マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

Summary

高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。

Abstract

撲滅活動の数十年にもかかわらず、マラリアは世界的な負担のまま。地域除去し、グローバル撲滅の最近の新たな関心は、抗マラリア薬に対する感受性の低下に関連する地理的集団の特性だけでなく、変形を含むマラリアの原因とマラリア原虫寄生虫種、約増加ゲノム情報を伴っています。

一つの共通の遺伝的変異、一塩基多型（SNP）は、寄生虫の遺伝子型決定のための魅力的な標的を提供しています。これらのマーカーは、薬剤耐性マーカーを追跡するならず、薬物または他の選択的圧力下でマーカーを用いて寄生虫集団を追跡するだけでなく、有用です。

SNPの遺伝子型決定法は、薬物耐性を追跡するだけでなく、特にeliminatに近づい地域におけるマラリアコントロールの努力に応じて、人口の監視のため、個々の寄生虫を指紋する能力を提供しますイオン状態。

有益なSNPは、特定の遺伝子型決定技術にとらわれないことが確認されているが、高解像度融解（HRM）分析は、フィールドベースの研究に特に適しています。単一標識プローブの個々のSNPを必要とし、複数のゲノム（polygenomic）を含有する試料中のSNPを検出するために、せいぜい10％の感度を提供し、標準的な蛍光プローブベースの方法に比べて、HRMは、2〜5％の感度を提供しています。マイナーアレルの増幅に向けて、このようなブロックされたプローブおよび非対称のプライマー濃度だけでなく、バ​​イアスPCRに増幅アニーリング温度の最適化などのHRMへの変更、さらにHRMの感度を高めます。感度の向上は、特定のアッセイに依存するが、我々は、マイナーな対立遺伝子の1％未満に検出感度が増加しています。

マラリア撲滅に近づい地域では、新興またはインポート薬剤耐性の早期発見は、広報のために不可欠ですOmpT応答。同様に、polygenomic感染を検出し、不可解な地元の貯水池からのインポート寄生虫の種類を区別する能力は、制御プログラムに通知することができます。

この原稿は、患者サンプル中のpolygenomic感染を識別するために、その感度を向上させる高解像度融解技術への変更について説明します。

Introduction

マラリアコントロールと撲滅で新たな関心にもかかわらず、マラリアはサハラ以南のアフリカ¹において、特に子供、感染の危険性のある世界の人口の半分近く、年間以上55万死亡で、世界的な負担のまま。

これらの新しいコントロールと撲滅プログラムは、配列決定マラリア原虫の大規模な数字で、ゲノムルネッサンスでサポートされていると減少し、薬剤感受性に関連する変異のために分析されている、人口特性^2,3のため、毒性を増加させました。一塩基多型（SNP）は、最も一般的に同定された遺伝的変異体^4-7の間です。

ポータブルSNPの遺伝子型決定法は、オンサイトとリアルタイム人口監視および追跡⁸提供しています。個々の寄生虫をフィンガープリントに加えて、「分子バーコード」はまた、対立遺伝子頻度の劇的な時間的なずれを検出するために使用されますだけでなく、分散などの感染⁹の人口規模と複雑さに有効。

有益なSNPのこのセットは簡単に多くのジェノタイピング・プラットフォームに適合されているが、高解像度は（HRM）の分析は特に敏感と簡単な操作と低コストで新たな変異の検出は、配列決定及び他のと比べて研究を、ベースのフィールドによく適している溶融しますアプローチは資源の乏しい設定で魅力的です。

HRMは、蛍光色素を組み込んだ標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で始まります。ポストPCR融解分析は、ピークアンプリコンの融解温度を決定します。短いアンプリコン内の単一のSNPの差は、実質的なピーク融解温度（Tm）の違いをもたらすことができます。

この方法のいくつかの改良が（クラスIV（AT）のSNPを含むSNPを区別し、存在する複数の対立遺伝子を有する試料中のマイナーな突然変異対立遺伝子を検出するために、より良い遺伝子型判定の解像度を提供するポリGenomic感染）。まず、アッセイは、異なる濃度で存在するプライマーを順方向および逆方向に加えて、SNP領域の上に中心短いプローブを組み込みます。これらのブロックされたプローブは、プローブによるテンプレート産物の産生を増加させる非対称のプライマー濃度にPCR中に増幅するが、過剰に産生さ鎖に結合しています。過剰鋳型鎖に結合したプローブからなるこれらの独立した二本鎖アンプリコンは〜20〜30塩基対です。彼らは大幅に^10のミスマッチ単一または複数の基地プローブ-テンプレートに関連付けられてはるかに大きなTmの差に全体のアンプリコン（80〜150 bp）のリード線に比べて長さを減少させました。

