ラットモデルにおける製造および無細胞の外科的移植、生分解性ポリマーのグラフトを記述する。

プロトコル

注：すべての動物の手術は、実験を開始する前に、地元の獣医スタッフと動物使用委員会によって承認された。

エレクトロポリカプロラクトン足場の調製

1. 医療グレードのエステルを秤量し、溶解PCLポリマーの溶液を10％w / wを作成する1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで顆粒状にポリ（εカプロラクトン）を終了する。均質な溶液を確保するために、少なくとも3時間、攪拌プレートを用いて溶液攪拌をしましょう​​。
2. 足場の製作のための高度に整列PCL繊維のカフを作成するためにPCLソリューションをエレクトロスピニング。
   1. すべての回でのファンとの化学ドラフト内でエレクトロスピニングセットアップを準備します。これは、エレクトロスピニングプロセスの単離された真空媒体として機能する大型アクリルボックスで構成され、電圧源により駆動源のPCL溶液を、モーター駆動の収集マンドレル、及び真空ポートのエントリポイントを有している。 acryliを清掃してください完全にエタノールでCボックスとエレクトロ製品の品質を損なう可能性のある不純物を除去するためにパラフィルムシートのすべての表面を覆う。
   2. 負荷を約3ミリリットル18 G、1 1/2インチの針を平滑末端で10mlシリンジに上記溶液の。注射器を上に押して、すべての気泡を除去。プログラム可能なシリンジポンプにソリューションをロックします。電圧源線の取り付けのためのアクリルボックスの外側針の1/2インチを約残しながらアクリルボックスに小さな穴を通して針を挿入します。
   3. 高度に整列PCL繊維のための集電体としての旋盤マンドレルを回転さ30ミリメートルを使用します。アルミ箔の薄いストリップでしっかりとマンドレルをカバーしています。約15cm離れた注射針からボックスの反対側のモーターにマンドレルをロックします。
   4. 真空ポートにプラスチック製のホースを挿入し、ヒュームフードの真空源に接続します。真空源をオンにして、蓋付きのアクリルボックスをカバーしています。
   5. Sら2.5ミリリットル/時プログラム可能なシリンジポンプの注入速度。 3,450 rpmでマンドレルを動作させるためにモーターの電源を入れ、ワニ口クリップを使用して、箱の外側針の先端に電圧源の正極リードを添付してください。
   6. PCL溶​​液の注入が開始されると、電源をオンにし、20kVの動作電圧に設定する。
   7. PCL溶​​液0.5mlから均質なカフを作成するために12分間この溶液を注入する。
      注：平均して、それぞれのカフは、3~4層の足場の合計を作成するために使用できる2つの6ストリップシートを作成するのに十分な電界紡糸材料を有する。
3. レーザーは、低真空の設定、10.0 keVの着陸電圧、6.4ミリメートル作動距離、および3.0のプローブ径で運転VersaLaserカッター2.3上の複数の小さなシートを形成するPCLカフをカット。
   注：この例では、コンピュータ支援設計が1.5mmの複数のシートを得るために、カッターを指示するために使用された×35ミリメートル×150ミクロンと足場均等に15％の孔面積で150μmの直径の穴を配布した。
4. プラズマは、イオン加速をPCL表面の親水性を誘導するためにプラズマクリーナーを使用して、PCL足場をエッチングする。 450トルに真空を設定し、ハイパワー（29.6 W）で30秒間足場を扱う。
5. 無菌環境での70％エタノール中で足場を浸し。
6. コートコラーゲンとの個々の足場は、in vivoでの細胞接着および増殖を促進する。
   1. 4℃での1×PBS中で9：1のPurecolコラーゲン3 mg / mlの標準溶液、10×PBS、2.5滅菌溶液と0.1 N NaOHで1：8に希釈することによって、コラーゲンコーティング溶液を作成する。溶液の均一性を確保するために十分に混合する。
   2. コー​​ト個々1.5ミリメートル×35ミリメートル×上記のコラーゲン溶液の薄層フィルムと150μmの足場。無菌環境下で24時間乾燥することができます。
7. 5-0ビクリル縫合糸を使用して、スタックおよび4つの個々の1.5ミリメートル×35ミリメートル×150μmの足場を固定Krackowは、移植の準備ができている最終的な厚さ0.6mm、多層、コラーゲンコーティングされた足場を作成するためにステッチ使用。

