16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

サマリー

ここでは、DIG標識された16S rRNA標的DNAプローブを使用して、パラフィン包埋組織内の細菌を局在化する方法が説明されています。このプロトコルは、歯周炎、癌、炎症性免疫疾患などのさまざまな疾患における細菌の役割を研究するために適用できます。

要約

歯周炎患者の歯肉生検におけるポケット上皮およびその下の結合組織内の細菌の存在は、電子顕微鏡法、細菌特異的抗体を用いた免疫組織化学または免疫蛍光法、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）など、さまざまな方法を用いて報告されています。それにもかかわらず、これらの方法は技術的な制限や困難のために広く使用されていません。ここでは、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内に細菌を局在化する方法を紹介しました。パラフィン包埋組織は、病理学バンクから入手できる最も一般的な生検組織です。細菌は、種特異的または普遍的な方法で検出できます。細菌のシグナルは、細菌の離散型(球菌、桿体、紡錘状、毛状)または分散型として検出されます。この技術により、上皮、結合組織、炎症性浸潤物、血管など、他の組織学的情報を取得することができます。この方法は、歯周炎、癌、炎症性免疫疾患などのさまざまな疾患における細菌の役割を研究するために使用できます。

概要

細菌は、歯周炎、歯髄炎、歯冠周囲炎、蜂巣炎、骨髄炎などの様々な口腔疾患の病因における役割を果たしています。疾患の病因における細菌の役割を理解し、治療の効果を監視するために、組織内の細菌の局在化は重要です。歯周炎患者からの歯肉組織内の細菌の存在は、蛍光-を用いたin situハイブリダイゼーション ^（FISH）8 の細菌に特異的な抗体^3-7、および蛍光を用いて、電子顕微鏡^1,2を含む様々な方法を用いて、免疫組織化学および免疫蛍光が示されています16S rRNAのをターゲットに標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。それにもかかわらず、これらの方法は広く、技術的制限または困難に使用されていません。抗体と比較して、16SのrRNAを標的とするプローブを生成し、種特異性を達成することは容易です。 FISHはBACTの可視化のための優れたツールであることが証明されましたこのようなプラークバイオフィルムとしての自然環境でERIA。しかし、組織サンプルのFISHの適用は、様々な組織成分の自己蛍光に限定されます。彼らは^9出血含むとき、例えば、赤血球の強い自己蛍光は、しばしば、炎症組織への蛍光技術の適用を妨げます。

炎症を起こした歯肉組織内の細菌を局在化するためには、従って、ジゴキシゲニン（DIG）を用いたin situハイブリダイゼーション法での DNAプローブの開発に成功^10,11に適用された標識。 Pを使用してパラフィン包埋組織内の細菌の局在化のためここでは詳細なプロトコールジンジバリス特異的およびユニバーサル真正細菌プローブが記載されています。同様の結果は、他の研究室で再現することができるように、これは、特に方法の標準化に焦点を当てています。このプロトコルは、その組織学的コンテキストとRESU内細菌の局在化を可能にしますLTSは非常に再現性があります。説明されたプロトコルのいずれかの様々な組織における種特異的または普遍方法で細菌をローカライズするために使用することができます。ユニバーサルプローブは、多菌性疾患中の細菌を検出すると、特定の細菌の役割は知られていない疾患における細菌の潜在的な役割を研究するために特に有用です。