第二に、変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）はバイアスに反応アニール温度polygenomic感染の低い比率で存在する突然変異対立遺伝子に向かって反応を低下させます。アニール温度は、完全に一致した（野生型）のTMSおよび不一致（変異体）プローブの間に設定されています秒。この温度では、野生型対立遺伝子の結合は、増幅は、このように両方の単一のサンプル¹⁰内に存在する変異対立遺伝子の増幅に向けて付勢、そのミスマッチ同等に比べて阻害されるに十分に安定です。

これらのHRMの改良では、この技術が起源と南米¹¹と1未満に存 ​​在する新たな変異、順番にすぐ隣同士に配置された複数のSNPの分化、および変異の検出に流行感染症に関連する寄生虫の身元の追跡を可能にしましたpolygenomicサンプル¹⁰における対立遺伝子の％。

感度の増加は、事前に消去状態と新興薬剤耐性のリスクがあるものに接近する地域では特に重要です。迅速かつ簡単にオンサイト感受性低下に関連するインポート寄生虫やSNPを同定する能力は、サーベイランスと制御プログラムについての通知しますその実装と増加したマラリア撲滅と排除の努力のための識別のホットスポットの有効性。このプロトコルは、増加したHRMジェノタイピング感度のためブロックされたプローブベースとMAABのための方法を説明します。

Protocol

注：このプロトコルは、96ウェルプレート、8チューブストリップ、およびキャピラリーベースのシステム（10μlの反応容量）のためのボリュームと濃度を含み、しかしながら、HRMはまた、それに応じてすべてのボリュームをスケーリングすることにより5μlの反応体積で384ウェルプレートベースのシステムで実行することができます。ほとんどのシステムの検出範囲は、10 ngの鋳型DNAには10pgです。

1.テンプレートを準備します

1. 現場調査に参加した患者から得られた全血として格納され、赤血球をペレット化し、またはろ紙上の血液から直接、熱帯熱マラリア原虫のサンプルを得ます。
   注：サンプルはまた 、インビトロで成長する培養に適合させることができます。分析のためのいくつかの標準的な実験室株は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンター（MR4から注文することができ、サンプルをペレット化し、赤血球または培養物から直接使用するか、または全血、赤血球、またはろ紙から抽出することができます。
2. から抽出したDNAろ紙または培養適合株
   注意：HRMは、塩濃度に敏感です。可変抽出方法による濃度差が大きく溶融温度に影響を与えることができます。特定の最終バッファは成功のための重要な要因ではありませんが、標準的な一般的な溶出または再懸濁バッファー（ すなわち 、水、1×TE ['低テ」または「DNA懸濁液バッファー」：10mMのトリス-Cl、0.10 mMのEDTA]を使用しますか、 1×TE [10mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA]）全てのサンプルが異常なまたは矛盾融解曲線を回避するため。
   1. 各10μlの反応のための標準的なテ、TE、または水に10 pgの-10 NGあたりμLのテンプレート希釈液を調製します。
3. ペレット化した赤血球からの直接増幅
   1. 薄塗抹顕微鏡を用いて赤血球の寄生虫血症を決定
      注：感染した赤血球の寄生虫を決定するための方法は、疾病管理予防センター（CDC）から入手可能であります。http： //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html
   2. PCRグレードの水、TEで400、またはTE：0.5％1上記の寄生虫血症を希釈します。それぞれ5〜10μlの反応のために3μLを使用してください。
4. コントロール
   注：HRM配列が集団¹²に変異体を検出するための遺伝子走査のために使用することができます。しかし、正確なジェノタイピングは標準シーケンス検証済みSNPを含むことが尋問されている必要があります。既知の遺伝子型を使用することができるとともに、プラスミド構築物またはマラリアは隔離します。ほとんどのアプリケーションでは、3D7（MR4 MRA-151）は、野生型対照として使用します。原因間のランの変動に、常に正と負のコントロールが含まれています。
   1. 陽性対照は： - 配列検証済みSNP遺伝子型と1μlのプラスミドの希釈液または標準あたり10 ngの10頁を準備します。
   2. 増幅反応のための無鋳型対照（NTC）として使用するPCRグレードの水：ネガティブコントロール。