2.ラット手術プロトコル

1. 吸入チャンバーにラットを配置し、2リットル/分の酸素と2％のイソフルランを送達することにより麻酔を誘導する。確認してラットが十分に足を後肢に圧力をかけ、あらゆる応答を評価することにより麻酔している。
2. 非滅菌バックテーブルの上には、皮下に25mg / kgのアンピシリン及び0.03 mg / kgをブプレノルフィンを注入する。
3. 目に眼軟膏を適用します。手術後肢から毛皮をクリップし、3クロルヘキシジンの交互のスクラブと70％エタノールで手術部位を分取
4. 低体温症を防ぐために加熱されたパッドの上に、手術台にラットを転送します。セキュアなノーズコーン、および2リットル/分の酸素の2％イソフルランで手続きを麻酔を維持は、ノーズコーンを提供しました。露出された作動肢を残して、無菌状態でドレープ。
5. 手術を開始する前に、最初の足圧を後肢への応答の欠如によって十分な麻酔を確認。
6. 膝蓋骨のレベルを中心と膝に2cmの長さの垂直切開内側を、確認します。切開が膝の上にセンタリングされるまで横方向に皮膚を撤回。
7. ちょうど膝蓋骨に外側から内側に切断し、大腿四頭筋の筋腱接合部のレベルに遠位脛骨結節に膝蓋腱挿入のレベルに近位に拡張することで、内側傍関節切開を作るためにメスを使用してください。膝蓋骨や大腿四頭筋の腱をカットしないように注意してください。
8. 膝蓋腱のすぐ横膝カプセルを通じて1センチメートル垂直切開することにより横方向にリリース膝蓋骨。
9. 膝が延長されることを確認してください。細かいハサミを取り、横方向から内側に膝蓋骨の下を通過。伸筋機構はどちらの側に変換することができるようにハサミを数回を広げた。
10. トンを曲げながら彼の膝、膝関節の内部を露出させるために横方向に膝蓋骨を翻訳。顆間ノッチと大腿骨顆の明確な可視化を確認してください。メスを用いて、ノッチにACLとPCLを横断する。
11. 1.6ミリメートルのKワイヤと負荷電力ドリル。顆間でACL原点にKワイヤ先端を置きます。 superolaterallyドリルとメスで、必要に応じて、任意の軟組織を除去し、大腿骨の外側面に出口点を視覚化。移植のための明確なの通路を確保するために数回内外Kワイヤを渡します。
12. 脛骨プラトー上のACLフットプリント上のKワイヤを配置します。前外側ドリルと前外側脛骨近位端上の出口点を視覚化。 Kワイヤが脛骨を出るポイントが完全に可視化されるように、必要に応じて、軟組織をクリアするためにメスを使用してください。
13. 大腿骨のトンネルを通って（理想的にはこれ以上の2よりインチ長）を短縮キース針を渡します。 Kの目を通して移植片の一端から二縫合糸末端を通すeith針。大腿骨トンネルを通じて移植片の一端を引っ張って針を使用してください。
14. 脛骨トンネルを通って移植片のもう一方の端を渡す前に、手順を繰り返します。
15. 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の大腿骨の端を固定する4-0ビクリル縫合糸を使用してください。手動張力拡張子で膝移植片。 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の脛骨の端を固定します。
16. 8の字ステッチ過去両端に1〜2ミリメートルを残して、両端の余分な移植片を切断するはさみを使用してください。
17. 膝を拡張し、膝蓋骨を減らす。 4-0ビクリルを使用して、膝蓋骨の横方向の亜脱臼を防止、内側関節包を閉じるには、シングル8の字ステッチを配置。
18. 下の筋肉を縫合や皮膚がクローズされると、目に見える縫合糸を持ってさせないように注意しながら、実行中の表皮下5-0モノクリルまたはビクリル縫合糸で皮膚を閉じます。
19. 麟蹄皮下にブプレノルフィンとCTラット術後3日間の合計ごとに12時間。注入時の任意の排水や縫合不全のために手術部位を確認してください。跛行といくつかの腫れ、手術後の最初の数日で正常であるが、速やかに獣医スタッフと一緒にすべての術後の懸念に対処する。外科的切開が完全に治癒したとき動物は、術後2週間後に社会住宅に戻ることができる。

