同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

Summary

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。

Abstract

このプロトコルは、細胞を同期させることなく、細胞周期を通じて細胞を追跡する方法を記述しています。セルの同期化は、多くのセルシステムにとって困難な場合があります。標準的な方法は、特定の段階で細胞周期の進行をブロックし、蓄積された細胞を放出して、周期を一斉に進行する細胞の波を生成することです。しかし、細胞の種類によっては、このブロックが有毒であることに気づき、細胞の循環が異常になったり、大量死に至ったりすることがあります。ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込みは、個々の細胞の細胞周期の段階を追跡するために使用できます。細胞はこの合成チミジン類似体を取り込みながら、S期に新しいDNAを合成します。BrdUを短時間提供することにより、BrdUが存在する間にS期にあった細胞のプールをマークすることができます。その後、これらの細胞は、細胞周期の残りの部分を通じて追跡し、次の複製ラウンドに進むことができるため、潜在的に毒性のある細胞周期ブロックを誘導することなく、細胞周期の期間を決定することができます。また、細胞周期のその後の段階で、内部タンパク質と外部タンパク質の両方の発現を決定し、相関させることも可能です。これらを使用して、細胞周期のステージの割り当てをさらに詳細化したり、チェックポイントの活性化や細胞死などの他の細胞機能への影響を評価したりできます。

Introduction

細胞周期の進行の間に細胞内で起こる細胞周期の機能と変更点の評価は、生物学の多くの側面、特に癌の生物学を理解するための基本です。悪性腫瘍の治療のために開発中の多​​くの薬剤は、細胞周期の進行に大きな影響を持っているか、細胞周期依存性の機構を介して、細胞死を誘導します。細胞周期の特定の期における細胞周期動態または細胞を研究するためには、細胞を同期させることが一般的です。しかし、同期化方法は、潜在的に得られた結果を混乱させる、研究された細胞に有害な影響を有し得る^。1近年、細胞周期の特定の段階でのみ存在する蛍光タグ付きタンパク質の使用は、時間をかけて、単一細胞における細胞周期進行の分析を可能にしました^2、ただし細胞は遺伝的にこれを読み取ることができるシステムへの使用を制限する、これらの標識タンパク質を発現するように操作する必要性を検討しますILY達成。

細胞周期は、2つのアクティブフェーズで構成されています細胞分裂が起こる合成DNAが複製される（S）相、有糸分裂（M）を。これらの相は3ギャップ相、G _{0、G 1}及びG ₂で分離されています。 G ₀または休止は、細胞は、細胞が前のDNA複製および細胞増殖は、DNA複製の完了との間が、細胞分裂の前に続けてG ₂のサイズの増加ここで、G _1は 、周期を離れた休止期です。細胞周期の進行は、チェックポイントの数によって制御されます。環境条件がDNA合成の支援ではなく、S期への進入を防止するときG ₁チェックポイントが活性化されます。イントラS期チェックポイントまたは遅延は、停止した複製フォークで生じ得るDNA損傷によって誘発することができます。 G ₂の間、複製されたDNAの忠実性が確認され、損傷をG _2、検出された場合チェックポイントは、前の細胞分裂にDNA修復を可能にする活性化されます。有糸分裂の間の最終的なチェックポイントは、細胞分裂が正常に完了することができるように、染色分が正常に分裂プレートに整列されていることを保証します。これらのチェックポイントの³活性化は、一般的に細胞集団を同期するために使用されます。細胞周期チェックポイントは、多くの要因によって活性化することができるが、癌生物学において最も一般的には、DNA損傷の検出です。 DNA損傷応答はPI3キナーゼ様キナーゼ毛細血管拡張性運動失調およびRAD3関連（ATR）は、それぞれ、下流のエフェクターキナーゼのChk1およびChk2での活性化血管拡張性失調症変異した（ATM）によって開始される^。3イベントの範囲は、ストールを含めたChk1を活性化させます複製フォーク、DNAの架橋、および紫外線損傷はChk2では、主に二本鎖切断によって活性化されます。

