同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

サマリー

生体内ERGは、動物や人間の孤立した無傷の網膜から直接、網膜細胞の電気的活動を記録するために使用することができます。ここでは、網膜細胞の電気的活動を解剖するために、一般的なin vivo ERGシステムをex vivo ERG記録に適合させることができることを示します。

要約

In vivo 網膜電図(ERG)シグナルは、異なる網膜細胞タイプに由来するいくつかの重なり合う成分と、網膜外ソースからのノイズで構成されています。生体外でのERGは、動物やドナーの眼の無傷の単離された網膜から直接網膜細胞の機能を解剖する効率的な方法を提供します。さらに、ex vivo ERGは、動物またはヒトの網膜組織に対する潜在的な治療薬の有効性および安全性の試験に用いることができる。ここでは、市販のin vivo ERGシステムを使用して、単離されたマウス網膜からex vivo ERG記録を行う方法を示します。標準的なin vivoシステムの光刺激、電子、加熱ユニットと、カスタム設計の試料ホルダー、重力制御灌流システム、電磁ノイズシールドを組み合わせて、2つの網膜からの低ノイズのex vivo ERG信号を同時に記録し、商用のin vivoに含まれる取得ソフトウェアを使用しますシステムズ。さらに、この方法を、特定のERG成分を除去する薬理学的治療と組み合わせて、特定の網膜細胞タイプの機能を解剖する方法を示します。

概要

電図（ERG）は、光によって誘発網膜の電気的活動を記録するために使用することができ、十分に確立された技術です。 ERG信号は、網膜の抵抗性の細胞外空間に流れる（感光体と双極細胞の軸に沿って）半径方向の電流による電圧変化によって主に生成されます。最初のERG信号はフィッシュアイ¹の表面からホルムグレンによって1865年に記録しました。アイントホーフェンとジョリー1908 ^2は、双極細胞ON、今主に光受容体の活性を反映することが知られている3つの異なるA-と呼ばれる波、B-、およびc波、への光の発症にERG応答を分割し、色素上皮細胞、それぞれ^3-8。 ERGは、単離された眼用調製物⁹から、単離された無傷の網膜（ エキソビボ ^）3,10-15間または微小電極を有する特定の網膜層にわたって、（ インビボ ）麻酔した動物またはヒトの目から記録することができます（ローカル^{ERG）4,16。}これらの中で、in vivoでの ERGは、現在、網膜機能を評価するために最も広く用いられている方法です。これは、診断目的のために使用することができ、あるいは、動物または患者における網膜疾患の進行を追跡するために非侵襲的な技術です。しかし、in vivoでの ERG記録は、多くの場合、外眼生理学的ノイズ（ 例えば、呼吸や心臓活動）によって汚....

プロトコル

全ての実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する指針に従ったとワシントン大学の制度的動物研究委員会によって承認されました。

1.灌流および試料ホルダーの設定

1. 実験の日に新鮮な網膜灌流のための溶液を調製します。蒸留脱イオン水を使用してください。次の三つの溶液のいずれかを使用します。
   1. 重炭酸塩含有エイムズ」溶液（1 L）を：エイムスの1ボトル」の準備メディア、そしてNaHCO ₃ 1.9gの、
   2. （mm表示）ロックの溶液を調製する：112.5のNaCl、3.6のKCl、2.4のMgCl _2、1.2のCaCl _2、10.0 HEPES、20.0のNaHCO _3、3.0コハク酸ナトリウム、0.5のNa、グルタミン酸0.02 EDTA、及び10.0グルコース、0.1％のMEMビタミンとアミノ酸酸
   3. （mm表示）HEPES緩衝リンゲル液を準備します。133.3のNaCl、3.3のKCl、2.0のMgCl _2、1.0のCaCl _2、10.0グルコース、0.01 EDTA、12.0 HEPES、pH値1 MのNaOH〜5.8ミリリットルを7.5に調整し、0.72グラム/ Lリーボビッツ培地のL-15を追加します。任意の灌流媒体と感光体の応答を分離するために、100μMのBaCl _....

結果

我々は、実験プロトコル上述の異なる標準灌流液（ 図2）を用いて、 図1に示しに従って、暗順応の野生型（WT）C57BL / 6マウスの網膜からフラッシュ応答を記録しました。応答波形と速度だけでなく、桿体の感度はエイムスの類似しているように見えた」とロックのメディア（ 図2AおよびB）。一方、HEPES緩衝リンガー液（重炭酸塩なしまたは5％CO _{2/95％O 2）}下での応答振幅が有意に小さかったです。また、これらの条件にb波の安定性が損なわれたことがわかりました。 40μMのAPB（DL-AP4）を追加すると、すべての3つのメディア（ 図2D-F）で効率的にポジティブb波を除去します。 b波の除去は、ミュラー細胞活性²¹に起因している大規模な低速負の波（ 図2D）を明らかにしました。 100を追加します＃956;バリウムのMは、ex vivo ERG信号（ 図2.......

ディスカッション

ここではex vivoで ERGアダプタと一緒にin vivoでの ERGシステムのコンポーネントを使用して、2つの単離されたマウス網膜から同時に高品質のex vivoでの ERG記録を得るための重要なステップを示しています。本研究では、同じ溶液（いずれかエイムズ'、ロックのあるいはリンゲル）と動物の両方からの網膜を灌流が、薬物検査のために、別のソリューションの例で、それぞれの網膜を灌流することも可能です。高品質のデータを取得するための最も重要なステップは、高度な特注の試料ホルダを使用して、暗赤色（またはIR）の下で、すべてのサンプル調製手順を実行することにより、電磁ノイズ、網膜を注意深く解剖、安定した比較的速い灌流流れから遮蔽されています光。ここで説明する方法は、in vivoおよびex vivo ERG記録に実行するために、両方の網膜およびin vivoでの ERGのセットアップの二重使用をすぐに使用することができます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
In vivo ERGシステム	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
>In vivo ERGシステム	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
>Exvivoアダプター	OcuScience	Ex VIVO ERG アダプター	www.ocuscience.us/id107.html
解剖顕微鏡	ノースセントラルインスツルメンツ	ライカ M80	任意のブランド
>IRエミッタ	Opto Diode Corp.を使用できます。	OD-50L	www.optodiode.com
>Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	ミリタリーグレードの製品。
レッドフィルター	Rosco Laboratories	Roscolux #27 ミディアムレッド	IRシステムの代わりに使用できます
レッドヘッドライト	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
>Dumont Tweezers #5	WPI, Inc.	14101
カミソリの刃	電子顕微鏡 科学	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler トレド	AB54-S/FACT	任意のブランドを使用できます
>pHメーターと電極	ベックマン・コールター	pHI 350	任意のブランドを使用できます
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	任意のブランドを使用できます
KCl	Sigma-Aldrich	60129	任意のブランドを使用できます
>MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 Mソリューション
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	任意のブランドを使用できます
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	任意のブランドを使用できます
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6297	任意のブランドを使用できます
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	任意のブランドを使用できます
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	使用できます任意のブランド
DL-AP4	トクリスバイオサイエンス	101	任意のブランドを使用できます
コハク酸二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	224731	任意のブランドを使用できます
L-グルタミン酸	Sigma-Aldrich	G2834	任意のブランドを使用できます
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G7528	任意のブランドを使用できます
Leibovitz培地 L-15	Sigma-Aldrich	L4386	ブランドの
MEMビタミン	を使用できます Sigma-Aldrich	M6895
MEMアミノ酸	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2

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