反応性神経膠症のトリガ<em&gt;インビボ</em&gt;前脳刺し損傷によって

サマリー

この記事では、成体マウスで前脳刺し傷を引き起こすための詳細なプロトコルについて説明しています。刺し傷は、重度の反応性神経膠症とグリア瘢痕形成を誘発し、その後、標準的な免疫組織化学法で検査することができます。

要約

中枢神経系の損傷後、アストロサイトは広範囲の生化学的、形態学的、分子的変化を経験します。これらは総称して反応性アストログリオーシスと呼ばれます。反応性アストロサイトは、炎症作用と防御作用の両方を発揮し、それぞれ神経修復を阻害および促進します。反応性アストリオーシスの多様な機能特性の根底にあるメカニズムはよく理解されていません。これらのメカニズムをより深く理解することは、損傷した中枢神経系を治療するための治療戦略を開発するために重要です。ここでは、前脳刺し傷病変を用いて成体マウスの前脳に反応性星膠症を誘発する方法を実演します。この病変モデルはシンプルで信頼性が高く、脳定位固定装置とメスの刃だけで損傷を生じます。前脳の損傷モデルとしての刺し傷病変の使用は十分に確立されており、ニューロンの変性、神経炎症、血液脳関門(BBB)の破壊など、幅広い神経病理学的結果に対処する研究に適しています。したがって、前脳刺傷モデルは、外傷に対するCNSの反応に関する幅広い研究に適用できる強力なツールとして機能します。

概要

負傷した中枢神経系を治療するための成功した治療法を開発するための主要な課題は、トラウマによって引き起こされる複雑な多細胞事象の不完全な理解です。反応性アストロサイトは、新しい治療法の有望な標的としてますます認識されています¹。歴史的には神経修復に敵対的であると考えられてきたが、反応性アストロサイトは、現在では、炎症過程の減弱や二次損傷や神経変性の制限など、複雑で多細胞的な神経保護反応の重要な構成要素として認識されている^2-6。反応性神経膠症の神経病理学的特徴は長い間明確に定義されてきましたが、反応性神経膠症を調節する細胞および分子メカニズム、およびさまざまな下流の結果は、まだ十分に理解されていません。反応性神経膠症を引き起こすメカニズムと、それに続く細胞および分子イベントを理解することは、反応性神経膠症の神経保護特性を促進し、有害な影響を弱めることを目指す戦略を開発するための重要なステップです。

ここでは、刺し傷を使用して成体マウスの前脳に重度の反応性星膠症を誘発する方法を実演します。制御皮質衝撃(CCI)や体液打楽器損傷(FPI)などの他の外傷性脳損傷(TBI)モデルが損傷を引き起こすために特殊な機器を必要とするのとは対照的に、前脳刺し傷は頭部を安定させるための定位固定装置とNo.11メスブレードのみを必要とします。したがって、前脳刺し傷モデルでは、FPIまたはCCI損傷の作成に必要な特殊なデバイスにアクセスできない幅広い検査室で、より広くアクセス可能です。ここで説明する方法により、研究者は信頼性と再現性を持って堅牢な神経膠症応答をトリガーし、その後の細胞および分子イベントを調査できます。手術から回復すると、前脳刺し傷を負った動物は、専門的な治療を必要とせずに長期間生存することができ、急性、中期、または慢性の研究のためにコロニーに戻すことができます。TBIのFPIモデルやCCIモデルよりも臨床的に翻訳しにくいですが、刺し傷によって生じる前脳病変は、反応性神経膠症や中枢神経系への外傷後の他の神経病理学的事象の根底にある基本的な生物学的メカニズムを調査するための単純でありながら有用な実験モデルとして機能します。

プロトコル

混合C57BL / 6バックグラウンド上の成体（3-4ヶ月齢）雄マウスは、このプロトコルで使用しました。動物は、12時間の明/暗サイクルで維持し、食物および水に自由にアクセスさせました。このプロトコルで実行されるすべての手順は、ドレクセル大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行いました。