細胞周期iの長さに変更された条件の影響を研究するための通常の方法細胞周期の特定の段階において細胞を同期させるための¹本は、いくつかの方法を介して達成することができます。細胞は、物理的サイズ、密度、側方散乱（粒度）、および細胞表面マーカーの発現に基づいて分離することができます。具体的には、細胞は、化学的手段によって同期させることができます。チミジン、ヒドロキシ尿素及びシトシンアラビノシドのようないくつかの薬剤は、薬剤が除去された後に循環を続けるS期における細胞の蓄積を生じ、細胞周期のS期におけるDNA合成を阻害するために使用することができます。またはM期のDNA含量-有糸分裂紡錘体、G ₂と逮捕の形成を防止するノコダゾール、で処理した細胞。 G ₀期の細胞の蓄積培地結果から血清の排除。培養血清中の栄養素の再添加は、細胞の正常な循環を再起動します。しかし、これらの同期方法の全ては、細胞の正常な循環と成長を妨害することが可能とresul有意な細胞死でT。

急性リンパ芽球性白血病細胞の同期は特に困難であり、これらの細胞は、遺伝子操作に適していません。ここで説明する方法は、細胞周期動態の評価と、従来の同期または遺伝子改変することなく、細胞周期の特定の段階にある細胞の研究を可能にします。この方法は、遺伝子改変し、従来の同期手順は容易に達成されていない他の細胞型のために有用であり得ます。この方法は、細胞の短期の成長および増殖にはほとんど影響を与えブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込み、長い確立使用に基づいている^。4設立のBrdUプロトコルはS期の間に新たに合成されたDNAへのBrdUの取り込みを利用します。これは恒久的にBrdU露光中、S期にあったように、細胞をマークします。この集団は、BrdUのincorporために染色することにより、後の時点で識別することができエーション、それにより追跡し、細胞周期の通過に対する薬物効果の研究を可能にする時間をかけて評価することができる同期集団として機能します。 BrdUを通常DNアーゼまたは酸処理した後の達成、前抗体染色にさらされる必要がある^。6,7取り込まれたBrdUは、追加のマーカーを含めることができ検出するために、フローサイトメトリーを使用しました。最も重要なのは、試験の開始時にS期にあった細胞の細胞周期分布の評価を可能にする、DNA含有量を測定するための色素の使用である^。8さらに、追加の表面または細胞内抗原はまた、研究することができる^。9、これらなどのKi67として、またはそのような切断されたカスパーゼ3のようなアポトーシスマーカーとしての一見無関係な細胞機能への細胞周期のイベントに関連してもよいです。潜在的な用途は、研究者の想像力によって制限されています。

Protocol

ここで説明するプロトコルは、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を使用するが、他の細胞型に適用することができます。

1.ソリューションおよび試薬

1. 完全RPMI
   1. 56ミリリットルのウシ胎児血清（FCS）およびRPMI-1640培地500mlボトルに5.5ミリリットルの200mMのL-グルタミンを追加します。
2. BrdUの原液
   1. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で32.5 mMのBrdUを（10mg / ml）を準備します。
3. BrdUを完全RPMI
   1. 完全RPMIの10mlまでのBrdUストック溶液6.2μlを添加します。
4. DNase溶液
   1. 1mgのDNアーゼ/​​ DPBSでミリリットルを準備します。
5. 染色緩衝液
   1. DPBSで3％の熱不活性化FCSおよび0.09％アジ化ナトリウムを準備します。
6. 固定バッファ、透過処理用緩衝液および洗浄用緩衝液の定義については、物質一覧を参照してください。

2.細胞

いいえTE：細胞はより大きい6ヶ月間培養しませんでした。この方法は、細胞密度および培養培地の調整と非付着性細胞株に直接適用可能です。実験の開始時に指数関数的に増殖している細胞を使用してください。

