同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

Summary

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。

Abstract

このプロトコルは、細胞を同期させることなく、細胞周期を通じて細胞を追跡する方法を記述しています。セルの同期化は、多くのセルシステムにとって困難な場合があります。標準的な方法は、特定の段階で細胞周期の進行をブロックし、蓄積された細胞を放出して、周期を一斉に進行する細胞の波を生成することです。しかし、細胞の種類によっては、このブロックが有毒であることに気づき、細胞の循環が異常になったり、大量死に至ったりすることがあります。ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込みは、個々の細胞の細胞周期の段階を追跡するために使用できます。細胞はこの合成チミジン類似体を取り込みながら、S期に新しいDNAを合成します。BrdUを短時間提供することにより、BrdUが存在する間にS期にあった細胞のプールをマークすることができます。その後、これらの細胞は、細胞周期の残りの部分を通じて追跡し、次の複製ラウンドに進むことができるため、潜在的に毒性のある細胞周期ブロックを誘導することなく、細胞周期の期間を決定することができます。また、細胞周期のその後の段階で、内部タンパク質と外部タンパク質の両方の発現を決定し、相関させることも可能です。これらを使用して、細胞周期のステージの割り当てをさらに詳細化したり、チェックポイントの活性化や細胞死などの他の細胞機能への影響を評価したりできます。

Introduction

細胞周期の進行の間に細胞内で起こる細胞周期の機能と変更点の評価は、生物学の多くの側面、特に癌の生物学を理解するための基本です。悪性腫瘍の治療のために開発中の多​​くの薬剤は、細胞周期の進行に大きな影響を持っているか、細胞周期依存性の機構を介して、細胞死を誘導します。細胞周期の特定の期における細胞周期動態または細胞を研究するためには、細胞を同期させることが一般的です。しかし、同期化方法は、潜在的に得られた結果を混乱させる、研究された細胞に有害な影響を有し得る^。1近年、細胞周期の特定の段階でのみ存在する蛍光タグ付きタンパク質の使用は、時間をかけて、単一細胞における細胞周期進行の分析を可能にしました^2、ただし細胞は遺伝的にこれを読み取ることができるシステムへの使用を制限する、これらの標識タンパク質を発現するように操作する必要性を検討しますILY達成。

細胞周期は、2つのアクティブフェーズで構成されています細胞分裂が起こる合成DNAが複製される（S）相、有糸分裂（M）を。これらの相は3ギャップ相、G _{0、G 1}及びG ₂で分離されています。 G ₀または休止は、細胞は、細胞が前のDNA複製および細胞増殖は、DNA複製の完了との間が、細胞分裂の前に続けてG ₂のサイズの増加ここで、G _1は 、周期を離れた休止期です。細胞周期の進行は、....

Protocol

ここで説明するプロトコルは、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を使用するが、他の細胞型に適用することができます。

1.ソリューションおよび試薬

1. 完全RPMI
   1. 56ミリリットルのウシ胎児血清（FCS）およびRPMI-1640培地500mlボトルに5.5ミリリットルの200mMのL-グルタミンを追加します。
2. BrdUの原液
   1. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で32.5 mMのBrdUを（10mg / ml）を準備します。
3. BrdUを完全RPMI
   1. 完全RPMIの10mlまでのBrdUストック溶液6.2μlを添加します。
4. DNase溶液
   1. 1mgのDNアーゼ/​​ DPBSでミリリットルを準備します。
5. 染色緩衝液
   1. DPBSで3％の熱不活性化FCSおよび0.09％アジ化ナトリウムを準備します。
6. 固定バッファ、透過処理用緩衝液および洗浄用緩衝液の定義については、物質一覧を参照してください。

2.細胞

いいえTE：細胞はより大きい6ヶ月間培養しませんでした。この方法は、....

Results

この方法は、情報の範囲を得るために使用することができます。いくつかのアプリケーションは、ここで概説されています。

細胞周期の継続時間の評価

細胞周期を介して通過する細胞のために必要な時間を決定するために、細胞を、BrdUのパルス後の種々の時点で採取します。評価の間隔は、分析される特定の細胞に適応させることができます。造血細胞株は、標準的な培養条件下での細胞周期相の長さを決定するために、任意の薬物治療の非存在下で24時間にわたり毎時間を評価した。 図2は、24時間の期間にわたってNALM6細胞のスナップショット分析の選択を示します。 （ 図1中のBrdU陽性ゲート内のIE）のBrdUパルス時のS期の細胞がBrdUをP後の10時間に検出され、細胞周期の期における細胞のピークとG ₂ / Mを介して進行しますulse。 S期ののBrdU標識細胞の割合は、パルスの後、その天底14時間に達し、ほぼすべての細胞が17時間後にG

Discussion

細胞周期を分析する能力は、癌生物学および細胞増殖と成長に影響を与える両薬物および遺伝子の作用機序を理解するために重要です。報告によると、細胞増殖を測定するアッセイの多数がありますが、大半は単に本数細胞を示す尺度を提供します。これらは、直接可視化、カウント、代謝活性またはATP濃度によって細胞数を測定するアッセイが含まれます。これらの方法の多くの主な利点は、それらが条件もしくは化合物の多数をスクリーニングするためにそれらを有用にする、マイクロプレートフォーマットおよび自動化に比較的実行が容易で、適していることです。これらの方法の多くの欠点は、死による細胞損失は、潜在的に、細胞増殖の過小評価につながる、考慮されていないことです。また、これらの方法は、バルク集団を測定し、単一細胞の研究や介して細胞の通過を許可していません細胞周期。

一般的に使用される増殖アッセイの、おそらく最も信頼できる正確なDNA合成を測定するものです。伝統的な細胞増殖アッセイは、新たに合成されたDNAに取り込まれる³ H-チミジン、一晩に数時間、細胞を培養する^。13この方法.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences 552598		BrdU抗体、7-AADおよびBD Cytofix/Cytoperm バッファー(Fixation Bufferと呼ばれる)BD
Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Wash buffer
DNase	Sigmaと呼ばれる	D-4513
BD ファルコン 12 x 75 mm FACS チューブ	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA フローサイトメーター	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman		Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
ウシ胎児血清	FisherBiotec	FBS-7100113
L-グルタミン	Σ	G7513-100ML
5-ブロモ-2 素数;-デオキシウリジン	Σ	B5002-1G
ファルコン TC 150  cm2 ベントフラスコ	BD Biosciences	355001
Pipettes 25 ml	Greiner	760180
Aersol ピペット 200 &マイクロ;l	Interpath	24700
Aersolピペット1 ml	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 インキュベーター	Binder	C 150
AF488 抗ヒストン H3 リン酸化 (Ser10) 抗体	細胞シグナル伝達	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) ウサギ mAb	細胞シグナル伝達	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) ウサギmAb	細胞シグナル伝達	2348S
NALM6	DSMZ	のACC-128