プロトコル

1.プローブの準備

1. プローブのPCR増幅
   1. Pのジンジバリス特異的プローブは、Pの343 bpのDNA断片を増幅しますPのゲノムDNAを用いたPCRによるジンジバリスの16SrRNA ジンジバリスと以下のプライマー：5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'および5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' ^10。 72℃で^10,11で5分間の延長が続く1分20秒、30秒、30秒、95℃で35サイクル、60℃、72℃以下のサイクル条件で増幅を行います。
   2. 70-bpのDNA断片（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGを使用して、真正細菌のプローブを増幅
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 'オリゴヌクレオチドおよび以下のプライマーとして合成さ）：5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ^'11および5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3。 40サイクル：次のサイクル条件で増幅を行います30秒30秒9、4℃、60℃、1分間^72℃11,12で5分間の延長に続く20秒間の72℃で。
   3. 2時間-20℃でインキュベートし、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と（：1：2の比率10で）100％エタノールを添加することにより、PCR産物（≥500μl）を沈殿させます。
   4. 遠心分離機15分間14,000×gで混合物を、100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、260 nmでの光学濃度によりDNA濃度を測定します。
2. DIG DNA標識および検出キットを用いてDIGは、標識
   1. 15μlの最終容量まで水でプローブの3μgのを混ぜます。
   2. 10分間95℃でDNAを変性し、すばやく氷上で冷やします。
   3. 変性DNAの15μlに10倍のヘキサヌクレオチドミックス2μlの、のdNTP標識ミックス2μlの、およびクレノウ酵素の1μlを添加します。
   4. 混合し、48時間に24時間、37℃でインキュベートし、65℃で加熱することによって反応を停止させます。
3. DIG DNA標識および検出キットを用いてDIG標識プローブの感度を確認し
   1. 手動で室温で5分間、キットに提供ポジティブコントロールプローブの連続希釈液を1μl、ナイロン膜上のDIG標識プローブ1ngの、乾燥をロードします。
   2. 簡潔には2×SSC緩衝液（0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）中の膜を浸漬し、DNAを固定化するために1時間80℃で膜をインキュベートします。
   3. 提供ブロッキング溶液6mlに：簡単に言うとマレイン酸バッファー（MAB、0.1 Mマレイン酸、0.15 MのNaCl、pH7.5）で、膜を浸して、抗DIGアルカリホスファターゼ（AP）でインキュベートする抗体希釈（5000 1）抱合30分間、室温でキット中。
   4. MABT（MABを1％Tween 20を含む）を有する膜を洗浄し、上に2ミリリットルの検出緩衝液（0.1 Mトリス塩酸、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl _2、pHは9.5）と混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用1分間の膜。標識プローブの感度がある場合1.1.3から1.3.4へのステップを繰り返し、満足しません。
   5. 標識プローブ（OD260）のDNA濃度を測定し、μlのngの100の濃度に調整^-1。
4. DIG標識プローブの特異性を確認してください
   1. 10分間95℃で、特異的プローブによって標的細菌を含む様々な細菌種からのゲノムDNA試料（25ngの^3μL-1各サンプルあたり）を変性させ、すぐに氷上で冷やします。
   2. 手動で室温で20分間、変性ナイロン膜上のDNAと乾燥をロードします。
   3. 簡単に言うと2×SSC緩衝液中で膜を浸して、DNAを固定化するために80℃で2時間、膜をインキュベートします。
   4. 1時間室温でブロッキング溶液で膜をブロックします。
   5. 、ハイブリダイゼーション緩衝液中で^-1μlのngの1でプローブを希釈し希釈したプローブを変性させ、膜上に適用されます。
   6. 1時間45℃で膜をインキュベートします。
   7. メンブレンを洗浄32×SSC緩衝液で倍。
   8. 簡単に言うとMABに膜を浸します。
   9. 室温で1時間ブロッキング溶液6mlに：（2000 1）希釈した抗DIG APコンジュゲート抗体とインキュベートします。
   10. MABTでメンブレンを洗浄し、2ミリリットルの検出緩衝液を混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用します。
   11. プローブが予想特異性を達成していない場合の特異性が観察されるまで、ハイブリダイゼーション温度を上昇させます。

in situハイブリダイゼーション 2

注：検体と試薬の乾燥を避けるために、湿ったペーパータオルを敷いた加湿チャンバー内で全てのインキュベーションを行います。

1. 組織切片の脱パラフィン除去し、再水和
   1. パラフィン包埋ブロックから厚さ4μmの組織切片を準備します。ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及び亜鉛系固定液は、このプロトコルに対応しています。
   2. DEPC処理水を用いて、全ての試薬を準備します。
   3. 30分間60℃で乾燥オーブン中で加熱し、スライドを室温で30分間スライドをインキュベートします。
   4. 5分間3回、100％キシレンでスライドを浸します。新鮮なキシレンを毎回使用しています。
      注：化学ドラフト内でこの脱脂の手順を実行します。
   5. 新鮮なエタノールを毎回使用して、二回5分間、100％エタノールでスライドを浸し、シリアル、90％、80％、5分間、それぞれ70％エタノール溶液中の試料を再水和。
   6. 1分間のDEPC処理水にスライドを浸し、6分間DEPC処理PBS（pH7.4）中でスライドを洗浄します。
2. 組織切片の前処理
   1. 20分間0.1 N塩酸でスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。
   2. ワックスペンを使用して、試験片の周囲の疎水性の障壁を描画します。
      注：疎水性の障壁の大きさは、標本の大きさに依存します。したがって、次の手順で使用される試薬の体積は試料のサイズに応じて異なるが、HYを充填する必要がありますdrophobicバリア（小標本と大きな標本のために400μlの50μL）。
   3. 30分間37℃で乾燥オーブン中でプロテイナーゼKの50〜400μlの（1から10μgのml ^-1のDEPC処理したPBS中）を用いて検体を処理し、1分間、DEPC処理した1×PBSでスライドを洗浄します。
   4. 1分間のDEPC処理PBSでスライドを洗浄し、その後、10分間、DEPC処理したPBS中の4％パラホルムアルデヒド中にスライドを浸します。
   5. 20分間0.5％の無水酢酸を含む0.1Mトリエタノールアミン - 塩酸（pH8.0）でのスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。
3. プローブと洗浄とのハイブリダイゼーション
   1. 20分間、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。
   2. 1 ngの^μL-1のハイブリダイゼーション緩衝液（4×SSC、50％[体積/体積]ホルムアミド、1×デンハルト溶液、10％[重量/容量]デキストラン硫酸、0.1％[重量/容量]ドデシル硫酸ナトリウムでプローブを希釈0.4ミリグラムml ^-1のサケ精子DNA）。陰性対照のために、で標識したプローブをミックス非標識プローブの10倍過剰量。
   3. 希釈されたプローブを変性させ、組織切片上に50〜400μLを適用します。スライドにカバースリップを置き、マニキュアで密封します。
   4. 45℃または最適な温度での加湿チャンバーのO / Nで10分間、90℃でのPCR装置内の熱スライドとインキュベートスライドはステップ1.4.11で決定されました。
   5. 、4℃で30分間スライドを冷却カバースリップを削除し、以下のようなシリアルSSC緩衝液でスライドを浸す：10分間の4×SSC、10のために20分間予熱した（45℃）2×SSC、2×SSC分、および10分間の0.2X SSC。
4. 抗DIG AP結合抗体で検出
   1. 5分間MABTでスライドを洗浄します。
   2. 20分間、1％Tween 20でブロッキング溶液の50〜400μlのブロック。
   3. 溶液（1：1,000）をブロックに希釈した抗DIG-AP抗体の50〜400μl添加しanld 37℃で90分間インキュベートします。
   4. 10分間MABTでスライドを洗浄します。
   5分間、1％Tween 20を含む検出緩衝液中でスライドを浸し。
   5. μ1mMのレバミゾールの内因性アルカリホスファターゼを不活性化するために5分間（1％Tween 20を含む検出緩衝液中で）50〜400で処理します。
   6. 各試料にと開発された信号が良好になるまで2〜3時間、室温で加湿チャンバー内でスライドをインキュベート：（100 1で検出緩衝液で希釈）予混合NBT / BCIP溶液を50〜400μLを配布します。
   7. 可視化を停止し、10分間37℃で0.05％カウンター染色として[重量/容量]メチルグリーンの50〜400μLを適用し、脱イオン水でスライドをすすぎます。
   8. 、脱イオン水でスライドを洗浄し、100％エタノール中で脱水し、キシレン中に浸します。
   9. 各スライド上に取り付け、溶液の80μLを適用し、カバースリップでカバーしています。