ve_title "> 2。PCR増幅

1. 反応混合物を準備します
   1. （オプション）ミネラルオイルオーバーレイ。注：一部のHRMシステムは、スタンドアロンの溶融・プラットフォームであり、増幅の間に結露や製品の蒸発を防ぐために加熱蓋を持っていません。
      1. 反応混合物をロードする前に、各ウェルプレートに20μlの軽鉱物油を追加します。
   2. すべてのアッセイの10倍ワーキングストックを準備します
      1. 推奨10倍作業ストック濃度と同様にブロックされたプローブベースのHRMジェノタイピングのための最終的な濃度は、表1を参照してください。
   3. 反応混合物を準備します
      1. プレートまたはチューブ内の各ウェルに、前方に1μlの10倍の作業ストックを追加して、プライマーおよびプローブ、4.0リバース - 10μlの総反応容量のために5.0μlの2.5倍または2.0倍のHRMマスターミックス、1μlのテンプレート、およびPCRグレードの水を。
   4. カバープレートまたはチューブ
      1. 光学板Sを使用しますキャピラリーベースのシステム用のプレートベースの増幅のためのEAL、ストリップチューブ・ベース・システム用の光学キャップ、プラスチックキャップ。カバレッジが完了し、プレートやキャップが完全に密封し、増幅中の蒸発を防ぐために固定されていることを確認してください。
   5. スピンサンプル
      1. スピンプレート1800×gで3分間、気泡を除去し、鉱油が使用される場合、油相と水相とを分離します。
2. 増幅プロトコール
   1. サーマルサイクラーで反応プレートまたはチューブを置きます。ファイル名を指定して実行標準ブロックされたプローブまたはMAAB増幅プロトコール（それぞれ表2、表3）。これらの方法の間のアニール温度の違いに注意してください。

3. HRM解析

1. 融液
   1. PCR増幅した後、分析を溶融に進みます。内蔵されていません増幅スタンドアロン溶融システム（ 例えば 、BioFire防衛LightScannerシステム）については、再HRM機器におけるサーマルサイクラーと場所から増幅プレートを移動します。プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを生成するために80°C - システムソフトウェアインターフェースから、40からプレートを溶かします。
      注：溶融および分析時間を節約するために、溶融ウィンドウは単にプローブ又は単位複製配列融解領域のための温度範囲をカバーするように短くすることができます。必要に応じて溶融した後、プレートおよびチューブは再溶融することができ、-20℃または4℃で保存しました。クラッキングからチューブを防ぐ唯一の4℃での保存のガラス管。
2. メルト分析
   1. 陰性サンプルを削除
      1. 解析ソフトの中では、増幅またはそれはギザギザの融解ピークを持っていなかったさらなる分析試料から取り除きます。注：個々の実行ファイルの解析のモードを選択した後、機器は自動的にグループ正と負のサンプルを。各サブセットの遺伝子型を決定する前に、ユーザーが手動で呼び出しを変更することができます。
         1. 融点のいずれかから曲線または融解ピークビュー、曲線を右クリックし、それらを選択するために除去されます。誤分類されたサンプルを選択した後、適切なグループを選択し、クリックして "、新しいコール」に進んで「変更を適用します。」
   2. ノーマライズ
      1. 温度（-dF​​ / DT）（ '差異曲線'）ビューに関して正規化蛍光の負の微分から、プローブの溶融領域を囲む正規バーを移動します。
         注：プローブは、領域が2溶融領域のより低い温度で溶融します。正規のバーは、溶融ピークのベースにする必要があります。
   3. グループを計算します
      1. 正規化した後、自動的にグループにサンプルを割り当てるために「計算グループ」を選択します。
         特定のグループに必要な場合は、手動で再割り当てサンプル。
         注：一部の解析ソフトウェアを変更することはできません高感度のしきい値があります。これらの場合において、複数のoftwareは、視覚的に別のものに属す​​る別のグループにサンプルを割り当てることができます。
   4. 遺伝子型の割り当て
      1. 標準（陽性対照）に基づいて、グループごとに遺伝子型を割り当てます。
         1. （、正しい変化が誤分類サンプルを選択し、「新しいコール」の横にあるドロップボックスから右のグループを選択してグループ化]タブの下で行われていない場合）、ユーザは計算されたグループが正しいことを確認した後、「編集グループ名を選択グループ "タブ"の下に "。
         2. 対応する色付きのボックスに標準の遺伝子型を入力します（標準3D7は、既知の遺伝子型を持っており、赤のグループにある場合、例えば、赤のグループは、遺伝子型Aを有し）。 "OK"を押して、結果を保存します。
   5. 結果のエクスポート
      1. 輸出遺伝子型は、さらにサンプル集団の分析のためのスプレッドシートとして呼び出します。

