同時 ex vivoで機能テスト in vivoで電図システム

サマリー

生体内ERGは、動物や人間の孤立した無傷の網膜から直接、網膜細胞の電気的活動を記録するために使用することができます。ここでは、網膜細胞の電気的活動を解剖するために、一般的なin vivo ERGシステムをex vivo ERG記録に適合させることができることを示します。

要約

In vivo 網膜電図(ERG)シグナルは、異なる網膜細胞タイプに由来するいくつかの重なり合う成分と、網膜外ソースからのノイズで構成されています。生体外でのERGは、動物やドナーの眼の無傷の単離された網膜から直接網膜細胞の機能を解剖する効率的な方法を提供します。さらに、ex vivo ERGは、動物またはヒトの網膜組織に対する潜在的な治療薬の有効性および安全性の試験に用いることができる。ここでは、市販のin vivo ERGシステムを使用して、単離されたマウス網膜からex vivo ERG記録を行う方法を示します。標準的なin vivoシステムの光刺激、電子、加熱ユニットと、カスタム設計の試料ホルダー、重力制御灌流システム、電磁ノイズシールドを組み合わせて、2つの網膜からの低ノイズのex vivo ERG信号を同時に記録し、商用のin vivoに含まれる取得ソフトウェアを使用しますシステムズ。さらに、この方法を、特定のERG成分を除去する薬理学的治療と組み合わせて、特定の網膜細胞タイプの機能を解剖する方法を示します。

概要

電図（ERG）は、光によって誘発網膜の電気的活動を記録するために使用することができ、十分に確立された技術です。 ERG信号は、網膜の抵抗性の細胞外空間に流れる（感光体と双極細胞の軸に沿って）半径方向の電流による電圧変化によって主に生成されます。最初のERG信号はフィッシュアイ¹の表面からホルムグレンによって1865年に記録しました。アイントホーフェンとジョリー1908 ^2は、双極細胞ON、今主に光受容体の活性を反映することが知られている3つの異なるA-と呼ばれる波、B-、およびc波、への光の発症にERG応答を分割し、色素上皮細胞、それぞれ^3-8。 ERGは、単離された眼用調製物⁹から、単離された無傷の網膜（ エキソビボ ^）3,10-15間または微小電極を有する特定の網膜層にわたって、（ インビボ ）麻酔した動物またはヒトの目から記録することができます（ローカル^{ERG）4,16。}これらの中で、in vivoでの ERGは、現在、網膜機能を評価するために最も広く用いられている方法です。これは、診断目的のために使用することができ、あるいは、動物または患者における網膜疾患の進行を追跡するために非侵襲的な技術です。しかし、in vivoでの ERG記録は、多くの場合、外眼生理学的ノイズ（ 例えば、呼吸や心臓活動）によって汚染された、いくつかの重複する構成要素との複雑な信号を生成します。

ローカルERGは網膜の特定の層を横切って信号を記録するために使用することができるが、それは、最も侵襲性であり、他のERG記録の構成と比較して最も低い信号対雑音比（SNR）を有しています。ローカルERGも技術的に厳しいですし、高価な機器（ 例えば、顕微鏡とマイクロマニピュレータ）が必要です。無傷の、単離された網膜からTransretinal ERG（ex vivoでの ERG）は、インビボで安定した可能ローカルERG方法とHIGとの間の妥協を提供しています動物又はヒト¹⁷の無傷の網膜からのH SNRの録音。最近では、この方法は、哺乳動物、霊長類およびヒト網膜^18-20に桿体および錐体光受容体の機能を研究するために首尾よく使用されています。また、原因エクスビボ網膜色素上皮が存在しないために、ERG信号の正のC波成分が除去され、顕著な負の遅いPIII成分は、ex vivoでの記録で明らかにされています。遅いPIII成分は網膜^21-23におけるミュラーグリア細胞の活性に由来することが示されています。従って、 エキソビボ ERG方法も、無傷網膜におけるミュラー細胞を研究するために使用することができます。いくつかの研究はまた、 エクスビボで ERG記録が網膜²⁴の周りの薬剤の濃度を測定し、薬物^25-27の安全性及び有効性を試験するために使用され得ることを示しました。