1. 完全RPMI中のT-75培養フラスコ中NALM6細胞を維持します。クラスII安全キャビネットを使用して、無菌条件下で、すべての手順を実行します。
   1. 週に3回文化を分割して、1ml当たり1〜2×10 ^6個の細胞間NALM6細胞を維持します。
   2. 大気中のCO _{2、5％、37℃}でインキュベートします。

BrdUで細胞の3パルス標識

注意：それは潜在的な変異原と催奇形物質であるように注意したBrdUを処理します。

1. 5分間、150×gで遠心分離した細胞。注：新鮮な培地に細胞を転送すると、結果の再現性を向上させます。
2. 2×10 ^6℃での完全RPMI中の細胞数および再懸濁細胞を行いますells / mlの。
3. BrdUの完全RPMIに1×10 ⁶細胞/ mlの最終細胞濃度を産生して細胞を2 1に希釈します。
4. その後、完全RPMIで10のセル1を希釈し、45分間、5％CO ₂で37℃でインキュベートします。遠心セル5分間150×gで、慎重に上清をすべて廃棄します。
5. 完全RPMIの少量（〜100μL）中で再懸濁した細胞は、細胞計数を行い、1×10 ⁶細胞/ mlに調整します。
6. ピペット48ウェルプレートのウェルへの細胞の1ミリリットル。ピペットより再現性のある結果を得るために、未使用のウェルにDPBSの1ミリリットル。
7. 所望ここ時点、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、空気中5％CO ₂中で37℃でインキュベートします、18、19、20、21、22、23、及び24時間。注意：時間の長さは、実験計画を測定することを目的とするものに依存します。
8. ピペットを用いてFACSチューブにすべてのセルを転送します。 1ミリリットルvoluとよく順次をすすぎます5ミリリットルの最終全容量のPBS MES。
9. 5分間150×gで遠心分離し、慎重にすべての上清を除去します。細胞は、染色のための準備ができているすぐにこの（セクション4）を行います。

4.細胞染色

注：細胞表面染色が必要な場合は、細胞が全体に4℃に保たれることを確実に定着する前にそれを行います。

1. 染色緩衝液100μl中に再懸濁細胞（任意の表面染色のためには、表面抗原と4℃で30分間インキュベートし、抗体の推奨量を追加します）。
2. 、染色緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   注記：特定の抗体濃度、インキュベーション時間等は、特定の実験の目的に応じて変化します。
3. 固定および透過処理
   1. 固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
   2. 1ミリリットルOを追加F洗浄バッファー、150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   3. 透過化緩衝液100μlで細胞を再懸濁し、氷上で10分間細胞をインキュベートします。
   4. 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   5. チューブあたり固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
   6. 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
      注：必要に応じてプロトコルは、ここで一時停止することができます。染色緩衝液中に再懸濁させた場合に固定された細胞は、4℃で数日間安定です。先に進む前に、遠心分離後染色バッファーを削除します。
4. DNase処理
   1. DNase溶液100μl中に再懸濁細胞（30μgの⁶ DNアーゼ/ 10の細胞）および37℃で1時間、細胞を培養します。
   2. 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離し、上清を捨てます。
5. 抗体染色
   注：BrdUの以外の細胞内マーカーについて染色BrdU染色と同時に行うことができます。
   1. 重要：それぞれの単一の蛍光色素で標識された未染色の細胞と細胞か​​らなる補償コントロールを準備します。理想的には、実験チューブに使用されるもののような補償のコントロールに同じ抗体を使用しています。これが不可能な場合には、高度に発現される抗原に対する代替抗体は、同一の蛍光色素にコンジュゲート。
   2. 洗浄緩衝液50μl中に細胞を再懸濁し、1μL/ BrdU抗体の10 ^6個の細胞を追加します。注：他の特定の細胞内抗原に直接結合した抗体を添加することもできます。
      注：セリン10上でリン酸化ヒストンH3に対する抗体は、G2中の細胞を区別するために使用することができ、M、ヒストンH3のセリン10、有糸分裂の間にリン酸化されるTyr15がリン酸化CDC2に対する¹⁰抗体は、HAV細胞を検出するために使用することができます。E有糸分裂にコミット^。11
   3. 室温で20分間細胞をインキュベートします。
   4. 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離細胞と上清を捨てます。