Results

データは、解析ソフトウェア及び機器に応じて、いくつかの異なる方法で視覚化することができます。一般的に、温度の結果に対する温度（-dF​​ / DT）に対して正規化した蛍光の負の導関数のプロットは、融解ピークを可視化し、遺伝子型を決定するための最も簡単です。

完全溶融ウィンドウ（40℃〜80℃）の両方のアンプリコンおよびプローブ融解領域になります。 図1両方の領域のための正規化された融解ピークの一例を示しています。特定のSNPに対応するピークの明確な差別でちょうどプローブ領域の結果を分析ウィンドウを設定する（ 図2）。

プローブベースの分析は、ホモ接合のSNPのピーク（ 図3）に一致融解温度を有する個々のピークとして両方の対立遺伝子の存在を示しています。

図4はそのprogressiを示していますvely混合対立遺伝子（ 図4B）の集団での変異対立遺伝子のための感受性の増加、その結果、変異対立遺伝子（左側のピーク）（ 図4A）の偏りに増幅（MAAB）の結果の間にアニール温度を低下させます。

図1.プローブとアンプリコン融解領域。ワイドの両方のプローブ（より低い温度）で溶融ウィンドウ結果と分析することができるアンプリコンの融解ピークを超える温度に対する正規化された蛍光の負の導関数をプロットします。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.プローブ融解ピークのSNPの不一致は（グレー）より低い融解温度を有する。パーフェクトマッチ（通常は野生型対立遺伝子）は、より高い融解ピーク（赤）になる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. Polygenomic融解ピーク。両方の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、プローブベースのHRM解析は、単一の対立遺伝子サンプル（赤とグレー）と一致したピークを持つ2つのピーク曲線（オレンジ色）のように両方の対立遺伝子を表しています。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） より大きいVを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のERSION。

図4.変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）。A.次第に増幅アニーリング温度を低下させることがpolygenomicまたはpolyallelic試料中の変異体（より低い温度）対立遺伝子に対応するピークに向かって融解ピーク反応を付勢します。 B. MAABはpolygenomicまたはpolyallelicサンプル中の1％未満で存在するマイナー対立遺伝子を検出するために、HRMの感度になります。 （パートBはダニエルズらDOIから適応：10.1128 / AAC.05737-11） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プローブベースの高解像度融解増幅反応の表1.セットアップ。

成分	再あたりの体積アクション（96ウェルプレートおよびキャピラリーチューブ）	反応あたりのボリューム（384ウェルプレート）	最終濃度
HRMマスターミックス	4-5μL	2〜2.5μlの	1×
10×過剰プライマー	1μL	0.5μlの	0.50μM
10×その他のプライマー	1μL	0.5μL	0.1μM
10倍のプローブ	1μL	0.5μlの	0.40μM
PCRグレードの水	1-2μL	0.5-1μL
テンプレートDNA	1μL	0.5μlの	0.01〜10 ngの/μL
	10μlの	5μL

表2 StandarD高解像度融解増幅条件。

温度	時間
ホールド	95°C	120秒
45サイクル	95°C	30秒
	68°Cの*	30秒
1サイクル	95°C	30秒
	28°C	30秒

*この温度は、アンプリコンに依存します

変異対立遺伝子の増幅偏り表3.増幅条件。

温度	時間	サイクル	ランプ速度	取得モード	分析モード
変性	95°C	30秒	1	20	なし
サイクル	95°C	2秒	55	20	なし	定量
	56°Cの*	15秒		20	シングル
融液	40°C	0秒		0.3	なし	なし
	45°Cの*	0秒			連続	融液
	90°Cの*	0秒

なし

*この温度は、アンプリコンに依存し、MAABを行う際に削減されます

Discussion

連続HRMはPCR後の分析ステップです。従って、サンプルおよびアッセイセットアップは、高解像度融解工程中に二本鎖の一本鎖DNAへの移行を追跡するために使用される蛍光インターカレート色素の追加の取り込みと、標準的なPCRプロトコールと同様です。成功したHRM分析のための単一の最も重要な要因は、強固なPCR産物です。アッセイ設計が鍵であり、HRMアッセイ設計に最適化されたいくつかのツールは、市販品として、オンライン¹³可能です。 〜20塩基対を伴う80-150塩基対のアンプリコンの長さは、プローブ領域内のSNPだけでなく、複数のSNPのハプロタイプを区別するために、SNPまたは関心の仕事最良のSNPの上の中心のプローブをブロックしました。プローブは、増幅の間に伸長を防ぐれ、3 '末端にC3スペーサーまたは2塩基対ミスマッチの3'のいずれかを使用してブロックすることができます。プローブは、ワトソンクリックまたはテンプレート鎖と一致するように設計することができます。選択許容可能な融解ピークを生成するプローブ設計を決定するために実験的なテストに依存します。フォワード過剰又はリバースプライマーは、ブロックされたプローブにアニールする一本鎖増幅産物を生成するために使用されます。プローブはフォワード鎖配列が含まれている場合、次に、プライマーが過剰に使用される逆一般的に1：5の比率、およびリバース鎖に一致するプローブに対するその逆。