複数の商業的なインビボ系が入手可能であり、必ずしも大規模な電気生理学的背景を持っていない多くの研究室で使用されます。これとは対照的に、ex vivoでのデバイスは、最近¹⁷まで利用されていないと、結果としてごく少数の研究室では、現在、この強力な技術を活用しています。これは、網膜の生理学および病理学についての知識を進めるために、および疾患を失明するための新しい治療法を開発するために、より多くの研究室へのex vivoでの ERG記録を利用できるようにすることが有益であろう。ここでは、単純で手頃な価格のエキソビボ ERG装置^17を示し、それは棒状とコーン媒介シグナルを記録するために、いくつかの市販のin vivoでの ERGシステムと組み合わせて使用することができる方法を示す（A及びB波）と機能無傷の野生型マウスの網膜からミュラー細胞（PIIIを遅らせます）。

プロトコル

全ての実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する指針に従ったとワシントン大学の制度的動物研究委員会によって承認されました。

1.灌流および試料ホルダーの設定

1. 実験の日に新鮮な網膜灌流のための溶液を調製します。蒸留脱イオン水を使用してください。次の三つの溶液のいずれかを使用します。
   1. 重炭酸塩含有エイムズ」溶液（1 L）を：エイムスの1ボトル」の準備メディア、そしてNaHCO ₃ 1.9gの、
   2. （mm表示）ロックの溶液を調製する：112.5のNaCl、3.6のKCl、2.4のMgCl _2、1.2のCaCl _2、10.0 HEPES、20.0のNaHCO _3、3.0コハク酸ナトリウム、0.5のNa、グルタミン酸0.02 EDTA、及び10.0グルコース、0.1％のMEMビタミンとアミノ酸酸
   3. （mm表示）HEPES緩衝リンゲル液を準備します。133.3のNaCl、3.3のKCl、2.0のMgCl _2、1.0のCaCl _2、10.0グルコース、0.01 EDTA、12.0 HEPES、pH値1 MのNaOH〜5.8ミリリットルを7.5に調整し、0.72グラム/ Lリーボビッツ培地のL-15を追加します。任意の灌流媒体と感光体の応答を分離するために、100μMのBaCl ₂ - 50μMのDL-AP4、50 - 20を使用してください。
2. （mm表示）電極²⁸用の溶液を調製：140.0のNaCl、3.6のKCl、2.4のMgCl _2、1.2のCaCl _2、3 HEPES、0.01 EDTAおよび7.4にpHを調整- NaOHで7.5。電極溶液は、数ヶ月間、室温で保存することができます。
3. 試料ホルダーを準備し、テストします。
   1. 試料ホルダーの底部のドームの上に黒/グレーの濾紙を接着（ 図1A参照 ）。ドームの平坦な頂部の縁の周りに慎重に二成分5分エポキシ接着剤を広げます。必要に応じて、解剖顕微鏡下でそれを行います。
   2. 接着剤がほぼ乾燥するまで待ちます（約4分）、フラットなアイテムを使用して、ドームのろ紙を押してください。糊ろ紙実験前少なくとも1日。ザ濾紙は、複数回使用することができるが、記録の月後に交換されるべきです。交換用の紙をインストールする前に、糊残りから慎重にドームをきれいにするために70％エタノールを使用してください。
   3. （ 図1AおよびBを参照）、任意の気泡や電極チャネルにねじアダプタで囲まれたスクリューペレット電極を回避しようとしている電極溶液で電極チャネルを埋めます。 4本のネジで試料ホルダーの上下の部分を接続し、電極溶液で灌流ラインを埋めます。
   4. マルチメータ（ 図1B）を用いて、各電極対のリード線間の抵抗と電圧を測定します。チャネルは無気泡であり、電極が良好な状態にある場合、抵抗は100Ωkと10 mVの下の電圧以下である必要があります。
4. ガラス瓶に灌流培地の700ミリリットル - 400を注ぎます。別の300mlの網膜およびsの解剖において使用するために別個の冷蔵庫の中にそれを引き裂きました。 （ 図1Dを参照）、熱交換器ブロックで灌流チューブをセットし、加熱プレート上で予備加熱されたブロックを配置します。
5. （ 図1Dを参照）接続（エイムズ」やロックのが使用されている場合_）2 / O ₂ガスをCOおよび灌流チューブ用するを持っているキャップでボトルを囲みます。 ^37°Cのにメディアでボトルを予熱し、加熱板上または37に設定した水浴中の光刺激装置の上に置きます- ^{39°Cの17。}
   1. プライム重力駆動流を開始するために灌流培地でそれらを充填することにより、灌流ラインが。
      1. LKCシステムでは、その後の実験中にボトル内の灌流液の低下レベルによって影響を受けることなく、流量調節器によって調節される重要な重力流を提供するために、刺激器ユニット¹⁷の上にボトルを置きます。
      2. Ocuscienceシステムでは、Pを配置溶液の重力ドライブを増加させるために十分に試料ホルダー（および灌流瓶）のレベル以下（ステップ2.8を参照）、ノイズを最小限に抑え、試料ホルダから長い灌流出力線を配置するために、ファラデーケージ内のerfusionボトル。これらの出力線を遮蔽し、ERG信号への電磁ノイズの結合を防止するためにアンプのアースにシールドを接続します。
6. 流量調節器を用いて5ml /分 - 3に灌流を調整します。適切な調節因子でシリンダーから5％CO _{2/95％O 2}ガスを接続し、エアストーンを通してボトル内のメディアの安定バブリングを確実にするために流量を調整します。