3.データ収集プロトコル

1. 屠殺時に、開胸続いクローズCO ₂チャンバー内で個別にラットを窒息させる。
2. 股関節で分離することにより、外科的に再構築され、反対側の手足の両方を収穫。
   1. 再構成された手足のために、外科的に後十字靭帯および残骸を含むすべての軟組織を除去するだけで、大腿骨、脛骨、および移植片を分離するために微細な切開により、天然のACLを破壊した。
   <李は>対側肢の場合は、ネイティブACLだけでなく、細かい解剖による大腿骨と脛骨を除くすべての軟組織を取り除く。
   2. 大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体の各端部から骨から1cmに¾が、すべてを削除するには、そのようなドレメルなどの回転工具を使用してください。
   3. このプロセスの間、および生体力学的試験を通して、定期的かつ頻繁には誤った結果を変更することが収穫膝の乾燥を防ぐために、生理食塩水で靱帯領域をスプレー。
3. 組織学的分析のために、48時間、25℃で4％パラホルムアルデヒド溶液中で個別に膝を固定する。次に、完全な脱灰用Immunocal試薬の溶液中で膝を沈める。このプロセスは、サンプルの石灰の内容に依存しており、5日ほどかかる場合があります。サンプルの品質を下げることができ、不完全な脱灰などの進捗状況を評価するために毎日の個々のサンプルを確認してください。切片を実行、完了したら、必要に応じて取り付け、及び染色スライドさせます。
4. Perfor組織工学靱帯の機能的能力を評価するための生体力学的試験をメートル。
   1. 個別に各骨の骨端の周りに28 G亜鉛めっき鋼線を包むことにより、大腿骨と脛骨を固定します。これは骨ではなく、興味のある靭帯でサンプルの早期引張障害から不正確な生体力学的試験データを防ぐためです。
   2. ポットメタクリレート（PMMA）骨セメントの混合物中に大腿骨。これを行うには、2セメント成分を混合し、すぐに完全に自由に突出した骨端及び添付靱帯との接合鍋に骨の骨幹を包む、金属中に大腿骨を固定するために、粘性混合物を使用しています。徐々に締まりのない物質に、最終的には、固体硬化マトリックス中に混合粘性のコンポーネントを変換するための自​​発的なフリーラジカル重合を許可します。
      注：このプロセスは数分かかり、手作業で作らボーラスの温度を評価することによってモニターすることができる残りのセメント。温度は一過発熱重合反応の間に増加し、材料が固化した後、室温に治まる必要があります。
   3. 理想的な機械的試験のために20°屈曲時に膝の靭帯を維持しながら除き、脛骨を接合するため、上記と同じプロセスを繰り返します。
   4. 引張試験装置の上に接合、大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体をマウントして、障害に張力の開始からの時間の関数としての負荷及び変位を記録するために準備する。この例では、1 kNのロードセルをインストロンモデル5564を使用した。
   5. プリテンションが0.5N /分のランプ速度にて2 Nに移植した後は、0.5mm /秒の歪速度での故障までの移植片をテスト。プロセスの間、靱帯半ば物質で失敗していることと、骨の大腿骨と脛骨が安全であることと早まって不正確にテストさ靱帯の生体力学的特性を評価することができるもの、失敗しないことを確認してください。
   6. 生成された荷重 - 変位を使用してください試験された靱帯の破壊荷重および剛性を計算する曲線。