同様に、HRMは、十分な堅牢なPCR産物に最適です。 PCR反応の最適化は、最適なアニーリング温度を決定するために、勾配PCR及びアガロースゲルまたはバイオアナライザー分析を必要とします。鋳型濃度は、鋳型濃度^{13を増加させるために} 、低プライマー濃度とサイクル数を使用して、すべてのターゲットの前増幅、バイアスされた多重化された増幅のような方法を用いて増加させることができます。

楽器のほんの一握りは、MAABと互換性があります。私使用されるガラスキャピラリー管の熱特性nは、これらのシステムは、この方法を容易にします。毛細血管の小内径並びにガラスを通して急速な熱伝達は、プラスチックの断熱特性に起因するアニーリングおよび変性サイクル間の遅い遷移速度を持つ標準的なPCRプラスチック製品、より厳しい温度制御を提供します。この方法では、検出感度は、野生型と突然変異対立遺伝子¹⁰の混合物中の変異体対立遺伝子の1％未満に2-5％から減少させることができます。

HRMは、癌遺伝子変異体のための感染症サーベイランスからのスキャンに、設定や多数の種々の用途にSNP遺伝子型決定のために、容易な、効率的、かつ経済的なツールです。このようなナノロシュとライトサイクラーシステム（480及び96）と同様に、標準的な増幅、リアルタイム、およびコピー数の機能に加えて、エコリアルタイムPCRシステムオファーHRMなどのいくつかの他の楽器、。高スループット機を使用して、HRMのバーコードは、コストレすべての試薬や消耗品など、私たちの手でのアッセイにつき$ 0.50より秒。

ここで説明する文脈では、フィールドベースのアプリケーションは、減少人口の多様性、インポートされた寄生虫の種類の検出、および減少した薬剤感受性と関連するSNPの出現と普及など、マラリア対策の取り組み、関連付けられた変更のためのリアルタイムの人口の監視を可能にします。この方法に改良がマラリアの除去と根絶に向けた進捗状況を通知するための有用な追加の感度を提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LightScanner Master Mix	BioFire Defense	HRLS-ASY-0003
BioFire Defense プレートベースの HRM システム用	軽鉱物油	Sigma	M5904
TE	Teknova	T0226
Te	Teknova	T0221	TE バッファー EDTA
PCR グレードの水	Teknova	W3330
マラリア原虫熱帯熱マラリア標準液	MR4	MRA-151, 156, 205, 330 MR4.org	無料のゲノムDNA
ライトスキャナーを提供 プライマーデザインソフトウェア	HRMアッセイデザインのための	商用
LightCycler 480 高解像度 融解マスターミックス	ロシュ	4909631001	LightCycler-480、-96、ナノで使用するため 2倍濃度
バイオアナライザー	アジレント	G2938A	Agilent 2100 バイオアナライザー
LightCycler 2.0	ロシュ	3531414001	MAAB
LightCycler Nano	ロシュ	6407773001	ストリップチューブベースのHRMおよび増幅
LightCycler 96	ロシュ	5815916001	ストリップチューブおよびプレートベースのHRMおよび増幅
LightCycler 480	ロシュ	5015278001	プレートベースのHRM(96および384-ウェルプレート)および増幅
LightScanner-96	BioFire Defense	LSCN-ASY-0011	プレートベースのHRM(96ウェル)
LightScanner-384 BioFire	Defense	LSCN-ASY-0001	プレートベース HRM (96 ウェル)
96 ウェルプレート	Roche	4729692001	HRM 用 96 ウェルプレート (LightCycler
384 ウェルプレート	Roche	4729749001	HRM 用 384 ウェルプレート (LightCycler)
96 ウェルプレート	Bio-Rad	HSP-9665	HRM(LightScanner)用96ウェルプレート
384ウェルプレート	Bio-Rad	HSP-3865	HRM(LightScanner)用384ウェルプレート
LightCycler 8チューブストリップ(クリア)	HRM用Roche	6327672001	ストリップチューブ(Light Cycler 96およびLight Cycler Nano)
LightCyclerキャピラリー(20 μl)	HRM
光学プレートシール	ロシュ	4729757001	他のブランドのための