1.手術領域の準備

1. 吸収パッドで全体の外科ベンチをカバーし、定位に隣接する手術器具を配置し、その後、70％エタノールで手術台を消毒。
2. マニピュレータアームなし定位装置を設定します。定位の加熱パッドを配置し、37℃に設定してください。動物と加熱パッドとの間のペーパータオルの小片または外科パッドを配置することによって、動物の過熱を防ぎます。
3. オートクレーブはさみを使用して、REAまで0.9％滅菌生理食塩水を含む滅菌ペトリ皿にオートクレーブゲルフォームの小片をカット使用するためにDY。
   注意：オートクレーブ処理機器および無菌手術用消耗品を使用して滅菌作業環境を維持します。必要に応じて、10〜15秒間ビーズ滅菌器に浸漬することにより、動物の間で処置中または手術器具を再滅菌します。消毒するために、必要に応じて、70％エタノールで手を擦ることによって作業中は清潔な手袋を維持します。

外科2.プレッピングマウス

1. ホームケージからマウスを削除し、（g）を量ります。
2. 場所イソフルラン誘導チャンバ内にマウスや麻酔の外科的平面、約3〜5分を誘導するために2〜5 L /分およびイソフルラン気化器に酸素を設定します。緩徐呼吸や固定化のために監視します。マウスが完全につま先ピンチ反射を使用して鎮静されていることを確認してください。
3. マウスが完全に鎮静されると、イソフルランにチューブが取り付けられているノーズコーンに鼻を確保、定位フレームに配置します。外耳道に耳棒を挿入し、締め、頭が安定して確保します。
4. 耳にし、目の間から耳の後ろに耳から頭を剃ります。
5. 、イソプロピルアルコール及びベタジンヨウ素溶液のワイプを交互に3回ずつ肌を殺菌。
6. 外科手術中に乾燥からそれらを防ぐために、両眼に人工涙液を適用します。