結果

シングル外科医による92ラットの手術の我々の経験では、切開から傷の完了までの平均手術時間は4.7分の標準偏差は、16.9分であった。屠殺時に、ラットは356±23グラムの重さであった。すべてのラットはよく手術を許容し、合併症を経験していない。すぐに手術後、ラットを手術四肢に体重を支えることが認めたが、わずかにぐったりを示した。手術後1週間では、すべてのラットはありませんかなりのぐったりとambulatingた。動物はすべての給餌、排尿、または排便習慣の無い観測された異常に、研究の過程で着実に体重が増加した。臨床的には、肉眼創傷裂開、紅斑、腫脹、滲出液、または排水は術後認められなかった。

前述した92ラット手術は、このメソッドの原稿を目的として、主に行われていなかった。むしろ、様々な操作された移植片の状態を試験するために使用した。 detaileながらD機械的試験および組織学的結果は、本論文の範囲外で、より多くの詳細はレオンら ²⁶の論文に記載されています。簡潔には、再構成に続く16週目に、区分された膝関節の組織学的分析は、足場マトリクスは、主...

ディスカッション

ACL損傷は現時点での再構築のための限られた選択肢で、整形外科スポーツ手術に共通する条件である。 インビボでの再生を可能にするACLのための適切な組織工学代替を開発するために、適切な動物モデルが必要である。無胸腺ラットにACL再建の再現可能なモデルを使用して、in vivoでの移植のように、本 ​​研究では、生分解性の操作された移植片の製造は、記載されている。このモデルは、細胞の移植片との法人成長因子を有するものを含む種々の生体材料からなる別の組織工学的ACL移植片を評価するために利用することができる。

この特定の研究では、無細胞、整列した繊維とエレクトロポリカプロラクトン移植片をテストしました。組織工学靱帯再建の以前の研究では、編組または絹を含む様々な材料で作られた押出成形移植片、PLLA、およびポリウレタン^27-29に移植^している。これらの物質はいずれも、ACL ⁷の機械的性質のグラフトと要約統合の成功の両方をもたらしていない。多くのポリマーは、靭帯再建に使用するための可能性...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
医療グレードのエステル末端ポリ(ε-カプロラクトン）、顆粒状（分子量 = 110,000）	Lactel吸収性ポリマー		目的の分子量に合わせてカスタム合成されたポリマー
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール	Sigma-Aldrich	105228	PCLポリマー用溶媒
18G x 1½ベベル針	BD Medical	305196
遠隔注入・回収プログラム可能シリンジポンプ	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 レーザー彫刻機	Microgeo USA	VLS2.30
拡張型プラズマクリーナー 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	表面修飾のためのコラーゲンコーティング直前のプラズマエッチング
PureCol コラーゲン標準溶液、3 mg/ml	高度バイオマトリックス	5015-A	PureCol、10x PBS、0.1 M NaClを8:1:2.5の比率で混合する。 1x PBS中N NaOH (1:9)
縫合糸、5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
縫合糸、4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
鋭視解剖鋏（直線型; 4.5インチ） インチ)	Fisher Scientific	8940
塩酸ブプレノルフィン	Sigma-Aldrich	B9275	疼痛管理のため、術中および術後の両方で0.03 mg/kgを使用してください。
アンピシリン注射液	Henry Schein	1185678	処置中に25 mg/kgを皮下投与します。
K-ワイヤー、1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
キース針、ストレート 1½"	Delasco皮膚科学研究室 & 供給	KE-112
Immunocal 脱灰液	Fisher Scientific	NC9491030
Opticrylアクリル樹脂骨セメント（PMMA）（モノマーおよびポリマー）	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 引張試験機	Instron	5564	同等の性能を持つ任意の引張試験機が使用可能です。