6. 細胞周期分析のための染色DNA
   1. ペレットを緩め、7-AAD溶液（0.25μgの）の20μlを添加します。注：これは、7-AAD /セルの一定量を使用することが重要です。
   2. 染色緩衝液1mlで細胞を再懸濁します。

フローサイトメトリーデータの5集

注：必要なマシンが使用する蛍光色素の数と性質に依存します。

1. リニアスケールのFSC-A、SSC-A、FSC-H（FSC-Wの代わりにFSC-Hを用いることができる）と7-AAD蛍光：次のパラメータを収集します。対数スケール上のAPCチャネルを収集します。対数スケールを用いて表面や内部のラベルの評価のために必要な追加のチャネルを収集します。
2. COMを行いますサンプルを分析する前に、異なる蛍光色素との間で観察された発光スペクトルの信号の重複pensation。注：ほとんどのフローサイトメーターは、これを自動的に実行します。
3. 各サンプルの少なくとも10,000個のイベントを収集します。

フローサイトメトリーデータの分析6.

注：FlowJoソフトは、フローサイトメトリーデータ分析のために、本研究で使用したが、他のソフトウェアパッケージを使用することもできます。ゲーティング戦略は、図1に示されています。

1. FSC-AおよびSSC-Aのパラメータを使用して、生細胞集団を特定します。
2. この集団内ダブレットと（もここで用いることができるFSC-W）FSC-AおよびFSC-Hを用いて凝集体を除外します。
3. この集団内でのy軸上のx軸とのBrdU-APCに7-AADを用いたドットプロットを設定します。

図1：ゲーティング戦略左PA。ネル：非ゲートの細胞は、SSCドットプロット対FCS-Aに示されています。生存可能な細胞集団を示したゲートによって識別されます。センターパネル：左パネルからゲート細胞は、FSC-Hドットプロット対FSC-A（FSC-Wの代わりに高さを使用することができます）に表示されます。ダブレットと凝集体が同定され、示されたゲートで除外されています。右パネル：中央のパネルで二重排除日からゲート細胞は、APC-ドットプロット対7-AADに表示されます。 BrdU抗体は、APCをパルス標識中のBrdUを取り込んだ細胞の同定を可能に標識されています。 7-AADは、DNA含有量についての情報を提供します。上部ゲートは、BrdUのための陽性細胞を定義するため、S期でのBrdUパルスの時に、左下のゲート、G _0/1のセルと右下のゲートGのもの₂ / M。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

4. 細胞周期A nalysis
   1. ダブレット排除ゲート内の細胞の最初のデータ·ファイルとゲートを開きます。
   2. （FloJoソフトウェアのプラットフォームの下に位置する）は、細胞周期分布のために、この集団を分析し、ディーン·ジェット·フォックスモデルを使用します。
   3. ゲートを作成し使用してG _0/1およびG ₂ / Mピークの位置を取得します。
   4. BrdU陽性細胞と被写体上のゲートと同じ細胞周期分析にこの集団。
   5. 作成ゲートから同じゲートを適用し、G _0/1およびG ₂ / Mピークの位置について（作成したゲートを使用）制約を設定することにより、G _0/1およびG ₂ / Mピークの位置を提供します。これは、 図2の第2のパネルに示されています。
      注：他のソフトウェアは、データを分析するために使用されてもよく、命令は、それに応じて変化するであろう。