2.サンプル調製

1. ストレート刃microscissorsは、1つまたは2つの45 ^Oピンセット、かみそりの刃と濾紙の長方形の一枚など、クリーンでシャープな解剖器具を組み立てます。
2. 冷たいperfuの約200mlを注ぎ大きいペトリ皿中のシオン溶液（ドームを含む）を試料ホルダーの底部全体を溶液に浸漬することができるように。ドームの網膜をマウントする場合、このステップは重要となる（ステップ2.6を参照してください）​​。いくつかのソリューションは、カルボゲン（5％CO _{2/95％O 2）}で飽和するように設計されているが、これは、切開のために必須ではなく、ここに記載した実験で行われていませんでした。
3. 典型的な実験では、明/暗サイクル12/12時間で動物を維持し、6のためにそれらを暗適応させる - レコーディングの前に12時間。 （顕微鏡光源の前に、例えば、赤色フィルタを使用）暗赤色灯の下で頸椎脱臼に続いてCO ₂吸入により動物を安楽死させると、暗赤色またはIR光の下で、次のすべての手順を実行します。
   1. ピンセットを使用して目を引いて、メディアに入れて。紙の小片（ 例えば、いくつかの定期的なフィルターペーパー）で一度に一つの目を配置したようにします（これはここでは、溶液の外で行われます）ピンセットで目を押さえながら鋸状縁のレベルにほぼ点灯。
4. microscissorsで鋸状縁（または目の赤道に近い）に沿って切断し、角膜とレンズを取り外してください。大型シャーレに冷たいメディアにアイカップを置き、他の目で同じ手順を繰り返します。
5. 可能な限り無傷のように網膜を維持するために、網膜と強膜の間にはさみを保持することにより、視神経に向かってアイカップの上から小さな切開をカット。グリップ2ピンセットを使用し、網膜をデタッチ互いに離れるピンセットを引くことにより、切開の両側から強膜。
   1. 視神経を切断し、遠位表面への物理的な接触の最小量で網膜を分離してみてください。 RPEは、主に解剖プロセスの間に、網膜から自動的に切り離します。これは、実行するよりも、網膜の機械的な妨害を回避することが重要です切開はすぐに一般網膜応答特性に大きな影響を与えることなく、溶液中で少なくとも30分間インキュベートすることができます。
6. 試料ホルダー（ 図1C）のドームの網膜をマウントします。切開した網膜でペトリ皿内の試料ホルダーの底部を浸します。ドームの上に、上向きに網膜、光受容体の側（分離された網膜の凸面）をスライドさせ、網膜が濾紙上に付着するように試料ホルダーを持ち上げます。他の網膜のための手順を繰り返します。
7. 電気網膜間のクロストークと同様にノイズと信号シャントを防ぐために慎重にホルダープレートを乾燥させます。試料ホルダーは、ホルダーの底部と上部の部分の間の溶液が流出することを防止するだけでなく、個々の網膜の光受容体と神経節細胞の辺の電気的分離を助けるために底部のドームの周りにOリングを持っています。 （4本のネジでホルダーの上部を取り付け図1Bを参照）、注射器と針を用いて灌流溶液で灌流チャネルを満たします。
8. 熱交換器ブロックの隣に試料ホルダーを移し、試料ホルダ（ 図1D）の入出力灌流ラインを接続します。 ERG増幅器に電極を接続します（上部電極は、アンプに地面/マイナス端子に接続）とアダプタを使用して、試料ホルダーの刺激/コントロールユニットを接続したり、生体内でどのに応じて刺激ユニットに加熱パッドをスライドさせERGシステムが使用されます。