3.手術手順

1. つま先や尾をつまんで麻酔深度を監視します。応答がないとき、マウスは、適切な外科的な平面であり、呼吸がゆっくりとさえあります。
2. ちょうどほぼ11番手術用メスの刃を使用して、単一の、しっかりした動きで耳の間に、目の後ろから矢状皮膚切開を行います。脇の皮膚を移動し、止血剤で右側をクリップ。
3. 11番メスと綿の鈍い側を使用して、上層膜の明確な頭蓋骨は、アプリケーターをひっくり返しました。必要に応じて、0.9％の食塩水に浸した綿先端のアプリケーターで頭蓋骨を拭きます。完全に乾燥することができます。
4. 米国小さ ​​な定規をる、1ミリメートルの冠状縫合の尾、および恒久的なマーカーと矢状縫合（ 図1）に対して横1ミリメートル、で開頭の左端に開頭術の前縁をマーク。そして、矢状および冠状縫合、それぞれ（ 図1）から4ミリメートルで開頭術の権利と尾側の境界をマークします。
5. 0.5ミリメートルドリルビットを使用して、恒久的なマーカーアウトライン次ゆっくり穿孔することによって開頭を作るために開始します。完全に頭蓋骨を突破しないように注意してください。を押して、優しく第5鉗子で頭頂骨の孤立片に、弱さの領域は、圧力に道を譲るだろう。薄くなった骨が周囲全体に十分に弱い場合、骨片を除去するための準備ができています。
   注：調査員が困難一体に骨を除去するが発生した場合、これは、骨が十分に掘削時に間引かれなかったことを示唆しています。 facilita以降の動物で、さらに頭蓋骨をドリル考えてみましょう骨片を容易に除去するTE。
6. 23 G針を装着した10mlシリンジを用いて、単離された骨と掘削面積を浸して0.9％生理食塩水を少量を適用します。
7. 定位機器にマニピュレータアームを取り付けます。吻方面した刃の鋭い側とプローブホルダに新しい11番手術用メスの刃を取り付けます。
   注：吻側および尾側の組織が刃の鋭く尖っていないエッジを経験しているが、それぞれ、貫通損傷によって誘発される機械的な損傷は、病変の程度全体に匹敵します。私たちは、頭側と尾部の間、GFAP発現または増殖のアップレギュレーションを含む反応性神経膠症の主な機能にはかなりの違いを観察していません。
8. 邪魔にならないようにマニピュレータアームを保ち、慎重5/45角度のついたピンセットを用いて、単離された骨を持ち上げます。 FUL 1に残さ骨の一部をやってのけるレバレッジを使用して、孤立した骨やリフトの側面に鉗子の先端部を挿入Lの動き。
   注：脳を刺すか、頭蓋骨の下に硬膜を乱さないように注意してください。
9. 浸した吸収性ゲルフォームの小片を取り、乾燥からそれを防止し、存在する可能性のある血液を吸収するために覆われていない脳に置きます。
10. ゲルフォームが適所に配置されると、所定の位置にマニピュレータアームを揺動し、ゲルフォーム上に開頭の中央にブレードを調整します。ゲルフォームを取り外し、先端が硬膜を穿刺せずに硬膜に接触​​するまで、ブレードを下げます。定位の垂直アームのバーニアスケールを使用してマーク背/腹座標。
11. マニピュレータアームを使用して、ゆっくりと脳にブレード正確に3ミリメートルを下げます。これは、マニピュレータアームにバーニヤ目盛りを使用することによって達成されます。ブレードは5〜10秒のための場所に滞在することができます。ブレードはopposiに移動する前に、開頭の吻側および尾側の境界に到達することを可能にする3回尾側するブレード取付吻側に定位アームを移動TE終了。
    注：硬膜は、ブレードを挿入する前に除去されていません。厚さ^7〜80μmであるラットの硬膜とは対照的に、マウスの硬膜がかなり薄くなっている（わずか数細胞層の厚さ）、挿入時のメスの刃にかなりの抵抗を生成しません。各動物が一貫性の損傷を受けることを確実にするために、各マウスのための新しい手術用メスの刃を使用してください。
12. ゆっくりと脳からブレードを取り外し、定位アームを持ち上げます。ブレードを除去した後、すぐに余分な血液や体液を吸収するために、脳の表面にゲルフォームの別の部分を配置します。
13. 一方、定位アームを取り外し、11番手術用メスの刃を処分。出血が停止した後、ゲルフォームを削除します。
14. このようなethilonまたはプロレンとして、非吸収性縫合糸で皮膚を縫合することによって傷を閉じます。縫合糸は、手術後9-10日に削除する必要があります。
15. そのホームケージにマウスを返し、マウスがheatinにゆっくりと回復することができます苦痛の兆候がないかのGパッドとモニター。イソフルラン誘発性の麻酔からの回復は、典型的には、イソフルランから除去した後、2〜5分以内に発生します。それは胸骨recumbancyを取り戻したまで無人動物を放置しないでください。
16. 水和を確実にするために乳酸リンゲル液の皮下0.5〜1 mlで管理します。

4.手術後のケア

1. 密接植民地に戻る前に麻酔から回復するまで、手術後の動物を監視します。
   1. 、術後の痛みや不快感を軽減直ちに手順に従って、腹腔内注射により0.05〜0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンを投与すること。
   2. このような制限された運動、グルーミングの欠如、または体重減少などの苦痛の重症徴候について術後2〜3日間動物を観察します。苦痛のこれらの兆候のいずれかを実証する動物を安楽死させると研究から取り外します。
2. 損傷組織の病理組織学的検査を検討するために、スタンにより動物を安楽死させます準の心臓内灌流。
   1. 簡単に述べると、ケタミン/キシラジンの過剰摂取で動物を麻酔し、心臓内の0.9％NaCl 15〜20ミリリットルで灌流、または肝臓、実験の終了時に4％パラホルムアルデヒドの60ミリリットル、続いて血液のクリアされるまで。
3. 30％ショ糖溶液に移す前に、4％パラホルムアルデヒド中で2〜4時間、脳とポストフィックスを分析。セクション40〜60ミクロンで、クライオスタットの脳、および標準的な組織学的または免疫組織化学的手順による処理、またはガルシア^8,9に記載されているように。