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図2：細胞周期の進行最初のパネル（全細胞）を二重排除ゲートによって定義された細胞集団にゲートされます。この集団は、X軸上の7-AADとヒストグラムで表示しました。 G _0/1ピークのピークが軸の下の矢印で示されています。 図1に示すように、後続のパネルでのBrdU陽性細胞にゲートされている。得られたG _0/1位置の値を二重排除ゲートのゲートは、FlowJoソフト細胞周期ソフトウェア内のBrdU陽性のゲート細胞に適用した場合。 図1および第2のパネルに示すように、全体の人口を分析したときに得られる値に基づいて、G _0/1ピークの位置に示すように後続の各パネルには、BrdU陽性集団にゲートをしました。同じSAMPでのBrdU陽性細胞のためのG _0/1集団の位置を特定するためのBrdU陰性画分を使用しましたルは、サンプル間のDNA染色の強度のわずかな違いを制御します。各パネルに表示される数は、BrdUのパルスが終了してからの時間を表しています。計算された細胞周期相は日陰緑色で示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Results

この方法は、情報の範囲を得るために使用することができます。いくつかのアプリケーションは、ここで概説されています。

細胞周期の継続時間の評価

細胞周期を介して通過する細胞のために必要な時間を決定するために、細胞を、BrdUのパルス後の種々の時点で採取します。評価の間隔は、分析される特定の細胞に適応させることができます。造血細胞株は、標準的な培養条件下での細胞周期相の長さを決定するために、任意の薬物治療の非存在下で24時間にわたり毎時間を評価した。 図2は、24時間の期間にわたってNALM6細胞のスナップショット分析の選択を示します。 （ 図1中のBrdU陽性ゲート内のIE）のBrdUパルス時のS期の細胞がBrdUをP後の10時間に検出され、細胞周期の期における細胞のピークとG ₂ / Mを介して進行しますulse。 S期ののBrdU標識細胞の割合は、パルスの後、その天底14時間に達し、ほぼすべての細胞が17時間後にG

Discussion

細胞周期を分析する能力は、癌生物学および細胞増殖と成長に影響を与える両薬物および遺伝子の作用機序を理解するために重要です。報告によると、細胞増殖を測定するアッセイの多数がありますが、大半は単に本数細胞を示す尺度を提供します。これらは、直接可視化、カウント、代謝活性またはATP濃度によって細胞数を測定するアッセイが含まれます。これらの方法の多くの主な利点は、それらが条件もしくは化合物の多数をスクリーニングするためにそれらを有用にする、マイクロプレートフォーマットおよび自動化に比較的実行が容易で、適していることです。これらの方法の多くの欠点は、死による細胞損失は、潜在的に、細胞増殖の過小評価につながる、考慮されていないことです。また、これらの方法は、バルク集団を測定し、単一細胞の研究や介して細胞の通過を許可していません細胞周期。

一般的に使用される増殖アッセイの、おそらく最も信頼できる正確なDNA合成を測定するものです。伝統的な細胞増殖アッセイは、新たに合成されたDNAに取り込まれる³ H-チミジン、一晩に数時間、細胞を培養する^。13この方法...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences 552598		BrdU抗体、7-AADおよびBD Cytofix/Cytoperm バッファー(Fixation Bufferと呼ばれる)BD
Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Wash buffer
DNase	Sigmaと呼ばれる	D-4513
BD ファルコン 12 x 75 mm FACS チューブ	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA フローサイトメーター	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman		Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
ウシ胎児血清	FisherBiotec	FBS-7100113
L-グルタミン	Σ	G7513-100ML
5-ブロモ-2 素数;-デオキシウリジン	Σ	B5002-1G
ファルコン TC 150  cm2 ベントフラスコ	BD Biosciences	355001
Pipettes 25 ml	Greiner	760180
Aersol ピペット 200 &マイクロ;l	Interpath	24700
Aersolピペット1 ml	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 インキュベーター	Binder	C 150
AF488 抗ヒストン H3 リン酸化 (Ser10) 抗体	細胞シグナル伝達	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) ウサギ mAb	細胞シグナル伝達	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) ウサギmAb	細胞シグナル伝達	2348S
NALM6	DSMZ	のACC-128