3.レコーディング

1. in vivoでのシステムのソフトウェアを使用することにより、アンプと刺激の設定を行います。 300 Hzにフィルタリングを1と10 kHzの低域の間の値に取得頻度を設定します。ハイパスフィルタを使用しないでください。必要に応じてフィルタをノッチ60ヘルツ（またはヨーロッパでは50 Hz）を使用してください。
2. 光刺激とウィットのないレコードのベースラインH薄暗い刺激（ 例えば 、-35 dB以上0.3 MCDのSM ^-2の緑色光）は、電極と網膜の試料との間の良好な電気的接続をテストします。網膜の温度と機能が安定した状態に達するように、データ収集を開始する前に20分 - 10を待ちます。
   1. 特定の実験によれば、刺激パラメータを選択し、データ収集を開始します。 例えば、千のMCD SMまで0デシベルまでまたは0.1から-40から緑色の光を使用する^-2暗所視応答家族のために。 （ 図3を参照して、約1.3のCd SM ^-2 = 1デシベル） - （30 CDM ^-2 3）またはプローブフラッシュロッドが背景光によって抑制されなければならない明所録音で約2〜3対数単位明るく点滅を使用してください。
   2. しかし、正確な光強度値は、システム·キャリブレーションおよび実験条件に幾分依存する可能性があることを覚えておいてください。経験則として、スケール強度ダウン5による- 10倍の生体内と比較して、 レコーディング緑色光^17を使用して。 （市販アダプタシステムに含まれる）網膜上記開口を有するブラックカバーが試料ホルダに光散乱を減少させ、商業インビボ系の全体野球の両方によって網膜の均質と同じ刺激を容易にするために使用することができます。
      注：暗順応網膜から記録のために、典型的な実験の漂白剤、顔料のごくわずかな割合で使用したテスト点滅の強度がするようにRPE主導の再生の欠如は問題ではありません。また、以前にコーン色素再生がまだミュラー細胞の視覚サイクル²⁰を介して、単離された網膜中で行うことができることが示されています。
3. 実験は数時間に30分まで、典型的持続として、これらの変化は、技術的な問題を示している可能性があるため、実験中ベースラインドリフト、ノイズレベルと応答性を監視します。
   注：ノイズの増加または減少D応答振幅は、空気灌流または電極のチャネル内の気泡、低すぎる、または高温、液漏れ/流出または網膜の変位を示すことができます。