結果

この処置を受けた動物は、専門的な術後のケアを必要としないので、短期または長期の時間の生存期間は容易に損傷後の急性または慢性の病状を調査する必要性に応じて、試験に組み込まれています。このようなソーマのGFAPおよび肥大のアップレギュレーションのような反応性神経膠症の主要な特徴は、早ければ、損傷後2〜3日のように観察することができます。反応性星状細胞のための増殖のピーク位相は、傷害¹⁰次の日3-5中です。以下に示す代表的な結果は7日早く刺し傷病変を受けた動物からのものです。

前脳刺し損傷後の前脳の一般的な形態および細胞構築はニッスル染色（ 図2）によって可視化することができます。ブレードトラックが病変の中心を通して最も顕著であるが、破壊された皮質細胞構築は、損傷を受けたTの吻側および尾側の程度を明らかに問題。反応性星状細胞は、GFAP（ 図3）のために免疫組織化学によって観察することができます。多くの皮質星状細胞は、傷害の非存在下でのGFAPの免疫組織化学的に検出可能なレベルを示さないことに注意し...

ディスカッション

それは、頭蓋骨や、基礎となる硬膜を掘削中に損傷していないことが重要です。頭蓋骨がパンクされていないことを確認するために掘削しながら、軽い圧力を使用してください。硬膜が骨にリフトオフされていないことを確認するために頭蓋骨片を持ち上げながら加えて、注意が必要です。

前脳刺し損傷はこちらCNSへの浸透傷害モデルを説明しました。このようなFPIやCCIなどTBIモデルよりも少ない臨床的に翻訳可能なものの、前脳刺し病変モデルは、様々な生化学を調査することを目的とした研究、携帯電話、または個別のCNS傷害によってトリガー分子事象の広い範囲のための有用なツールとして機能します。認知障害は、3週間の両側性スタブ¹¹損傷後、ラットで報告されているが、片側刺し病変モデルことに留意すべきである、ここに記載されるように、損傷に対する細胞応答に対処する研究に最適です。このような再などの様々な神経病理学的プロセスの基本的な側面、アクティブグリオーシスおよび瘢痕形成が容易に観察され、研究され得ます。拡散し広範囲の神経病理を生成FPIまたはCCI、ローカライズされたグリア活性化および病理学と...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
高速マイクロドリル	ハーバードApparatus	724950
ステンレス鋼メスブレード、#11	MedVet	JOR581S
5/45角度付き鉗子	ファインサイエンスツール	11251-35
フォームスポンジ12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	ダコ	Z033429-2	希釈 - 1:20,000 (明視野); 1:1,000 (蛍光)
Shp anti-BrdU		Abcam ab1893	希釈 - 1:20,000 (明視野); 1:500 (蛍光)
ビオチン化ヤギ抗ウサギ	Vector Laboratories	BA-1000	希釈 - 1:400(明視野)
ビオチン化ウサギ抗羊	Vector Laboratories	BA-6000	希釈 - 1:400 (明視野)
Alexafluor 488 ヤギ抗ウサギ	Life Technologies	A-11008	希釈 - 1:400 (明視野)
Alexafluor 568 ロバ抗羊	Life Technologies	A-21099	希釈 - 1:1,000 (蛍光)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	希釈率 - 1:1,000 (蛍光)
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042-10G	希釈率 - 1% (明視野)

ゲル