結果

図1に示すように、それらの感受性を決定するためのキットで提供ポジティブコントロールプローブと比較してDIG標識プローブのドットブロッティング。 343 bpのP.ジンジバリス特異的プローブは、70塩基対真正細菌プローブよりも25倍より敏感である。Pの検出のための慢性歯周炎の患者から得られた歯肉組織のin situハイブリダイゼーション 図2図 ジンジバリスと真正細菌。紫色に示す細菌の信号は、組織の外側に位置する上皮、粘膜固有層、およびバイオフィルム内で検出されました。しかし、Pの分布歯肉組織内ジンジバリスと真正細菌は異なっていました。唯一の棒状の細菌はP.によって検出しながら、高倍率（1,000倍）で、細菌の様々な形状（コッカス、ロッド、紡錘状、毛状の形）は、真正細菌プローブを使用して見ることができましたジンジバリス特異的プローブ。細菌信号の分散形また、観察されました。

ディスカッション

ここで、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内の細菌をローカライズするためのプロトコルが記載されています。プローブは、細菌の16S rRNA遺伝子のDNAまたはRNA分子を標的とし、16S rRNAの標的プローブは、いずれかの種特異的または普遍として設計することができます。 P.の特異的ハイブリダイゼーションP.ジンジバリスに対する特異的プローブジンジバリスではなく、他の口腔内細菌には、以前に^10が示されています。ハイブリダイゼーション効率が^12を変化させるが、これとは対照的に、真正細菌プローブは、試験したすべての細菌ゲノムDNA（17異なる種）にハイブリダイズしました。プローブ内のT-ヌクレオチドの数は、DIG標識の効率を決定します。高感度のDIG標識プローブの製造は、記載されたプロトコルの実装を成功させるための最も重要なステップです。塩酸での試料の処理は、タンパク質の抽出及び部分hydrolysi介して信号対雑音比を向上させます標的配列のS。プロテイナーゼKの濃度の増加は、プローブのターゲットアクセシビリティは向上しますが...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
無水酢酸	シグマ	6404
50%デキストラン硫酸塩溶液	ミリポア	S4030
50Xデンハルト'sの解決	Σ	D2532
DEPC	Σ	P159220
DIG DNAの分類および検出のキット	Roche	11 093 657 910
ホルムアミド		Σ F9037
ImmEdge™ペン	ダコ	H-400
レバミゾール	ベクター	SP-5000
塩化マグネシウム	シグマ	246964
マレイン酸		Σ M0375
メチルグリーン	Σ	M6776
パラホルムアルデヒド	Σ	P1648
パーマウント	フィッシャー	SP15-500
サケ精子DNA溶液	Invitrogen	#15632-011
塩化ナトリウム	Σ	S9625
クエン酸ナトリウム	Duksan	D1420
ドデシル硫酸ナトリウム	Amresco	227
トリエタノールアミン-HCl	Σ	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T