4.クリーニング

1. 灌流ラインから試料ホルダーを外し、それを開いて、ろ紙から網膜を洗い流します。電極を取り外し、蒸留水（エタノールを使用していない）でそれらをすすぎます。エタノールおよび/または蒸留水で（灌流チャネルを含む）試料ホルダーを清掃してください。 > 70％エタノールで慎重に同一平面灌流チューブ。
2. （洗剤は使用しないでください）​​蒸留水で灌流ボトルを洗浄します。エタノールはまた、ボトルを洗浄するために使用することができます。

結果

我々は、実験プロトコル上述の異なる標準灌流液（ 図2）を用いて、 図1に示しに従って、暗順応の野生型（WT）C57BL / 6マウスの網膜からフラッシュ応答を記録しました。応答波形と速度だけでなく、桿体の感度はエイムスの類似しているように見えた」とロックのメディア（ 図2AおよびB）。一方、HEPES緩衝リンガー液（重炭酸塩なしまたは5％CO _{2/95％O 2）}下での応答振幅が有意に小さかったです。また、これらの条件にb波の安定性が損なわれたことがわかりました。 40μMのAPB（DL-AP4）を追加すると、すべての3つのメディア（ 図2D-F）で効率的にポジティブb波を除去します。 b波の除去は、ミュラー細胞活性²¹に起因している大規模な低速負の波（ 図2D）を明らかにしました。 100を追加します＃956;バリウムのMは、ex vivo ERG信号（ 図2...

ディスカッション

ここではex vivoで ERGアダプタと一緒にin vivoでの ERGシステムのコンポーネントを使用して、2つの単離されたマウス網膜から同時に高品質のex vivoでの ERG記録を得るための重要なステップを示しています。本研究では、同じ溶液（いずれかエイムズ'、ロックのあるいはリンゲル）と動物の両方からの網膜を灌流が、薬物検査のために、別のソリューションの例で、それぞれの網膜を灌流することも可能です。高品質のデータを取得するための最も重要なステップは、高度な特注の試料ホルダを使用して、暗赤色（またはIR）の下で、すべてのサンプル調製手順を実行することにより、電磁ノイズ、網膜を注意深く解剖、安定した比較的速い灌流流れから遮蔽されています光。ここで説明する方法は、in vivoおよびex vivo ERG記録に実行するために、両方の網膜およびin vivoでの ERGのセットアップの二重使用をすぐに使用することができます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
In vivo ERGシステム	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
>In vivo ERGシステム	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
>Exvivoアダプター	OcuScience	Ex VIVO ERG アダプター	www.ocuscience.us/id107.html
解剖顕微鏡	ノースセントラルインスツルメンツ	ライカ M80	任意のブランド
>IRエミッタ	Opto Diode Corp.を使用できます。	OD-50L	www.optodiode.com
>Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	ミリタリーグレードの製品。
レッドフィルター	Rosco Laboratories	Roscolux #27 ミディアムレッド	IRシステムの代わりに使用できます
レッドヘッドライト	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
>Dumont Tweezers #5	WPI, Inc.	14101
カミソリの刃	電子顕微鏡 科学	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler トレド	AB54-S/FACT	任意のブランドを使用できます
>pHメーターと電極	ベックマン・コールター	pHI 350	任意のブランドを使用できます
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	任意のブランドを使用できます
KCl	Sigma-Aldrich	60129	任意のブランドを使用できます
>MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 Mソリューション
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	任意のブランドを使用できます
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	任意のブランドを使用できます
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6297	任意のブランドを使用できます
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	任意のブランドを使用できます
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	使用できます任意のブランド
DL-AP4	トクリスバイオサイエンス	101	任意のブランドを使用できます
コハク酸二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	224731	任意のブランドを使用できます
L-グルタミン酸	Sigma-Aldrich	G2834	任意のブランドを使用できます
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G7528	任意のブランドを使用できます
Leibovitz培地 L-15	Sigma-Aldrich	L4386	ブランドの
MEMビタミン	を使用できます Sigma-Aldrich	M6895
MEMアミノ酸	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2